睾丸中蛋白磷酸酶1调节因子NIPP1的缺失导致组蛋白甲基转移酶EZH2的过度磷酸化和降解

摘要

介绍

生殖细胞出生后的增殖和分化受表观遗传学控制，主要通过DNA甲基化和共价组蛋白修饰(1,–三). 这意味着对DNA和组蛋白修饰酶的浓度、染色质靶向性和催化活性进行严格调控。生后睾丸生殖细胞自我更新和分化的关键表观遗传调控因子仍不明确(1,–4). 一个显著的例外是Polycomb抑制复合物2（PRC2），它对男性生殖细胞的维持至关重要(5,6). PRC2复合物有助于Polycomb组（PcG）的转录沉默^三控制多能性、细胞增殖和分化的靶基因(7,8). EZH2（zeste同源物2的增强子）是在Lys-27（H3K27me2/3）上PRC2复合物和二/三甲基化组蛋白H3的催化亚单位。非催化性PRC2核心成分包括SUZ12（zeste同源物12的抑制因子）、EED（胚胎外胚层发育）和RBAP48（视网膜母细胞瘤相关蛋白48 kDa），它们都通过EZH2促进甲基化。PRC2抑制PcG靶点的转录，主要是因为沉积的H3K27me3阻碍ATP依赖的染色质重塑复合物和RNA聚合酶II的募集(7,–9).

PRC2介导的基因沉默受细胞周期素依赖性激酶1/2（CDK1/2）和蛋白磷酸酶1（PP1）的拮抗性调节，后者在Thr-345、Thr-416和Thr-487（本文中使用的小鼠残基）磷酸化EZH2(10,–13). Thr-345的磷酸化增加了EZH2对染色质的靶向性，导致靶位点H3K27二/三甲基化增强(10,11). Thr-487的EZH2磷酸化和Thr-345的长时间磷酸化与有丝分裂后期的蛋白酶体降解有关(14). 据报道，Thr-487磷酸化破坏了EZH2与其他PRC2成分的相互作用(15)，但这不是一个普遍的发现(11). 总之，游离EZH2被SCF-型E3-泛素连接酶β-TrCP（FBXW1）泛素化，特别是当它也被Jak2在Tyr-641磷酸化时，导致其蛋白酶体降解(16). 最后，CDK介导的EZH2在Thr-416的磷酸化为NIPP1（PP1的核抑制剂）创造了一个对接位点，该位点通过PRC2相关的PP1调节CDK位点的去磷酸化(12). 其他研究也强调了NIPP1在PRC2信号传导中的重要作用。因此，NIPP1对EZH2和EED都有直接的相互作用位点(12,17)并以PRC2依赖的方式起转录抑制因子的作用(17,18). 此外，NIPP1与PcG靶基因的子集结合，并促进EZH2与增殖相关靶基因的关联(12,19,20). 最后，NIPP1在PcG信号传导中的重要性最近通过在无偏见的shRNA多梳沉默修饰物筛选中的鉴定得到证实(21)以及在HeLa细胞中表达功能验证的PP1-NIPP1融合后H3K27me3水平的增强(22).

NIPP1，编码人第1页第8页是脊椎动物中近200种已知PP1（RIPPO）调控相互作用物之一(23). 它是一种38kDa的核蛋白，包含一个N端叉头相关（FHA）结构域、一个中心PP1-锚定结构域和一个C端PP1-抑制结构域。FHA结构域具有一个磷酸结合环，该环结合蛋白质，包括EZH2，这些蛋白质通过CDK在特定磷酸化-Thr-Pro（pTP）二肽基序上磷酸化(12). 全长NIPP1是PP1对所有测试底物的有效抑制剂，但允许通过FHA结构域招募的磷酸蛋白的受控去磷酸化(24,–26). NIPP1-associated PP1对FHA配体的有效去磷酸化需要对NIPP1的C末端PP1-抑制结构域进行变构移除，但其基本机制尚不清楚(24).

