1.简介
目前全球公众对人参、人参根和人参根茎的需求人参C.A.Meyer（五加科）正在迅速增加。人参在美国作为食品添加剂销售，因此不需要满足食品和药物管理局对药物的特定安全性和功效要求[1]. 人参中含有一种活性化学成分，称为人参皂苷（人参皂苷），据报道，人参的生物活性包括免疫增强、抗氧化和记忆增强、恢复生命活力、缓解疲劳、改善血液流动、，促进长寿[2,三,4]. 20(S公司)-人参皂苷Rg2(20(S公司)-G-Rg公司2;1,方案1)是一种著名的根和根茎的生物活性皂苷[5]和茎/叶[6,7]人参和红参[8]，它可以从天然资源中大量获得，例如人参现代药理学研究表明1表现出良好的抗心血管疾病活性[三,4,9,10,11,12]. 吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）研究被引入药物发现的早期阶段，而不是一系列策略，因为ADMET和药代动力学问题往往是临床试验中新药失效的原因。因此，研究1据报道1可在口服从茎/叶中提取的总皂苷后被吸收到体循环中人参[13]并在静脉注射个体20后消除(R（右）)-和20(S公司)-人参皂苷Rg2[14,15]老鼠。然而，到目前为止，它的新陈代谢命运仍然未知。因此，研究1是不可或缺的。
本研究的主要目的是调查在体外代谢命运1用大鼠肝微粒体处理以了解代谢物的分子结构多样性。由于其浓度较低，一些代谢物的鉴定是一个巨大的挑战。超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF/MS）[16,17,18]由于其高分辨率以及能够提供分子公式和精确分子质量的事实，已成为检测和识别可预测和不可预测代谢物的常规工具。为了识别可预测和不可预测的代谢物，本研究采用了基于高分辨率LC-MS数据的萃取离子色谱法（EIC）。通过广泛的光谱数据分析，我们成功鉴定了一种原型化合物和四种代谢物，包括一种新化合物，通过UPLC-Q-TOF/MS数据分析，成功鉴定了大鼠肝微粒体培养物中的七种其他代谢物。
代谢反应的作用，产生生物活性代谢物1，尚未明确定义。新陈代谢1在肝脏中可以反映生物活性途径，从而形成生物活性代谢产物。另一方面，沉默信息调节子二同源体1（SIRT1）是具有NAD的sirtuin家族成员+-依赖性脱乙酰酶活性[19]并调节各种细胞过程，如能量代谢、细胞周期进展[20]，肿瘤[20,21,22]和老化[23]. 此外，据报道，SIRT1的调节可能为靶向心血管危险因素提供新的治疗选择[24]. SIRT1正在成为治疗某些疾病的新疗法的重要靶点。人参被用作万灵药或促进长寿。进一步探索人参的抗衰老潜力[25,26]，SIRT1推广活动1使用SIRT1荧光活性测定试剂盒进行评估。在该试验中，白藜芦醇被用作阳性激活剂[27,28,29]烟酰胺被用作阳性抑制剂[30].
2.结果和讨论
尽管LC-MS技术已成为鉴定生物样品中代谢物的常规工具[16,17,18]，获得纯代谢物可靠化学结构信息的更精确方法是核磁共振实验，特别是将多个多维核磁共振谱结合起来进行共振分配。因此，表征1大鼠肝微粒体孵育分为三个步骤，包括（1）采用开放柱色谱法（CC）和反相半制备高效液相色谱法（RP-SP-HPLC）分离纯化代谢产物；（2） 通过广泛的光谱数据分析，并与参考标准品进行比较，以及匹配其保留时间（tR（右）); （3） 基于精确分子量（小数点后四位）和质谱初步表征微量代谢物n个碎片提及。
在优化ESI-MS分析代谢物时，四种参考标准人参皂苷，20(S公司)-G-Rg公司2, 20(R（右）)-G-Rg公司2，伪人参皂苷F11和20(R（右）)-伪人参皂苷F11在正离子和负离子模式下均检测到。与正模式相比，每种人参皂苷的质谱在负离子模式下显示出更低的基线噪声和更好的电离效应，这使得其在鉴定20(S公司)-G-Rg公司2.根据tR（右）对四种参考标准品的色谱行为和质谱进行了表征，为鉴定大鼠肝微粒体培养物中的代谢物奠定了基础。负MS/MS光谱由脱质子分子离子[M−H]获得−和[M−H]产物离子的质谱−表现出与糖苷（鼠李糖基，rha；吡喃葡萄糖基，glc）单元连续丢失相对应的裂解模式，直到形成米/秒391碎片离子[M−部分C17-侧链−H]−20的典型质谱和可能的碎片(S公司)-G-Rg公司2（A） 和伪人参皂苷F11（B） 如所示图S1结果，共确认了11种代谢物，其EIC如所示A–I。
20的典型基峰强度（BPI）色谱图(S公司)-G-Rg公司2代谢物。(一)所有代谢物的BPI；(B类)的主任工程师M1级,立方米,M4级,M（M）一和M（M）D类; (C类)的EICM（M）B类; (D类)的EIC平方米; (E类)的EICM（M）C类; (F类)的EICM（M）E类和M（M）F类; (G公司)的EICM（M）G公司; (H（H）)真实20的EIC(S公司)-G-Rg公司2; (我)真实20的EIC(R（右）)-伪人参皂苷F11.
