脂联素调节活化肝星状细胞中的局灶黏附分解：逆转肝纤维化的意义

动物和CCl₄-诱导的小鼠肝纤维化

八岁男性野生型（WT）C57BL/6J和脂联素阴性（Ad^−/−)小鼠用于动物研究。广告^−/−老鼠是K.Walsh博士（美国马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院）实验室慷慨赠送的礼物。小鼠是在C57BL/6J背景下培养的。按照埃默里大学动物护理和使用委员会批准的方案对动物进行护理。动物被安置在温度可控的环境中，光暗周期为12小时。喂食动物随意Purina Laboratory Chow（美国密苏里州圣路易斯市Ralston Purina）和水。我们确认在Ad患者的血清中未检测到脂联素^−/−ELISA检测小鼠。该研究包括4组小鼠：通过灌胃和腹腔注射无菌盐水接受橄榄油的对照小鼠，接受CCl的小鼠₄灌胃和另外两个亚组小鼠灌胃CCl₄并注射携带重组减毒腺病毒载体大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因[腺病毒LacZ（Ad-LacZ）]和CCl灌胃小鼠₄并在CMV启动子[腺病毒脂联素（Ad-Adn）]的调控下，给予携带人类脂联素cDNA的重组减毒腺病毒载体。WT和广告^−/−给体重20–25 g的小鼠注射CCl₄（2 ml/kg）和橄榄油（1:1比例）每周两次，灌胃6周。给小鼠尾静脉注射Ad-LacZ或Ad-Adn（1×10⁹病毒颗粒）每4天一次，持续2周₄灌胃。我们证实，在基线检查时，Ad患者的血清中未检测到脂联素^−/−小鼠通过ELISA检测，但在注射Ad-Adn后测得血清脂联素浓度显著升高（小鼠脂联素ELISA试剂盒；美国马萨诸塞州比勒里卡市Millipore）。

重组腺病毒的生产

编码脂联素的全长cDNA({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_004797”，“term_id”：“1519242509”，“term_text”：“NM_004798”}}NM_004797)在穿梭载体（pShuttle-CMV，AdEasy XL腺病毒载体系统；Stratagene，La Jolla，CA，USA）中进行亚克隆，并通过限制性内切酶进行线性化个人电脑我消化。将凝胶纯化的线性化载体转化到BJ5183-AD-1活性细胞（AdEasy XL腺病毒载体系统；Stratagene）中的pAdEasy-1质粒预转化。AdEasy腺病毒载体是减毒的人类腺病毒血清型5，由于E1和E3基因的缺失而导致复制缺陷。因此，除脂联素cDNA外，Ad-LacZ和Ad-Adn具有相同的生物学特性。腺病毒在从Stratagene购买的AD293细胞中繁殖。使用Adeno-X病毒纯化试剂盒（美国加利福尼亚州山景城Clontech实验室）纯化腺病毒，并使用Adeno-XMT快速滴度试剂盒（Clontech Laboratories）测定病毒滴度。我们通过测定血清转氨酶监测腺病毒注射的潜在损伤。

胶原蛋白的Picro-Sirius红染色

将肝切片（5μm）脱蜡并用双蒸馏水洗涤。脱蜡切片用微虹膜红溶液（Abcam，Cambridge，MA，USA）培养60分钟，然后用醋酸（0.05%）短暂冲洗。切片用无水酒精洗涤脱水。切片在光学显微镜下观察。使用ImageJ软件（美国马里兰州贝塞斯达美国国立卫生研究院）对胶原蛋白染色进行量化。