使用可诱导NIPP1敲除（iKO）模型，我们证明NIPP1对哺乳动物精子发生至关重要，更具体地说，是与生殖细胞增殖和存活相关的基因转录调控所必需的(27). 在本研究中，我们使用这种iKO模型表明，睾丸中NIPP1的缺失与EZH2的丢失和靶基因组蛋白H3K27三甲基化的减少有关。EZH2的缺乏可以通过其在CDK位点的磷酸化增强来解释，因为功能性PP1:NIPP1的缺失促进了其蛋白水解降解。我们的研究结果表明，NIPP1不仅是PP1的抑制剂，而且可以通过相关的PP1及时对EZH2进行去磷酸化。我们还讨论了EZH2缺失在何种程度上可能对NIPP1 iKOs的睾丸表型有贡献。

结果

睾丸中NIPP1的消融导致PRC2核心成分的丢失

在4周龄时，小鼠体内含有Ubc-Cre-ERT2型转基因，一个floxed第8页等位基因，以及WT（CTR）或敲除（iKO）第1页第8页在第1天、第3天、第5天和第7天注射三苯氧胺等位基因以切除牙线第1页第8页区域。从治疗开始2周后，当动物达到6周大时，将其处死。在这个阶段，在iKO中尚无法识别组织学表型(27). 然而，与CTR小鼠的NIPP1蛋白水平相比，它们睾丸中NIPP1的蛋白水平已经降低了约70%(图1,A类和B类). 有趣的是，尽管NIPP1的缺失与FHA配体CDC5L和SAP155水平的改变无关(图S5参考文献中。27)经免疫印迹法测定，它确实导致FHA配体EZH2下调约40%(图1,A类和C类)和免疫染色(图1H（H）). 与多份报告一致，这些报告表明，一个PRC2核心成分的缺失也会破坏其他PRC2亚基的稳定(28,–31)在NIPP1 iKO中，PRC2亚单位RBAP48和SUZ12的水平也降低了30–40%(图1,A类,D类,E类、和H（H）). RNA-Seq没有揭示iKOs中检测的PRC2核心成分的转录水平改变(图1F类)这表明它们的水平下降涉及（转录后）过程。我们通过免疫共沉淀分析证实NIPP1和EZH2是睾丸细胞核提取物中相同大分子复合物的一部分(图1G公司)，正如之前对HeLa细胞所证明的那样(12). 总之，这些数据表明，睾丸中NIPP1的缺失导致EZH2的丢失及其调节亚单位的不稳定。

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图1。

NIPP1的缺失导致PRC2核心部件失稳。 A类免疫印迹法检测NIPP1、EZH2、RBAP48和SUZ12水平。TBP用作负荷控制。B–E类，NIPP1、EZH2、RBAP48和SUZ12蛋白质水平的量化，如面板A.F根据RNA-Seq数据得出，在6周的他莫昔芬治疗的CTR和iKO小鼠中指示基因的表达。所有条形数据均为平均值±S.D(n个=每个实验组4只动物）。*，第页<0.05；**，第页< 0.01, ***,第页< 0.001.G公司，免疫沉淀物(IP（IP）)用免疫印迹法检测2周龄和6周龄CTR小鼠睾丸匀浆中内源性EZH2的共免疫沉淀NIPP1。W公司，周+抗体，添加EZH2抗体；−抗体，未添加抗体。H（H）用EZH2、RBAP48和SUZ12对注射他莫昔芬6周的小鼠睾丸切片进行免疫染色。比例尺，50微米。

