ASXL2调节小鼠造血，其缺乏促进髓系扩张

外显子测序和体细胞变异发现

使用Covaris仪器剪切DNA，并在2100生物分析仪上进行评估。如前所述进行文库制备和外显子组测序。²⁹对于整个外显子序列，根据制造商的说明，使用SureSelect Human All Exon 50Mb试剂盒（Agilent）捕获DNA。对于目标捕获库，使用了安捷伦的SureSelect XT2目标富集系统进行Illumina多重测序。RNA诱饵被设计用来捕获530个基因的外显子(在线补充表S1)和文库在HiSeq 2000（Illumina）上测序。

使用带有默认参数的bwa-mem对准器，将100 bp配对end读数与人类参考基因组（参考构建：hg19）对齐。用sam-blaster标记PCR重复读数。³⁰根据GTAK最佳实践进一步处理产生的BAM文件，包括INDEL重新校准和基础质量重新校准(https://software.broadinstitute.org/gatk/best-practic-tices/bp_3step.php？case=GermShortWGS)。使用Varscan2体细胞命令检测体细胞变异。³¹使用processSomatic命令处理原始变体P（P）-值设置为0.05以获得高置信度变体。每个脚本使用fpFilter对变体进行进一步处理，以消除潜在的假阳性(https://github.com/ckandoth/variant-filter网站)。使用Variant Effect Predictor对结果变体进行注释，并根据dbSNP和ExAC中的种系变体进行过滤，同时保留有害的和具有临床意义的变体。³²如前所述，对于没有生殖系对照的样本，使用MuTect调用来自AML缓解样本内部队列的正常对照组。^29，33使用maftools Bioconductor包绘制了Oncoplot。³⁴使用PCR扩增和Sanger测序验证了全外显子组测序的所有体细胞突变和靶向外显子组测序报告的约90%的突变。

老鼠

老鼠Asxl2型基因陷阱等位基因[在本研究中称为敲除（KO）等位基因]已在前面描述过。²⁴ Asxl2型杂合KO小鼠维持在C57BL/6J（B6）和129Sv（129）遗传背景上。Asxl2型所有实验中使用的纯合子空白小鼠[和相应的野生型（WT）对照]是通过杂交获得的B6×129 F1Asxl2型杂合子B6和129只小鼠。小鼠群体被安置在新加坡国立大学（NUS）比较医学中心的动物设施中。所有小鼠实验均获得新加坡国立大学动物护理和使用委员会的批准。

流式细胞术

在FACS LSR II流式细胞仪（BD Biosciences）上采集细胞之前，将细胞与荧光结合抗体在冰上培养30分钟，清洗并在SYTOX Blue Dead Cell Stain（ThermoFisher Scientific）中重新悬浮。在FACSAria细胞分选机（BD Biosciences）上进行细胞分选，并使用FACSDIVA软件（BD bioscience）分析数据。请参阅在线补充表S2用于流式细胞术染色的抗体列表。

统计分析

所有统计分析均使用GraphPad Prism 7软件进行。

造血功能受损Asxl2型-缺陷小鼠

我们的RT-PCR分析表明Asxl2型在多种小鼠造血细胞类型中表达(在线补充图S4A)。为了研究ASXL2在稳态造血中的生理作用，我们使用基因捕捉小鼠（称为Asxl2型KO小鼠）。²⁴据报道，²⁴ Asxl2型与WT小鼠相比，KO小鼠的寿命显著缩短(在线补充图S4B)。我们观察到Asxl2型骨髓、脾脏和胸腺中的转录物和蛋白质水平Asxl2型KO小鼠与WT小鼠的比较(在线补充图S5A-F)，而Asxl1型未受影响(在线补充图S5G-I)。我们将WT和KO小鼠的骨髓细胞在骨髓分化促进条件下培养两周，并观察到CD11b的比例增加⁺伴随Lin减少的细胞^负极配套元件⁺培养物中的细胞Asxl2型-BM缺乏，提示髓系分化改变(在线补充图S6A和B类)。此外，在重新镀膜分析中，我们观察到Asxl2型与WT细胞相比，KO-BM细胞生成髓系集落(在线补充图S6C).