2.1. 代谢物的鉴定M1级–立方米
20的新陈代谢(S公司)-G-Rg公司2(1)由其研究在体外用苯巴比妥钠（PB）预处理雄性大鼠的肝微粒体孵育。在优化的系统下[31]，丁醇（BuOH）提取物的代谢物1经过开放式硅胶CC和RP-SP-HPLC，得到三种代谢物M1级–立方米和母体化合物1。代谢物的结构如所示方案1通过光谱方法。原型的化学结构1[7],平方米和立方米通过广泛的核磁共振和质谱数据分析以及与参考标准的比较确定。平方米和立方米被明确认定为20人(R（右）)-G-Rg公司2[7]和伪人参皂苷F11[32]. 对于的核磁共振数据1和立方米看见补充信息表S1.
M1级被分离为白色无定形粉末+12.8 (c（c）0.185，甲醇）。其分子式被指定为C42H（H）72O（运行）14基于准分子离子峰[M+HCOOH−H]−在米/秒在负HR-ESI-MS和NMR光谱数据中为845.4896，比原型多一个氧原子1其红外光谱在3417和1075厘米处显示出羟基和醚键功能的最大吸收带−1分别是。为完成明确的分配1H-和13C-NMR信号(和)第页，共页M1级是由1H–1H COSY、HSQC、HMBC和NOESY光谱。
表1
1H-和13吡啶中的C-NMR数据-d日5(δ百万分之一)的苷元部分M1级和平方米
一.
| 不。 | M1（人参皂苷A） | M2（20(R（右）)-人参皂苷Rg2) |
|---|
| 1H（H）(J单位：Hz） | 13C类 | 1H（H）(J单位Hz） | 13C类 |
|---|
| 1α | 0.95（1H，m） | 39.8吨 | 0.95（1H，m） | 39.8吨 |
| 1β | 1.60（1H，m） | 1.60（1H，m） |
| 2α | 1.85（1H，m） | 27.9吨 | 1.85（1H，m） | 27.9吨 |
| 2β | 1.77（1H，m） | 1.77（1H，m） |
| 3β | 3.42（1H，dd，11.7，4.1） | 78.7天 | 3.44（1H，dd，11.5，4.1） | 78.8天 |
| 4 | – | 40.2秒 | – | 40.2秒 |
| 5α | 1.43（上半年，d，10.7） | 61.0天 | 1.44（1H，d，10.7） | 61.0天 |
| 6β | 4.64（1H、br dd、10.7、3.3） | 74.3天 | 4.65（1H、br dd、10.7、3.1） | 74.5天 |
| 7α | 1.96（1H，t，10.7） | 46.2吨 | 1.97（1H，t，10.7） | 46.2吨 |
| 7β | 2.29（上半年，日，10.7，3.1） | 2.30（1H，dd，10.7，3.1） |
| 8 | – | 41.3秒 | – | 41.3秒 |
| 9α | 1.48（1H，br d，10.9） | 49.9天 | 1.48（1H，br d，11.3） | 50.7天 |
| 10 | – | 39.5秒 | – | 39.5秒 |
| 11α | 2.09（1H，m） | 32.4吨 | 2.12（1H，m） | 32.4吨 |
| 11β | 1.50（1H，m） | 1.54（1H，m） |
| 12α | 3.93（1H，m） | 71.2天 | 3.93（1H，m） | 71.1天 |
| 13β | 1.92（1H，t，10.1） | 48.3天 | 2.01（1H，t，10.3） | 49.0天 |
| 14 | – | 51.8秒 | – | 51.9秒 |
| 15α | 1.46（1H，m） | 31.4吨 | 1.56（上氢，m） | 31.6吨 |
| 15β | 0.86（1H，m） | 0.93（1H，m） |
| 16α | 1.40（1H，m） | 26.9吨 | 1.83（1H，m） | 26.8吨 |
| 16β | 1.21（1H，m） | 1.56（1H，m） |
| 17α | 2.32（1H，m） | 50.7天 | 2.33（1H，m） | 49.9天 |
| 18β | 1.19（3H，s） | 17.3季度 | 1.19（3H，s） | 17.4季度 |
| 19β | 0.93（3小时，秒） | 17.8季度 | 0.94（3H，s） | 17.8克 |
| 20 | – | 73.1秒 | – | 73.2秒 |
| 21α | 1.29（3H，s） | 22.0季度 | 1.31（3H，s） | 22.9季度 |
| 第22页 | 1.74（1H，m） | 42.9吨 | 1.78（上氢，m） | 43.4吨 |
| 22亿 | 1.60（1H，m） | 1.68（1H，m） |