PRC2水平不足与靶基因的放松调控相关

我们继续探讨NIPP1 iKOs睾丸中PRC2核心成分丢失的后果。正如预期的那样，如两种免疫染色所示，这些小鼠的睾丸H3K27me3水平显著降低(图2A类)和免疫印迹(图2,B类和C类). 对免疫染色的仔细检查表明，iKO中H3K27me3的丢失具有阶段依赖性，在生精周期的早期和中期最为显著(图2A类). 我们已经验证了iKO和CTR在不同开发阶段的管子比例没有改变(27). 基于先前确定的PcG靶基因列表(5,32,–34)，通过比较RNA-Seq分析绘制的17344个小鼠基因中的12%(27)被确定为可能的PcG目标(图2D类). 使用相同的标准，NIPP1 iKO中下调或上调的274个基因中有26%被归类为可能的PcG靶点，反映出其全基因组发生率的2倍以上。上调的PcG基因包括促凋亡基因英国广播公司3以及参与细胞周期进展的基因(Tnk1，Dtx3l、和Kif2b型)和性腺发育(长x 9) (图2E类). 下调的PcG靶点包括与细胞周期进展相关的基因(Cdkn2a公司,千分之一)和POU转录因子磅3f3参与多种组织的发育。总的来说，这些改变的表达谱与观察到的睾丸iKO生殖细胞增殖和存活潜力下降相一致（图6，e（电子）和如果参考文献中。27). 我们通过ChIP分析验证了H3K27me3在睾丸关键PRC2靶基因的启动子区域或其周围富集(图2F类)NIPP1的缺失与这些位点H3K27三甲基化降低有关，除了Cdkn2a公司(图2G公司). 矛盾的是，H3K27me3水平下降磅3f3与转录水平下降相关，表明磅3f3表达也受非PcG相关机制调节，或属于激活的PcG靶亚群(19,35)通过不同的机制，包括EZH2依赖的转录因子甲基化或转录延伸因子(36,37). 这些数据一起从功能上验证了NIPP1 iKO中PRC2组件的丢失。

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图2。

PRC2核心成分的丢失与H3K27me3水平降低和靶基因的放松调控有关。 A类用三苯氧胺处理6周的小鼠睾丸切片进行H3K27me3免疫染色。图示为生精周期早期、中期和晚期的生精小管。比例尺，50微米。B类免疫印迹法显示睾丸组蛋白提取物中的总H3和H3K27me3。C类，H3K27me3的定量，如所示面板B结果代表平均值±S.D(n个=每个实验组6只动物）。D类，绘制的睾丸基因组（分析了17344个基因）和274个差异表达基因中PcG靶基因丰度（%）的示意图(二甘醇)与CTR小鼠相比，NIPP1 iKO小鼠的睾丸中。E类，比较6周tamoxifen治疗小鼠睾丸的RNA-Seq谱。热图显示PcG靶基因显著上调和下调。箭头表示选择用于ChIP分析的基因。F类，ChIP分析6周三苯氧胺治疗的CTR小鼠睾丸中指示基因的H3K27me3。具有IgG的ChIP作为阴性对照。抄送6该基因被用作非PcG靶向对照基因。ChIP富集度计算为总输入信号的百分比(n个=每个实验组6只动物）。G公司，CTR和iKO小鼠之间H3K27me3 ChIP数据的比较。iKO中的H3K27me3水平表示为相对富集(n个=每个实验组6只动物）。CTR的数据表示为CTR值的%。数据表示为平均值±S.D.*，第页<0.05；**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001.

NIPP1 iKOs中EZH2的过度磷酸化和强化降解

在HeLa细胞中，EZH2在其CDK1/2介导的Thr-345和Thr-478磷酸化后，被定位于蛋白酶体降解(14,15). 这让我们假设NIPP1的缺失导致PP1对EZH2的靶向性不足，导致EZH2的过度磷酸化和不稳定。为了探索这一假设，我们首先比较了添加蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺后，在精原细胞系（C18-4）中瞬时表达的EGFP标记的EZH2-WT、EZH2-T345A和EZH2_T487A的半衰期(图3,A–C). EZH2-WT的半衰期为～2小时，但对于不可磷酸化的丙氨酸突变体，半衰期增加到约6小时，与EGFP的半衰期类似。因此，C18-4细胞中的EZH2通过阻止Thr-345或Thr-487的磷酸化而稳定。接下来，我们检查了NIPP1 iKOs睾丸中这些位点是否过度磷酸化。因为Thr-345和Thr-487之后是脯氨酸，所以它们的磷酸化状态可以通过用pan-pTP抗体进行免疫印迹得到，特别是因为这些残基代表EZH2的主要TP-磷酸化位点(10,–13). 从睾丸裂解物中免疫沉淀的EZH2在iKO中的TP-二肽基序处被过度磷酸化(图3,D类和E类). 此外，在C18-4细胞中体外表达的EGFP-EZH2在FLAG标记的PP1-NIPP1融合的共同表达后，TP-二肽基序的磷酸化显著降低（～70%）。我们之前已经证明PP1-NIPP1融合在亚细胞定位和酶学性质方面表现为天然PP1:NIPP1全酶(22,38)并且，与体外表达的NIPP1不同，不会竞争性破坏其他PP1全酶(22,39). 低活性融合（PP1m-NIPP1）与PP1γ组分活性位点中突变的金属配位残基（D64A）的共同表达使其催化活性降低80–90%(22,38)，仅对EZH2的TP-二肽磷酸化有轻微影响（约20%降低）(图3,F–H（飞行高度）). 这些数据提供了很好的证据，证明EZH2是PP1:NIPP1调节脱磷的底物，与之前的研究一致在体外数据(12). 因此，NIPP1 iKOs睾丸中EZH2的丢失可以解释为其CDK位点缺乏PP1介导的去磷酸化，导致其过度磷酸化和蛋白酶体降解。