RNA提取和定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析

使用RNeasy Mini Kit（美国加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）从肝组织或HSC中提取总RNA，并使用Bio-Rad iScript cDNA合成试剂盒（美国加州赫拉克勒斯Bio-Rad）进行第一链cDNA合成。将等量的cDNA用于qRT-PCR。实验中使用的引物为Col1α2：正向5′-CTAGCAACCGTGCTTCTCA-3′和反向5′-TTGGCCACCAATGT-3′；整合素β1：正向5′-TGAGAGCCGCCAGACCCG-3′和反向5′-CATCTTTTCGCAGCGCCC-3′；整合素αv：正向5′-AAGCGCAGCACAGCTCGG-3′和反向5′-AACATCCTGGAGGACGTGG-3′；整合素β3：正向5′-TCCCCCCCCGCAGGAAA-3′和反向5′-CCACACACAACGCCCGCCAG-3′；vinculin：正向5′-CGTCCGTGGAAAAAGA-3′和反向5′-AAGGATTCCCCTAGAGCCGT-3′；FAK：正向5′-GGCAGCTGCTTATCTTGACC-3′和反向5′-TGATGCCCTGACATCAGTA-3′；α-SMA：正向5′-CACACGATGTACCAGGCATT-3′和反向5′-TGGAAGTAGACAGCGAGC-3′。根据标准方案，使用IQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）进行qRT-PCR。PCR循环条件设置为95°C 15秒，55°C 15 s，72°C 20 s，共40个循环。qRT-PCR分析使用Mastercycler ep realplex（德国汉堡Eppendorf）和内部对照（GAPDH或18S）进行三次。

共焦显微镜体内研究

从WT和Ad的肝脏中获得5μm厚的冷冻切片^−/−老鼠。免疫荧光染色采用抗vinculin、p-FAK和结蛋白抗体。简单地说，冷冻肝脏切片在室温下风干30分钟，用4%多聚甲醛固定15分钟，然后用0.1%Triton X-100渗透。为了避免非特异性蛋白结合，用5%的正常山羊血清阻断肝脏切片。一级抗体vinculin（1:250）和结蛋白（1:400），或p-FAK Tyr576/577（1:200）和结素，与单个切片在4°C下同时孵育过夜。在4℃下用Alexa Fluor-conjugated二级抗体（Alexa Fluor-conducated secondary antibodies，Alexa在两种不同宿主中产生的488和546）检测1 h的免疫染色。幻灯片用To-Pro（美国纽约州格兰德岛生命科技公司）进行复染，并用ProLong Gold防褪色试剂（生命技术公司）进行安装。使用配备488-nm Ar和568-nm HeNe激光器（LSM510；德国波恩卡尔蔡司）的蔡司元共焦激光扫描显微镜系统采集图像。

大鼠肝星状细胞的分离

雄性Sprague-Dawley大鼠（400 g）购自Charles River（美国马萨诸塞州波士顿）。所有大鼠都接受了人道护理，埃默里大学机构动物护理和使用委员会批准了从大鼠中分离HSC的方案。如上所述，在无菌门静脉灌注Pronase和胶原酶后，使用单步密度梯度分离静止的大鼠HSC。新鲜的、最初获得的静止HSC被镀到组织培养塑料上；5-7天后，对其进行激活监测，并仅用于一次实验(10).

蛋白质裂解物和蛋白质印迹程序

在各自实验的处理条件下，用PBS和200μl含蛋白酶抑制剂（PI）的冰镇RIPA缓冲液（PhosStop；Roche Diagnostics，印第安纳波利斯，美国）在冰上清洗HSC。用橡胶刮刀刮取细胞，收集的提取物在14000下离心清除克在4°C下保持10分钟。蛋白质浓度由Bradford试剂（Sigma-Aldrich）以BSA为标准测定。蛋白质通过SDS-PAGE解析并转移到PVDF膜上，并通过使用不同实验的特异性抗体进行免疫印迹分析。使用HyGlo化学发光HRP抗体检测试剂（Denville Scientific，South Plainfield，NJ，USA）和X射线胶片（Kodak，Rochester，NY，USA。使用αEaseFC 4.0.1软件（Alpha Innotech，San Leandro，CA，USA）对解析蛋白质进行密度分析，以量化蛋白质带强度。

免疫沉淀（IP）

用30μl蛋白A/g琼脂糖珠（Santa Cruz Biotechnology）在4°C下预处理全细胞裂解物（200μg蛋白质）30分钟。预先清除的上清液与2μg抗体孵育过夜。随后将免疫复合物与30μl蛋白A/G琼脂糖在4°C的摇床上孵育2小时。琼脂珠用1ml冰冷的RIPA裂解缓冲液洗涤3次，重悬于30μl的2×莱姆利样品缓冲液中，并通过使用特异性抗体的Western印迹分析进行SDS-PAGE，用于各种实验。