| 第23页 | 2.65（1H，m） | 22.8吨 | 2.54（1H，m） | 22.8吨 |
| 23亿 | 2.39（1H，m） | 2.46（1H，m） |
| 24 | 5.43（1H，t，7.5） | 128.2天 | 5.24（1H，t，6.8） | 126.2天 |
| 25 | – | 136.2秒 | – | 130.9秒 |
| 26 | 1.96（3小时） | 22.0季度 | 1.63（3H，s） | 26.0季度 |
| 27 | 4.44（1H，br d，12.4） | 61.0吨 | 1.58（3小时，秒） | 17.8季度 |
| 4.51（上氢，br d，12.4） |
| 28β | 2.07（3小时，秒） | 32.4平方米 | 2.07（3小时，秒） | 32.4平方米 |
| 29α | 1.30（3小时，秒） | 17.8季度 | 1.32（3H，s） | 17.9季度 |
| 30α | 0.91（3小时，秒） | 17.1克 | 0.93（3小时，秒） | 17.4季度 |
表2
1H-和13吡啶中的C-NMR数据-d日5(δ百万分之一)的糖基部分M1级和平方米
一.
| 不。 | M1（人参皂苷A） | M2（20(R（右）)-人参皂苷Rg2) |
|---|
| 1H（H）(J单位Hz） | 13C类 | 1H（H）(J单位Hz） | 13C类 |
|---|
| 6-甘氨酸 |
| 1′ | 5.21（1H，d，6.4） | 102.1天 | 5.23（上半年，d，6.8） | 102.1天 |
| 2′ | 4.34（1H，dd，9.1，6.4） | 79.6天 | 4.38（1H，dd，9.0，6.8） | 79.6天 |
| 3′ | 4.32（1H，dd，9.1，8.3） | 78.5天 | 4.36（1H，dd，9.0，8.4） | 78.6天 |
| 4′ | 4.16（1H，dd，9.0，8.2） | 72.8天 | 4.21（1H，dd，9.2，8.4） | 72.8天 |
| 5′ | 3.92（1H、br dd、8.2、5.6） | 78.6天 | 3.96（1H、br dd、8.4、5.6） | 78.5天 |
| 6英尺 | 4.35（1H，dd，11.5，5.6） | 63.3吨 | 4.38（1H，dd，11.5，5.6） | 63.3吨 |
| 6英尺b | 4.48（1H，dd，11.5，2.3） | 4.54（1H，dd，11.5，2.3） |
| 2-′Rha |
| 1′′ | 6.44（1H，brs） | 101.9天 | 6.45（1H，brs） | 101.9天 |
| 2′′ | 4.74（1H，br d，3.9） | 72.4天 | 4.80（上氢，br d，3.7） | 72.3天 |
| 3′′ | 4.63（1H，dd，9.6，3.9） | 72.6天 | 4.67（1H，dd，9.5，3.7） | 72.6天 |
| 4′′ | 4.31（1H，dd，9.6，2.2） | 74.4天 | 4.33（1H，dd，9.5，2.1） | 74.4天 |
| 5′′ | 4.93（1H，dd，9.5，6.2） | 69.6天 | 4.96（1H，dd，9.5，6.1） | 69.6天 |
| 6′′ | 1.74（上氢，d，6.2） | 18.9季度 | 1.75（1H，d，6.2） | 18.9季度 |
如中所示1和平方米，的1H-和13的C-NMR谱M1级显示了一种含有吡喃葡萄糖基和鼠李糖基部分的达玛烷型三萜[7]，除C-17侧链上的羟甲基而非甲基的信号外，其他信号相似。δ处的Me-26质子信号H（H）1.63（3H，s）英寸平方米向下场移动到δH（H）1.96（3H，s）M1级和H-24（δ）H（H）5.24（1H，t，J=6.8 Hz）平方米被向下移动到δH（H）5.43（1H，t，J=7.5 Hz）M1级。在13C-NMR谱，信号位于δC类C-27英寸为17.8平方米，替换为δ处的信号C类61.0英寸M1级表明平方米被羟甲基取代。分子式C42H（H）72O（运行）14第，页，共页M1级比1和平方米，这进一步证实了M1级是羟基甲基取代的产品1或平方米这一结论得到了H-24在δH（H）δ时为5.43和C-26C类22.0，C-27，δC类HMBC实验中为61.0(A） ●●●●。C-20的立体化学被指定为R（右），由于δ处的信号C类对于C-17，δ为50.7C类C-21和δ为22.0C类C-22为42.9[7]. δ之间的交叉峰也支持这一结论H（H）1.29（Me-21）和δH（H）1.92（H-13β）在二维NOESY实验中M1级(B） ●●●●。
HMBC键（从H到C，一)和NOESY(B类)相关性M1级.