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图3。

NIPP1控制EZH2的脱磷和稳定性。 A类，EGFP和指示的EGFP标签EZH2变体的示意图。B类用EGFP或EGFP标记的EZH2变体转染非同步化C18-4细胞，并用环己酰亚胺处理(瑞士法郎)（50μg/ml）。通过抗EGFP抗体的免疫印迹法确定EGFP和EGFP融合的命运。在环己酰亚胺存在下EGFP和EGFP-EZH2融合的翻转的典型示例。α-管蛋白被用作负荷控制。抗体，使用抗体。C类，量化面板B表示为平均值±S.D(n个=3个独立实验）。*，第页<0.05；**，第页< 0.01.D类，EZH2被免疫沉淀(IP（IP）)来自他莫昔芬处理的6周小鼠的睾丸提取物。在CTR和iKO条件下，校正同等数量的免疫沉淀EZH2的IP负荷。IgG作为阴性对照。对印迹进行总EZH2和TP-二肽磷酸化EZH2（pTP）染色。E类，磷酸化EZH2相对量的量化，如面板D(n个=每个实验组4只动物）。*，第页<0.05。F类、FLAG和FLAG-tagged PP1-NIPP1和PP1m-NIPP1融合方案。G公司、EGFP-EZH2和FLAG、FLAG-PP1-NIPP1或FLAG-PP1m-NIPP1在C18-4精原细胞中瞬时表达48小时。通过诺康唑处理16小时，细胞在前中期被阻滞。分析细胞裂解液中是否存在EGFP-EJH2和FLAG-PP1-NIPP1/FLAG-PPlm-NIPP1。对EGFP-EZH2和磷酸化EZH2（pTP）的EGFP-traps进行免疫印迹。*，第页<0.05。H（H），磷酸化EZH2相对量的量化，如面板G(n个=3个独立实验）。*，第页<0.05；**，第页< 0.01, **,第页< 0.001.

讨论

RIPPO时空控制PP1，主要通过（i）将磷酸酶靶向包含底物的亚细胞隔室，（ii）直接补充PP1底物的子集，和/或（iii）相关PP1的活性调节(40). 全长重组NIPP1对所有测试底物抑制PP1(24). 然而，异二聚体PP1:NIPP1全酶可以被“去抑制”以允许NIPP1相关FHA配体的去磷酸化，包括SAP155(25,38)和EZH2（本工程）。体外研究表明，这种去抑制可能涉及NIPP1的C末端尾部从PP1活性部位的变构移除，正如酪氨酸磷酸化或C末端的RNA结合所诱导的那样(24) (图4). 尽管PP1:NIPP1的这种假定变构调控的生理触发因素和机制细节尚不清楚，但我们目前的研究表明，EZH2的去磷酸化需要NIPP1和PP1，因为EZH2-在没有NIPP1时会过度磷酸化。因此，我们的数据证实NIPP1是PP1的典型调节因子，因为它通过相关PP1抑制或促进FHA配体的去磷酸化，这取决于迄今为止未知的上游NIPP1定向信号的状态。