小干扰RNA下调Shp2和FAK

购买了用于Shp2和FAK的市售siRNA（Sigma-Aldrich），其中至少有三个siRNA用于转染实验。按照制造商说明，将HSC接种到组织培养塑料上，生长到达到30-40%的融合，并使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂（Invitrogen）转染Shp2的混合siRNAs。干扰的siRNA被转染并作为对照。转染后24小时，将细胞血清饥饿（2%FBS）过夜，然后用HMW脂联素（10μg/ml）处理30分钟。未处理的细胞作为对照。如前所述，使用适当的抗体对细胞裂解物进行Western blot分析。

大鼠HSC中脂联素受体与敲除

AdipoR1、AdipoR2和非靶向shRNA质粒购自Sigma-Aldrich，用于解剖脂联素导致FAK去磷酸化的途径。慢病毒是通过使用标准方案在家中生产的。简单地说，慢病毒是由慢病毒包装载体（pCMV-dr891，VSV-G）和编码感兴趣基因的载体（pLKO.1-AdipoR1-puro或pLKO.1-AdipoR1-puro或pLKO.1-非哺乳动物-puro）（Sigma-Aldrich）使用Lipofectamine（Invitrogen）共同转染HEK-293FT细胞产生的遵循制造商的说明。培养48小时后，收集上清液，通过低速离心（200克5分钟），并使用0.45-μM过滤器过滤澄清上清液（Millipore，Billerica，MA，USA）。通过超速离心浓缩病毒2小时，将颗粒溶解在PBS中。将慢病毒储存在−80°C下，直至使用。大鼠HSC以1×10的剂量接种⁶电池/板，100 mm²组织培养皿。将50-70%汇合处的细胞与慢病毒颗粒（MOI=2）在聚brene（5μg/ml）存在下孵育16 h。感染细胞在完全生长培养基中培养48 h，在含有2μg/ml嘌呤霉素的完全生长培养液中培养数天，筛选出稳定的克隆。Western blot分析证实受体敲除。

体外激酶测定

用2μg APPL1抗体对原代HSC进行裂解和免疫沉淀。将重组Shp2（2μg；Novus，Littleton，CO，USA）与10μM ATP添加到1×激酶缓冲液（Cell Signaling，Danvers，MA，USA(16). 用p-Shp2 Tyr542、总Shp2和APPL1抗体通过蛋白质印迹分析分析样品。

单细胞肝硬度分析

如Wells及其同事所述，HSC培养在具有不同硬度聚丙烯酰胺凝胶基质的玻璃盖玻片上(17). 简单地说，聚丙烯酰胺凝胶是用不同浓度的第二类-丙烯酰胺（0.01-0.3%）并与7.5%丙烯酰胺混合。聚丙烯酰胺与Sulfo-SANPAH（皮尔斯，洛克福德，伊利诺伊州，美国）通过2个周期（60秒）的紫外线照射交联。HSC接种在聚丙烯酰胺凝胶上过夜，然后进行HMW脂联素或ADP355治疗6小时。ADP355是Eva Surmacz博士的一份礼物（Temple University，Philadelphia，PA，USA；参考。18)将HSC植入涂有纤维连接蛋白的玻璃盖玻片上，作为最大硬度的阳性对照。通过扫描8组场来进行p-FAK信号强度的量化。

脂联素抑制活化HSC中的vinculin表达在体外

文丘林，是FA组装中细胞骨架蛋白的标记物(19)，也由在体外方法。我们发现HMW脂联素治疗后，肌成纤维细胞中的vinculin表达显著减弱(图3A类). 在本实验中，瘦素处理的肌成纤维细胞作为阳性对照，与未处理的细胞相比，瘦素显著增加了vinculin的表达。相比之下，脂联素处理的肌成纤维细胞对vinculin的染色显著减弱(图3A类). 为了提供将FAK活性降低与vinculin联系起来的物理证据，我们确定脂联素是否消除了FAK与vincumin之间的非共价联系。与免疫沉淀对照提取物相比，用抗FAK抗体进行IP研究，然后用抗痘蛋白抗体进行Western blot分析，结果显示脂联素治疗后，FAK-痘蛋白的相关性显著降低(图3B类).