此外，Me-26质子在δH（H）1.96和H-24，δH（H）5.43显示NOE相关性，而H-27在δH（H）δ时的4.44、4.51和H-24H（H）5.43在M1级表明双键M1级有一个Z轴-配置。考虑到上述所有数据，M1级被解释为6-O（运行）-α-我-鼠李糖基-（1→2）-β-d日-吡喃葡萄糖-达玛-24Z轴-烯-3β，6α，12β，20(R（右）)，27-戊醇，俗称人参皂苷A。据我们所知，这是首次报道M1级.
除上述三种代谢物外M1级–立方米，额外的代谢产物M（M）4在大鼠肝微粒体培养中1被认定为20人(R（右）)-伪人参皂苷F11[32]通过匹配t吨R（右）经验分子式和诊断碎片离子与真实样品的离子。
2.2. 代谢物的鉴定M（M）一–M（M）G公司
小鼠微粒体培养物的BuOH提取物1在甲醇中溶解，然后注入UPLC–Q-TOF/MS系统。典型的基峰强度（BPI）如所示A.共显示了11种代谢物。
M（M）一在2.15分钟时检测到。其分子式指定为C42H（H）72O（运行）14基于准分子离子峰[M−H]−在米/秒HR-ESI-MS中的799.4861，表示比原型化合物多一个氧原子1分子式与M1级.MS2光谱()显示碎片离子米/秒799.4861（C42H（H）71O（运行）14)【M−H】−，653.4339（C36H（H）61O（运行）10)[M−rha−H]−，491.3761（C30H（H）51O（运行）5)[M−glc−rha−H]−，473.3609（C30H（H）49O（运行）4)[M−glc−rha−H2O−H]−和391.2895（C24H（H）39O（运行）4)[M−glc−rha−H2氧-碳6H（H）10−H]−表明单氧反应发生在C17-侧链，一种可能由肝脏中CYP450依赖的末端羟化酶催化的反应[33]. 据报道，20(S公司)-型人参皂苷总是在20前洗脱(R（右）)-反相高效液相色谱法分析人参皂苷类型18立柱[34]. 因此，M（M）一暂定为20(S公司)-的差向异构体M1级即喹诺甙L11[35].
MS220的光谱(S公司)-G-Rg公司2,M1级–M4级和M（M）一–M（M）G公司.
M（M）B类在2.58分钟时检测到。其分子式指定为C42H（H）72O（运行）15基于准分子离子峰[M−H]−在米/秒HR–ESI-MS中815.4829，比原型化合物多两个氧原子1一个氧原子比M（M）一.MS2光谱()显示碎片离子米/秒815.4829（C42H（H）71O（运行）15)【M−H】−，669.4014（C36H（H）61O（运行）11)[M−rha−H]−，507.3840（C30H（H）51O（运行）6)[M–glc−rha−H]−，489.3142（C30H（H）49O（运行）5)[M−glc−rha−H2O−H]−和391.2902[M−glc−rha−H2氧-碳6H（H）10O−H]−表明C上发生了加氧反应17-侧链。已经发现C-23的羟基化反应比C-22的羟基化反应更容易[36]因此，M（M）B类初步鉴定为23-羟基喹苷L11.