初步了解ASXL2缺陷对造血的影响体内，我们定期分析来自Asxl2型KO和WT小鼠从八周龄开始。我们观察到，患者PB中白细胞计数随年龄增长而增加Asxl2型-缺陷小鼠，而WT小鼠的数量不变(图2A)。这与患者外周血红细胞（RBC）计数和血红蛋白减少有关Asxl2型KO小鼠年龄增长(在线补充图S7)。这一观察结果表明Asxl2型KO小鼠，因此我们系统地研究了>1岁小鼠的造血发育。流式细胞术分析这些小鼠的血白细胞显示出较高比例的髓细胞（CD11b⁺)淋巴细胞（CD19）比例降低⁺和CD3⁺)KO小鼠的细胞(图2B和在线补充图S8A)。旧Asxl2型KO小鼠表现出广泛的脾肿大(图2C和D)与显著的骨髓增生相关，明显表现为CD11b的频率增加⁺细胞与髓过氧化物酶阳性细胞(图2E和在线补充图S8B和C类)。CD11b的绝对数⁺与WT小鼠相比，KO小鼠的骨髓细胞显著增加（20倍），而脾脏中的淋巴细胞数量增加了2倍(图2F)。与WT小鼠相比，KO小鼠的脾脏组织学检查显示其正常结构丢失(数据未显示)。此外，KO脾脏髓外造血明显表现为总Lin的比例和数量增加^负极配套元件⁺和林^负极配套元件⁺Sca1类⁺（LSK）细胞(图2G和在线补充图S9A-D)红系祖细胞（proE、EryA和EryB群体）的频率也明显较高(图2H和在线补充图S9E)。我们还检测到老年KO小鼠外周血中干/祖细胞的频率显著增加(图2G和在线补充图S9F).

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图2

骨髓增生和髓外造血Asxl2型-缺陷小鼠。（A） 8-10周龄野生型（WT）和Asxl2型-缺陷小鼠。晶须从最小值延伸到最大值。（B） B细胞比例（CD19⁺)、T细胞（CD3⁺)和髓细胞（CD11b⁺)1岁以上WT和Asxl2型使用流式细胞术测定敲除（KO）小鼠（B和T细胞，n=3；髓系细胞，n=11）。（C） 幼年（11周龄）和老年（>1岁）WT和Asxl2型KO小鼠。（D） 1岁以上小鼠脾脏中的总白细胞计数。（E和F）老WT和KO小鼠脾脏中淋巴和髓细胞的频率（E）和绝对数（F）。脾细胞的流式细胞仪分析与（B）相似（n=12-13）。（G） 老年WT和KO小鼠脾脏和外周血中LSK细胞的频率。（H） 在来自老年WT和KO小鼠（n=10）的脾脏的流式细胞术分析（用CD71和TER119抗体染色）中检测到的红系祖细胞的比例。条形代表平均值±平均值标准误差*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001, ****P（P）<0.0001，ns：不显著。

对幼年KO小鼠（8-14周龄）脾脏的平行分析显示，脾脏大小略有增加，LSK细胞的比例和数量有增加的趋势(在线补充图S10A-C)。髓细胞（CD11b）频率增加的倾向⁺)在幼年KO小鼠的脾脏中也发现了红系祖细胞(在线补充图S10D和E类)。这表明幼年小鼠出现髓外造血，表现为随着小鼠年龄增长，髓细胞和红细胞明显扩张。

ASXL2缺乏导致造血干细胞分化和功能缺陷

ASXL2缺乏导致老年小鼠骨骼变白，骨髓细胞减少(图3A和B)。值得注意的是，老BMAsxl2型与WT小鼠相比，KO小鼠具有更高的LSK细胞频率和绝对数量(图3C和在线补充图S11A和B类)。LT-HSC的比例（CD34^负极Flt3型^负极LSK）、ST-HSC（CD34⁺飞行高度3^负极LSK）和MPP（CD34⁺飞行高度3⁺LSK）在LSK隔间内基本上没有改变(在线补充图S11C)尽管这些亚群的绝对数量在老年KO小鼠中总体上有所增加(在线补充图S11D和E类)。我们还观察到年轻KO小鼠的BM细胞减少；虽然LSK细胞的比例没有显著改变，但LT-HSC的频率和绝对数量明显较高，表明HSC频率维持的早期缺陷(在线补充图S11F-J).体内BrdU掺入试验发现BrdU的频率明显较高⁺骨髓中的LSK细胞Asxl2型KO小鼠，表明缺乏ASXL2的干/祖细胞循环增加(图3D)。这些结果表明，在稳态造血过程中，ASXL2是维持造血干细胞数量和自我更新所必需的。