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图3。

脂联素通过抑制活化大鼠HSC中长春花蛋白的表达和FAK的去磷酸化来破坏FA的组装体外试验。A类)用脂联素处理活化的HSC，然后进行免疫荧光染色（绿色，管状蛋白；红色，F-actin）。控制，电镀初级激活HSC；瘦素，阳性对照。比例尺=20μm。B类)用脂联素处理的细胞中的抗FAK蛋白IP后的vinculin的Western blot（WB）。C类)用密度分析法对脂联素处理的活化HSC进行蛋白质印迹，证明FAK的酪氨酸磷酸化降低。D类)脂联素诱导的Tyr542的Shp2磷酸化。E类)对脂联素处理的活化HSC进行IP检测FAK，然后用抗p-Shp2和抗FAK进行Western blot分析，证明FAK和Shp2之间存在物理联系。F类)利用抗Shp2（si-Shp2）的干扰siRNA或混合siRNA对HSC进行脂质体转染。G公司)尽管存在脂联素，siShp2敲除仍恢复了FAK磷酸化。H（H）)通过qRT-PCR和Western blot分析TIMP1和α2（I）胶原的mRNA和蛋白表达。用打乱的siRNA或siFAK转染原代大鼠HSC，然后提取总RNA，并定量mRNA表达。磷酸化物种带强度的密度分析与总强度有关，以相对密度单位（RDU）表示。在siRNA实验中，β-肌动蛋白被用作内部对照。结果为代表性平均值±东南方共进行3次实验，一式三份*P（P）< 0.05.

脂联素诱导活化HSC中FAK去磷酸化在体外

与对照组相比，脂联素治疗的肌成纤维细胞裂解物的Western blot分析显示p-FAK显著降低。为了探索FAK去磷酸化的潜在机制，我们首先确定了c-Src在解释这一观察结果中的作用。由于c-Src结合FAK并允许FAK通过构象变化进行自动磷酸化，我们预测脂联素将通过抑制c-Src-表达来阻止FAK磷酸化。然后，我们确定哪些FAK酪氨酸残基脂联素阻止维持磷酸化状态，从自磷酸化残基Tyr397开始，然后是Tyr残基925和576/577。虽然我们观察到脂联素确实引起FAK Tyr397的自磷酸化降低，但这只是一个暂时的效应，因为Tyr367的磷酸化在60分钟时完全恢复(图3C类). 此外，我们发现在这段时间内c-Src蛋白表达没有变化(图3C类). 总之，这些数据表明，c-Src对FAK自磷酸化的禁止并不能完全解释我们的发现，因为尽管进行了脂联素治疗，但FAK Tyr925和Tyr576/577，以及因此完全的FAK活性仍然是允许的。

脂联素诱导的Shp2磷酸化

先前的研究表明，Shp2在不同细胞类型的FAK去磷酸化中起直接作用(20,21). Shp2是一种广泛表达的酪氨酸特异性蛋白磷酸酶，主要负责生长因子、细胞因子、激素和细胞外基质受体的下游信号传导(22,23). 我们发现，脂联素处理的肌成纤维细胞裂解物含有大量活化的Shp2，通过Tyr542（p-Shp2；图3D类)提示Shp2激活可能是脂联素信号传导中相对早期的事件。为了分析肌成纤维细胞中FAK去磷酸化是否是Shp2激活的直接结果，我们使用了几种方法。首先，我们通过IP来证明p-Shp2和FAK之间是否存在物理关联(图3E类). 我们发现来自脂联素处理细胞的裂解物中的FAK-p-Shp2复合物显著增加(图3E类)与未经处理的对照肌成纤维细胞提取物相比。

Shp2沉默脂联素介导的FAK去磷酸化

我们使用合并的siShp2结构来降低内源性Shp2磷酸酶活性。Shp2 siRNA显著降低Shp2表达(图3F类)与siRNA对照组相比，尽管存在脂联素，Tyr576/577处的FAK磷酸化也显著增加(图3G公司). 我们还用stibogluconate钠（10μM）对Shp2活性进行了化学抑制，并证明在肌成纤维细胞中，FAK Tyr576/577磷酸化在脂联素的存在下持续存在，FAK或Shp2的mRNA或蛋白表达均未受到影响（数据未显示）。