M（M）C类在2.79分钟时检测到，分子式为C42H（H）70O（运行）14由HR-ESI-MS根据准分子离子峰[M−H]测定−在米/秒797.4703，比原型化合物多14Da1.MS2光谱()显示碎片离子米/秒797.4703（C42H（H）69O（运行）14)【M−H】−，651.4145（C36H（H）59O（运行）10)[M−rha−H]−，489.3840（C30H（H）49O（运行）5)[M−glc−rha−H]−，391.2903（C24H（H）39O（运行）4)[M−glc−rha−C6H（H）10O−H]−，表明单氧化反应发生在C末端17-中的侧链M（M）一并在C-22、C-23处脱水。因此M（M）C类暂定为6岁-O（运行）-α-我-鼠李糖基-（1→2）-β-d日-吡喃葡萄糖基-丹明-22,24-二烯-3β，6α，12β，20(S公司)，27-戊醇。
M（M）D类在4.29分钟时检测到，分子式为C42H（H）72O（运行）14通过HR-ESI-MS从准分子离子峰[M−H]−在米/秒799.4900，比原型多一个氧原子1.MS2光谱()显示碎片离子米/秒799.4900（摄氏度42H（H）71O（运行）14)【M−H】−，653.4318（C36H（H）61O（运行）10)[M−rha−H]−，491.3787（C30H（H）51O（运行）5)[M−glc−rha−H]−，391.2875（C24H（H）39O（运行）4)[M−glc−rha−C6H（H）12O−H]−表明单氧化反应发生在C17-可以在C-23处添加侧链和羟基[36]. 这一结论也得到了鉴定M（M）E类最后，M（M）D类暂定为6-O（运行）-α-我-鼠李糖基-（1→2）-β-d日-吡喃葡萄糖基达玛-24-烯-3β，6α，12β，20(S公司或R（右）)，23-戊醇。
M（M）E类在5.36分钟时检测到M（M）E类推导为C42H（H）70O（运行）13从它的准分子离子峰[M−H]−在米/秒HR-ESI-MS中的781.4763。发现质量比原型小2Da1.MS2光谱()显示碎片离子米/秒781.4763（C42H（H）69O（运行）13)【M−H】−，635.4201（C36H（H）59O（运行）9)[M−rha−H]−，473.3637（C30H（H）49O（运行）4)[M−glc−rha−H]−，391.2887（C24H（H）39O（运行）4)[M−glc−rha−C6H（H）10−H]−，建议M（M）E类是原型的脱氢衍生物1在C中17-侧链。因此M（M）E类确定为22,23-dehydro-20(S公司)-人参皂苷Rg2.它是一种脱水产品M（M）D类.
M（M）F类在5.65分钟洗脱。M的分子式F类被确定为C42H（H）70O（运行）13通过HR-ESI-MS显示准分子离子[M−H]−峰值在米/秒781.4760，其分子式与M（M）E类.MS2光谱()显示碎片离子米/秒781.4760（C42H（H）69O（运行）13)【M−H】−，635.4269（C36H（H）59O（运行）9)[M−rha−H]−，473.3679（C30H（H）49O（运行）4)[M−glc−rha−H]−，391.2853（C24H（H）39O（运行）4)[M−glc−rha−C6H（H）10−H]−和具有与相同的碎片离子M（M）E类.因为t吨R（右）属于M（M）F类比的长M（M）E类如中所示M（M）一行为M（M）F类结果是20分(R（右）)-差向异构体M（M）E类即22,23-dehydro-20(R（右）)-人参皂苷Rg2.
M（M）G公司在6.04 min用脱质子分子离子[M−H]洗脱−峰值在米/秒825.5034，对应C分子式44H（H）74O（运行）14.MS2光谱()显示碎片离子米/秒825.5034（C44H（H）7三O（运行）14)【M−H】−，783.4946（C42H（H）71O（运行）13)[M−Ac−H]−，637.4378（C36H（H）61O（运行）9)[M−Ac−rha−H]−，475.3834（C30H（H）51O（运行）4)[M−Ac−glc−rha−H]−，391.2824（C24H（H）39O（运行）4)[M−Ac−glc−rha−C6H（H）12−H]−.因为其质量比原型高42Da1，结构M（M）G公司被认为是原型的乙酰化衍生物1但乙酰基的位置仍不明确（苷元的C-20或葡萄糖基的C-6′）。
2.3. 代谢途径分析
本研究中确定的原型和相关代谢物提供了关于1在大鼠肝微粒体中。从代谢物特征的结果中，我们发现大多数1代谢物对应于氧化代谢物，它们是I期肝脏代谢物。部分代谢途径如方案1根据代谢物的化学多样性和肝微粒体中药物代谢的特性提出[37,38,39,40].