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图3。

ASXL2缺乏扰乱造血干细胞（HSCs）的频率和功能。（A）来自>1岁野生型（WT）和Asxl2型敲除（KO）小鼠。（B） 老年WT和Asxl2型KO小鼠。（C） 老年小鼠骨髓中LSK细胞的比例（n=14）。（D） BrdU频率⁺10-20周龄WT和Asxl2型缺陷小鼠（n=5）。（E） 大于1岁的WT和KO小鼠BM中CMP、GMP和MEP的比例（n=12）。（F） 红系前体细胞的频率（proE:CD71⁺TER119（终端119）^洛，EryA:CD71⁺TER119（终端119）⁺金融稳定委员会^你好，EryB:CD71⁺TER119（终端119）⁺金融稳定委员会^洛和EryC:CD71^负极TER119（终端119）⁺金融稳定委员会^洛)大于1岁WT的BM和Asxl2型KO小鼠（n=8）。（G-J）竞争性再生试验：在受体小鼠中注射4000（黑圈）或2000（灰圈）LSK细胞，以及供体衍生细胞的比例（CD45.2⁺)分别于移植后4、8、12和16周检测外周血。WT和Asxl2型KO LSK细胞重建B细胞（CD19⁺)（G）、T细胞（CD3⁺)（H）、粒细胞（CD11b⁺第1组⁺)、（I）和单核细胞（CD11b⁺第1组^负极80层/四层⁺)（J）用流式细胞仪进行分析。条形代表平均值±平均值标准误差*P（P）<0.05, ***P（P）<0.001, ****P（P）<0.0001，ns：不显著。

流式细胞术分析也显示常见髓系前体细胞的比例和数量下降（CMP；Lin^负极配套元件⁺Sca1类^负极CD34型⁺FcγRII/III^洛)粒细胞-单核细胞前体（GMP；Lin^负极配套元件⁺Sca1类^负极CD34型⁺FcγRII/III^你好)1岁以上Asxl2型KO小鼠(图3E和在线补充图S12A和B类)。此外，在老年KO小鼠中发现红细胞前体的频率显著降低(图3F和在线补充图S12C)表明红细胞生成受损。在年轻KO小鼠的BM中，红系前体以及CMP和GMP种群的减少也很明显，这意味着由于ASXL2缺乏，红系和髓系分化缺陷的早期开始(在线补充图S12D-F).

此外，多谱系重建能力Asxl2型-在竞争性再填充试验中评估HSC缺陷。与WT细胞相比，ASXL2缺陷导致淋巴系（B细胞和T细胞）重建不良(图3G和H)。移植了Asxl2型-LSK细胞缺陷(图3I)而供体衍生单核细胞的比例与移植WT细胞的受体相似(图3J)。这些重新填充分析表明，ASXL2对分化为包括淋巴系在内的多种造血谱系至关重要，这促使我们研究淋巴系在造血干细胞中的发育Asxl2型KO小鼠。

缺乏ASXL2的小鼠胸腺生成受损

胸腺大小和细胞数显著减少是>1岁儿童的一贯特征Asxl2型KO小鼠与WT小鼠的比较(图4A)。流式细胞术分析显示CD4显著减少⁺CD8（CD8）⁺双阳性（DP）细胞和伴随的CD4比例和数量的增加^负极CD8（CD8）^负极胸腺中的双阴性（DN）细胞Asxl2型KO小鼠(图4B和C和在线补充图S13A)。在DN隔间内，DN1（CD44）的比例⁺CD25型^负极)亚群没有变化，但DN2（CD44）的比例显著降低⁺CD25型⁺)和DN3（CD44^负极CD25型⁺)亚群，表明早期胸腺细胞分化部分受阻(图4D和E)。KO小鼠胸腺中的大量DN细胞主要由CD25组成^负极DN1和DN4闸门中的电池(图4D和在线补充图S13B)。进一步的鉴定表明，DN栅极中的绝大多数细胞是CD19⁺（占胸腺残留造血细胞总数的40%），CD11b的频率和数量⁺与WT小鼠相比，KO小鼠胸腺中的髓细胞也显著增加(图4F和G和在线补充图S13C-F).

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图4。

ASXL2对正常胸腺细胞成熟至关重要。（A） 1岁以上野生型（WT）和Asxl2型敲除（KO）小鼠。（B） 典型的FACS图描述了DN（CD4）的比例^负极CD8（CD8）^负极)、DP（CD4⁺CD8（CD8）⁺)，CD4⁺单个阳性（SP）和CD8⁺老WT胸腺中的SP细胞和Asxl2型KO小鼠。（C） DP、DN、CD4的频率⁺SP和CD8⁺旧WT中的SP种群（n=17）和Asxl2型KO（n=18）小鼠。（D） FACS图显示了老年小鼠胸腺中DN群体中CD44和CD25表面表达的代表性流式细胞术染色。（E） DN1（CD44）的比例⁺CD25型^负极DN），DN2（CD44⁺CD25型⁺DN），DN3（CD44^负极CD25型⁺DN）和DN4（CD44^负极CD25型^负极老年WT和KO小鼠胸腺DN隔间内的亚群。（F和G）髓系细胞（CD11b）的频率⁺)（F）和B细胞（CD19⁺)（G）在大于1岁的WT和KO小鼠的胸腺中（n=5-7）。数据表示为平均值±平均值标准误差***P（P）<0.001, ****P（P）<0.0001.