最后，我们用类似于先前实验中使用的合并siShp2构建体的方法开发了siFAK分子，以确定与肝纤维化相关的已建立的标志物是否可以被抑制，如图所示图3G公司敲除FAK显著降低金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP1）和α2（I）胶原的表达(图3H（H）). 总之，我们建立了FAK的脂联素下调与FA分解之间的联系，以及在纤维生成刺激下通常上调的关键分子。

AdipoR1在与FAK活性降低相关的脂联素信号传导中起关键作用

为了确定与观察到的终点有关的上游脂联素相关的信号转导元件，我们进行了IP研究，以降低AdipoR1或AdipoR2，因为AdipoR1和AdipoR 2都具有在肝脏传递脂联素信号转导的生物学能力(24,25). 我们还用一种针对适配蛋白APPL1的抗体探测受体裂解物，因为APPL1以相同的亲和力无选择性地与这两种受体结合(图4A类,B类). 然而，在肌成纤维细胞裂解物中，我们发现脂联素优先增强APPL1活性通过AdipoR1型(图4A类). 然后，我们通过在培养基中对暴露于脂联素30分钟的肌成纤维细胞裂解物进行IP分析，确定Shp2和APPL1是否也存在非共价连接，证明脂联素增强的APPL1和p-Shp2关联(图4C类)在对照提取物中未观察到。由于衔接蛋白具有多潜能功能，我们确定APPL1是否可以作为一种激酶直接磷酸化Shp2。我们执行了一个在体外通过免疫沉淀APPL1进行激酶分析，然后使用重组Shp2蛋白。随后用抗p-Shp2鉴定了Shp2的磷酸化物种(图4D类)并且显示出显著的p-Shp2，表明APPL1具有充足的激酶活性，并且在Tyr542磷酸化了Shp2。最后，为了证明脂联素介导的FAK失活中信号级联的受体启动，我们进行了在体外慢病毒shRNA转染对肌成纤维细胞AdipoR1和AdipoR2的抑制作用(图4E类,F类). 我们成功地敲除了这两种受体，并发现AdipoR1敲除显著减弱了Shp2磷酸化(图4G公司)，但AdipoR2击倒没有(图4G公司).

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图4。

APPL1是由AdipoR1驱动的Shp2活化的激酶。A类)用脂联素处理的肌成纤维细胞裂解物进行IP和抗AdipoR1，然后用抗APPL1和抗AdipoR1进行Western blot。B类)IP和抗AdipoR2，以及随后的Western blot分析和抗APPL1和抗AdipoR2。C类)细胞裂解产物经IP和抗APPL1处理，然后用抗-Shp2 Tyr542、抗Shp2和抗APPM1进行Western blot分析。D类)体外激酶分析证明APPL1作为激酶，能够激活Shp2。结果显示，APPL1的IP与重组Shp2孵育。Western blot抗体包括抗Shp2-Tyr542、抗Shp2和抗APPL1。E类,F类)慢病毒载体与非靶向shRNA相比AdipoR1和AdipoR2的shRNA敲除的蛋白质印迹分析。G公司)暴露于脂联素的活化HSC随后进行p-FAK、p-Shp2、总FAK和总Shp2的Western blot。通过Western blot分析中检测磷酸化酪氨酸残基576/577的抗p-FAK评估，AdipoR1的敲除恢复了FAK磷酸化。H（H）)AICAR不能诱导p-FAK的Shp2磷酸化和去磷酸化。结果代表平均值±东南方共进行3次实验，一式三份*P（P）< 0.05.

由于AMPK被认为是脂联素信号转导的主要上游效应器，我们使用AMPK的强效激动剂（1 mM AICAR）来确定我们是否可以激活Shp2，进而使FAK失活。如所示图4H（H）然而，AMPK的AICAR激活未能改变Shp2或p-FAK的磷酸化状态；也就是说，我们不能用最强的AMPK激活剂去激活FAK在体外.

作者感谢Rebecca Wells博士及其实验室工作人员（美国宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学）在实验结果方面的智慧投入，以及他们在帮助玻璃盖玻片实验方面的帮助。

这项工作得到了美国公共卫生署的资助(DK062092（丹麦克朗）)美国退伍军人事务部(I01BX001746型)和埃默里大学，均授予F.A.A。