共有七种氧化代谢物(M1级,立方米,M4级、和M（M）一–M（M）D类)使用LC-ESI MS检测并表征其MS碎片模式n个其中M1级和立方米通过广泛的1D和2D核磁共振数据分析明确确定，以及M4级通过与真实样品进行比较而明确地确定。CYP450在不同的单氧反应中的特殊形式已经被描述过了[37,38,39,40]尤其是C的解理17-侧链可能被一种特殊的CYP450酶CYP11A1催化[37]. 有趣的是，所有的氧化修饰都发生在C17-dammarane苷元部分的侧链和所有代谢物具有相同的完整糖链。因为平方米在所有代谢物中都较高，似乎C的差向异构20-OH是1代谢生成平方米然后进行单氧化反应生成代谢物M1级，所以我们认为代谢途径是20(S公司)-人参皂苷Rg2首先转化为任何中间产物，然后再转化为20(R（右）)-人参皂苷Rg2细节需要进一步研究。同时，C中的乙烯基甲基也发生了单氧化反应17-原型侧链1生成M（M）一表明C中乙烯基甲基的羟基化17-侧链更容易。一种1涉及C-23产生代谢物M（M）D类然后脱水生成代谢物M（M）E类.平方米连续单氧和脱水形成M（M）F类类似于的步骤M（M）E类.
肝微粒体酶也能产生氧合反应[41]. 氧合反应1分别涉及C-23和C-27，生成代谢物M（M）B类然后脱水反应产生另一种代谢物，M（M）C类.
化学结构立方米明确确定为伪人参皂苷F11[32]通过广泛的1D和2D NMR数据分析（参见补充材料表S1)以及与参考标准的比较。它是一种著名的ocotillone型人参皂苷。C类17-原型的侧链双键1环氧化生成24,25环氧衍生物，随后催化水解形成24,25二羟基化合物（由于快速重排而无法检测到），然后环化形成立方米.平方米可能会经历类似的新陈代谢M4级.
从以上所有结果可以发现，已鉴定的单氧代谢产物的丰度反映了二氧代谢产物的数量，27羟基化在最大程度上发生，羟基化优选在C-25发生，而不是在C-23发生，此外还有少量代谢产物M（M）C类,M（M）E类和M（M）F类与共轭双键形成体系。
2.4. 20（S）-G-Rg的生物活化2通过微粒体代谢合成其代谢物
人参已有3000多年的历史，人们相信它是一种万灵药，可以促进长寿。如何控制衰老和长寿一直是一个备受关注的话题。SIRT1激活剂被认为可以延长寿命[42,43]. 据报道，人参皂苷Rb1[44]，卢比[45]，Rh三[46], 20(S公司)-人参皂苷Rg三[47,48], 6α,20(S公司)-二羟基达玛-3,12-二酮-24-烯，6α，20(S公司),24(S公司)-三羟基达玛-3,12-二酮-25-烯，6α，20(S公司)，25-三羟基达玛-3,12-二酮-23-烯，达玛-20（22），24-二烯-3β，6α，12β-三醇[48]和红参提取物[49]显示出作为SIRT1激活剂的潜力。然而，尚不清楚是否1作为SIRT1激活剂参与。研究1其代谢产物通过微粒体代谢，SIRT1促进活性1并使用SIRT1荧光活性测定试剂盒对其所选代谢物进行评估[47,50,51,52,53]，这是一个著名的抗衰老评估模型。结果如所示。根据试剂盒说明书提供的方案，检测化合物的浓度为10和20µM。原型1及其代谢物M1级,立方米和M4级在10µM和20µM浓度下，可以以浓度依赖的方式刺激SIRT1活性，表明它们是潜在的SIRT1活化剂。代谢物M1级在20µM的浓度下刺激SIRT1活性，与1.代谢物立方米和M4级显示出最强的刺激作用，高于1与用作阳性对照SIRT1激活剂的白藜芦醇相当[27,28,29]. 这些结果表明，肝微粒体酶依赖性代谢可能代表了一种生物活性途径，它改变了肝细胞的生物活性1.代谢转化可能对1，以及1延长寿命可能是由于其对SIRT1通路的激活。
20的影响(S公司)-G-Rg公司2（S-Rg2)及其代谢物M1级,平方米,立方米,M4级SIRT1活动。RES（白藜芦醇，10μM）用作阳性激活剂，NTA（烟酰胺，10μM）用作阳性抑制剂。在所有测试中，测试化合物均溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，最终DMSO浓度为0.1%(v（v）/v（v）). *第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页在三个单独的实验中，与DMSO（对照）组相比<0.001。#
第页< 0.05,##
第页与S-Rg相比<0.012分组进行三个单独的实验。
这些优越的利益是否真的会转化为人类需要进一步研究。由于本研究中可获得的单个化合物数量有限，代谢物M一–百万D类无法分析SIRT1活性。
3.实验段
3.1. 材料