年轻Asxl2型KO小鼠表现出胸腺细胞减少，但与>1岁的小鼠相比，对主要胸腺隔室的影响不太明显(在线补充图S13G-I)。这些发现表明，ASXL2对维持小鼠正常胸腺生成至关重要，其缺乏会导致胸腺细胞成熟的进行性损害，表现为从DN到DP阶段的部分阻滞，以及老年小鼠胸腺中髓样细胞和B细胞的积聚。

B细胞发育缺陷Asxl2型基因剔除小鼠

我们还通过检测几种表面抗原的表达来检测ASXL2缺陷对骨髓中B细胞发育的影响，这些表面抗原定义了B细胞成熟的推进阶段。当年轻人Asxl2型KO小鼠在B细胞淋巴细胞生成过程中表现出大量保守的亚群，成熟B细胞（CD43）的比例显著下降^负极免疫球蛋白M⁺B220型^你好)与WT小鼠进行比较(在线补充图S14)。然而，老年KO小鼠的BM显示proB（CD43）的频率和绝对数量显著降低⁺B220型⁺)，前B（CD43^负极免疫球蛋白M^负极B220型⁺)，未成熟B（CD43^负极免疫球蛋白M⁺第220页⁺)和成熟的B细胞(图5A和B)表明B细胞发育的年龄依赖性缺乏。使用之前提出的方案进一步分离proB细胞，³⁶显示CD24的比例较低^负极业务流程1^负极（分数A）和CD24⁺业务流程1^负极老年人的（B组分）proB细胞Asxl2型KO小鼠(图5A和B)证明B细胞成熟部分受阻。

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图5。

B细胞淋巴细胞生成受损Asxl2型-缺陷小鼠。（A和B）>1岁WT和Asxl2型KO小鼠（n=4-6）。探针B:CD43⁺B220型⁺，前B:CD43^负极第220页⁺免疫球蛋白M^负极，未成熟B（Imm.B）：CD43^负极B220型⁺免疫球蛋白M⁺，成熟B（物质B）：CD43^负极B220型^你好免疫球蛋白M⁺，分数A（Fr.A）：CD24^负极业务流程1^负极原B细胞，B组分（Fr.B）：CD24⁺业务流程1^负极原B细胞，C组分（Fr.C）：CD24⁺业务流程1⁺proB细胞。数据表示为平均值±平均值标准误差*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001，ns：不显著。

ASXL2在造血中的细胞内在作用

为了测试ASXL2在造血发育中的细胞自主功能，我们用WT或Asxl2型一年后对KO BM细胞进行造血室分析。我们观察到受体小鼠移植了Asxl2型KO-BM细胞在外周血中的白细胞计数往往较高(图6A)，类似于在KO小鼠中观察到的WBC的年龄依赖性增加(图2A)。我们还注意到移植了Asxl2型KO BM与移植WT BM的比较(图6B和C)。脾脏Asxl2型KO-BM受体扩大，髓系细胞比例升高(图6D和E)。此外，我们的分析还表明，用Asxl2型KO-BM细胞与WT细胞的比较(图6F)与老年人的表型相似Asxl2型KO小鼠。总的来说，受体小鼠重现了老年人的造血功能Asxl2型KO小鼠，提示ASXL2具有造血细胞固有功能。

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图6。

细胞固有效应Asxl2型淋巴和髓系缺陷。用野生型（WT）或Asxl2型一年后对敲除（KO）骨髓（BM）细胞进行分析。（A） 受体小鼠外周血中的白细胞数量。（B） 受体小鼠的胸腺细胞数量。（C） 供体或衍生的比例（CD45.2⁺)DN、DP、CD4⁺SP和CD8⁺受体小鼠胸腺中的SP细胞。（D） 脾细胞。（E） CD45.2的百分比⁺B、 移植WT或KO细胞的小鼠脾脏中的T细胞和髓细胞。（F） 受体小鼠脾脏中红系前体的频率。条形代表平均值±平均值标准误差*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001, ****P（P）<0.0001.

我们要感谢NUS比较医学的工作人员在小鼠维护和实验方面的支持。我们还要感谢新加坡CSI FACS设施的专家帮助和支持。我们还感谢新加坡CSI的Motomi Osato博士提供试剂，以及Maya Jeitany博士对手稿的批判性阅读和有用的讨论的帮助。我们感谢梅勒梅家族和鲁本·叶鲁沙尔米的慷慨支持。