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图4。

CDK和PP1调节EZH2的模型：NIPP1。CDKs在Thr-345、Thr-416和Thr-487处磷酸化EZH2。Thr-345磷酸化通过非编码RNA将EZH2靶向染色质，而Thr-487（和延长的Thr-344）磷酸化导致EZH2.的蛋白酶体降解。EZH2在Thr-416的磷酸化为NIPP1的N末端FHA结构域创建了一个对接位点。EZH2-招募的NIPP1通过PRC2相关PP1阻止EZH2的立即去磷酸化。然而，NIPP1对PP1的抑制可以通过PP1与NIPP1的C末端PP1抑制结构域之间的相互作用的变构破坏来减轻（去抑制），从而导致EZH2去磷酸化。体外在RNA与NIPP1的C末端结合以及C末端酪氨酸磷酸化之后，可以看到这种去抑制。请注意，即使取消禁用，NIPP1仍通过其PP1锚定域与PP1紧密关联。

PP1的功能后果：NIPP1介导的去磷酸化明显依赖于底物。SAP155的去磷酸化影响其作为剪接因子的功能(25)，但不会改变其细胞浓度(38). 在这里，我们证明了EZH2是过度磷酸化的，并且在没有NIPP1的情况下靶向蛋白水解降解。然而体内PP1对EZH2的调节：NIPP1可能更具动态性，并且依赖于功能状态（抑制或促进），而不是NIPP1的浓度。我们设想CDK1/2在Thr-345磷酸化EZH2，将其靶向特定的染色质位点(图4). 通过CDK1/2在Thr-416同时磷酸化EZH2，阻止了该位点的立即去磷酸化(12)导致NIPP1的募集和PRC2相关PP1的抑制(图4). 在这里，NIPP1用于延长EZH2与靶基因子集的结合，从而增强H3K27me3在这些基因座的沉积(12,19,20). 与这一概念一致，我们最近证明了PP1-NIPP1融合在HeLa细胞中的表达增加了染色质的H3K27me3水平(22)，证实该磷酸酶可以作为EZH2信号传导的正调节器。EZH2在Thr-345和Thr-487处的长时间磷酸化，可能在有丝分裂期间发生(14)或在NIPP1缺失后（本研究），以EZH2的受影响池为目标进行蛋白水解降解。综上所述，我们的数据表明NIPP1通过阻断或促进相关PP1的去磷酸化来时空控制EZH2的磷酸化状态。

睾丸中NIPP1的缺失导致生精谱系细胞的增殖和存活能力降低，最终导致12周龄时生殖细胞的完全丧失(27). 然而，EZH2的睾丸消融诱发了一种更温和的表型(5)这表明NIPP1 iKO中的缺失不能完全解释iKO更强大的表型。睾丸中EZH2的丢失主要由其同源物EZH1补偿(6). 此外，EZH1和EZH2的合并删除(6)，或PRC2部件SUZ12或EED烧蚀(5)与EZH2缺失睾丸相关的表型相比，诱导了更强的表型。由于介导靶向NIPP1的EZH2（Thr-416）残基在EZH1中是保守的，因此研究NIPP1缺失是否也会影响EZH1的表达或功能将很有意义。然而，我们注意到，控制其染色质靶向和降解的EZH2的CDK1/2磷酸化位点（Thr-345和Thr-487）在EZH1中并不保守。因此，PP1:NIPP1对EZH1和EZH2的调节不能完全相同。目前，我们不能排除其他NIPP1-FHA配体的去磷酸化受阻也有助于NIPP1-iKOs的睾丸表型。

总之，我们将EZH2确定为体内PP1的底物：NIPP1。在没有NIPP1的情况下，不能形成功能性PP1:NIPP1全酶，导致EZH2过度磷酸化和失稳。

实验程序

作者贡献

费雷拉和概念化；M.Ferreira和I.V.资源；M.Ferreira和A.V.E.数据管理；M.Ferreira软件；费雷拉形式分析；M.Ferreira验证；M.Ferreira调查；M.Ferreira和A.V.E.可视化；M.Ferreira、A.V.E.和M.B.方法论；M.Ferreira和M.B.书面原稿；M.Ferreira、A.V.E.和M.B.写作审查和编辑；M.Fardilha和M.B.融资收购；M.Fardilha和M.B.项目管理；A.V.E.和M.B.监督。

补充材料

致谢

参考文献