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）、还原烟酰胺腺苷二核苷酸（NADH）、葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PDH）购自西格玛化学公司（美国密苏里州圣路易斯）。苯巴比妥钠（PB）购自北京大学第三医院（中国北京）。LC-MS级乙腈（MeCN）和甲醇（MeOH）购自J.T.Baker（美国新泽西州菲利普斯堡），LC-MS等级甲酸购自Fisher-Science（美国新日本州费尔劳恩）。超纯水（H2O） 在我们的实验室中通过Milli-Q系统（Millipore，Billerica，MA，USA）制备。其他试剂为分析级试剂。
20(S公司)-G-Rg公司2(1)和20(R（右）)-G-Rg公司2从人参如前几篇论文所述[6,7]. 伪人参皂苷F参考标准品11从成都必达生物科技有限公司（中国成都）和20(R（右）)-假人参皂苷F11从美国红参中分离纯化并发表在参考文献中[31]是吉林大学（中国长春）边疆医学研究所李平雅教授赠送的礼物。
使用甲醇作为溶剂，在Autopol III旋光仪（Rudolph Research Analytical，Flanders，NJ，USA）上测量旋光度。使用KBr磁盘在Nexus-470 FT-IR光谱仪（美国威斯康星州麦迪逊Thermo Nicolet公司）上记录红外（IR）光谱。在API QSTAR（Applied Biosystems/MDS Sciex.，Foster City，CA，USA）上记录ESI-TOF-MS的质谱，在Waters Xevo G2 Q-TOF质谱仪上记录HR-ESI-MS的质谱。在Bruker AVANCE III 400光谱仪（400 MHz，用于1H和100 MHz13C类；Bruker BioSpin AG Facilities，Fällanden，Switzerland），以四甲基硅烷为内标物和吡啶-d日5（第页-d日5)作为溶剂。RP-SP-HPLC在北京CXTH 3000系统（中国北京创信通恒科技有限公司）上进行，该系统配有两个P3050泵、UV3000紫外可见检测器、A1359液体处理器、Daisogel C18柱（205 mm×30 mm，10µm），所有紫外检测设置在203 nm，流速为15 mL/min。以硅胶（200–300目；中国青岛海洋化工有限公司）为固定相进行CC分离，并在硅胶GF上进行薄层色谱（TLC）254平板（默克、达姆施塔特、德国）。
3.2. 大鼠肝微粒体的制备
雄性Sprague-Dawley大鼠体重200-220克，由北京大学卫生科学中心实验动物中心（中国北京）提供。实验开始前，将大鼠饲养在温度为22±1°C、相对湿度为60%±5%的受控饲养室中。他们被喂食标准实验室的水随意实验前禁食3天。所有实验程序均由北京大学动物护理伦理委员会（编号：LA2014162）批准，并根据欧洲共同体实验动物使用指南进行。为了诱导细胞色素P450酶（CYP450），给大鼠腹腔注射生理盐水中的PB，单剂量为60 mg/kg体重，并在治疗后第3天处死。他们的肝脏被迅速取出，然后用冰镇的10 mM磷酸钾缓冲液（PPS；pH 7.4）清洗，并保持冰镇。使用F6/10超细均质机（中国上海福禄考设备）将肝脏切片并用四体积PPS（pH 7.4）彻底均质，然后在12500℃下离心克使用GL-20B离心机（Anke设备，中国上海）在4°C下培养15分钟，以产生上清液。将上清液转移到超速离心管中，然后在105000下离心克使用LB-80M超离心机在4°C下保持65分钟（贝克曼仪器公司，加利福尼亚州富勒顿，美国）。将微粒体颗粒重新悬浮在50 mM PPS（pH 7.4）中。微粒体蛋白的量按照Lowry-Folin方法测定[54]. CYP450浓度按照参考文献所述进行测定[55]. 发现大鼠肝微粒体（RLM）每毫克蛋白质含有1.09 nM（18.55 mg蛋白质/mL）CYP450。
3.3. 20（S）-G-Rg2大鼠肝微粒体的代谢
在优化的系统下[31]，完整的培养系统（最终体积，2000 mL）包含RLM（高达2.0 mg/mL），100 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4），20(S公司)-G-Rg公司20.15 mg/mL，以及由10.0 mM G-6-P、1.0 mM NADP、0.5 mM NADH、1.0 IU/mL的G-6-PDH和4.0 mM MgCl组成的NADPH生成系统2RLM和20之后(S公司)-G-Rg公司2预培养5分钟，通过添加NADPH生成系统开始反应。在Dubnoff培养箱中，在37°C下连续振荡（100rpm）培养120分钟。通过添加冰镇环己烷（500 mL）终止反应。去除环己烷层后，用等体积的BuOH将水层萃取六次。合并BuOH提取物，然后在真空下通过蒸发浓缩，得到22.85 g残渣。
3.4. 代谢物的分离和纯化
在硅胶开放柱上对上述残留物（22 g）进行色谱分析，用氯仿-甲醇（10:1至1:1）梯度洗脱，得到4个组分（Fr.1–Fr.4）。通过RP-SP-HPLC用MeCN–H洗脱进一步分离Fr.2（12.22 g）2O（35:65）得到3个子组分（Fr.2.1–Fr.2.3）。通过RP-SP-HPLC用MeCN–H洗脱纯化Fr.1（4.76 g）2O（35:65）生成原型20(S公司)-G-Rg公司2（698 mg，保留时间(t吨R（右）)=27分钟）和平方米（23毫克，t吨R（右）=29分钟）。通过RP-SP-HPLC用MeCN–H洗脱进一步纯化Fr.3（5.32 g）2O（35:65）给予M1级（8毫克，t吨R（右）=8分钟）和立方米（12毫克，t吨R（右）=19分钟）。
人参皂苷A(M1级; 6-O（运行）-α-我-鼠李糖基-（1→2）-β-d日-吡喃葡萄糖基-dammar-24Z轴-烯-3β，6α，12β，20(R（右）)，27-戊醇）：白色无定形粉末；+12.8 (c（c）0.185，甲醇）；IR（千比尔）ν最大值：3417293516431462138411291075104812厘米−1;1氢核磁共振（400 MHz，py-d日5)和13C-NMR（100 MHz，py-d日5)数据参见; ESI-TOF-MS系统米/秒799.56[M−H]−，845.60[M+HCOOH−H]−; HR-ESI-MS公司米/秒845.4896[米+小时-小时]−（针对C计算43H（H）73O（运行）16, 845.4899).
3.5. 基于SIRT1-NAD/NADH酶的分析
SIRT1荧光药物发现试剂盒购自Enzo Life Sciences Inc.（Farmingdale，NY，USA）。根据试剂盒说明书提供的方案进行分析。SIRT1酶反应在半体积96孔微孔板（Corning Costar）中进行，每孔50μL®#400012; 剑桥，马萨诸塞州，美国）。SIRT1反应溶液包括0.02 U/μL酶，在SIRT1分析缓冲液中加入或不加入试验化合物。将酶复合物混合物和分析缓冲液（25μL）在室温下培养5分钟。反应开始时添加25μL含有500μM NAD的溶液+和100μM Fluor de Lys-SIRT1。在室温下培养45分钟后，通过在HDAC分析缓冲液中添加50μL Fluor de Lys Developer II和2 mM烟酰胺来终止反应。培养30分钟后，在添加50μL SIRT1分析缓冲液后，使用SpectraMax GEMNI XPS微孔板阅读器（美国加利福尼亚州桑尼维尔市分子器件公司），使用360 nm的激发波长和460 nm的发射波长测量反应溶液的荧光。阳性对照组和阴性对照组分别与二甲基亚砜（DMSO）反应或不加酶反应。
3.6. 色谱和质谱条件
色谱分析由安捷伦1290 UPLC系统（安捷伦科技，德国瓦尔德布隆）进行，该系统配备有二元泵、在线真空脱气器、自动进样器和恒温控制柱室。使用安捷伦ZORBAX RRHD Eclipse Plus C进行色谱分离18连接到Phenomenex Security Guard的立柱（100 mm×3 mm，1.8µm）™ULTRA墨盒。流动相由H组成2O（A）和MeCN（B），使用20%–30%B的梯度洗脱，0–2分钟；30%-90%B，3–18分钟。流速为0.8 mL/min，分流比为1:1。检测波长设置为203 nm，温度设置为45°C。注射体积为1µL。
检测由配备安捷伦喷气流（AJS）ESI源的安捷伦Q-TOF 6540执行，并使用安捷伦MassHunter工作站数据采集软件收集数据。仪器在正负离子模式下运行。MS参数设置如下：在负模式下，气体温度：300°C，气体流量：5L/min，喷雾器压力：35psi，鞘气温度：400°C，鞘气流量：12L/min，毛细管电压：3500V，喷嘴电压：1500V，碎片电压：280V，两次碰撞能量电压：40V和60V。采用内部参考物（嘌呤和HP-0921）实时修改测量质量，负离子模式下的参考质量为米/秒119.0363和1033.9881。质谱仪的全扫描范围为米/秒MS和MS/MS为100–1700。
3.7. 统计分析
所有实验结果均以平均值±SD表示。学生的t吨-该试验用于不同治疗组和化合物之间的比较。当第页< 0.05.
