美国国家科学院院刊。2001年11月20日；98(24): 13844–13849.
幽门螺杆菌精氨酸酶抑制真核细胞产生一氧化氮：细菌生存策略
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阿兰·戈伯特
以下部门*胃肠科医学‡微生物学和免疫学，‖马里兰州大学医学院格林巴姆癌症中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21201；†马里兰州巴尔的摩退伍军人事务医疗系统，马里兰州21201；和¶澳大利亚新南威尔士州悉尼新南威尔斯大学生物化学与分子遗传学学院，邮编：2052
大卫·J·麦基
以下部门*胃肠科医学‡微生物学和免疫学，‖马里兰州大学医学院格林巴姆癌症中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21201；†马里兰州巴尔的摩退伍军人事务医疗系统，马里兰州21201；和¶澳大利亚新南威尔士州悉尼新南威尔斯大学生物化学与分子遗传学学院，邮编：2052
马哈茂德·阿赫塔
以下部门*胃肠科医学‡微生物学和免疫学，‖马里兰州大学医学院格林巴姆癌症中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21201；†马里兰州巴尔的摩退伍军人事务医疗系统，马里兰州21201；和¶新南威尔士大学生物化学和分子遗传学学院，澳大利亚新南威尔士州悉尼2052
乔治·门兹
以下部门*胃肠科医学‡微生物学和免疫学，‖马里兰州大学医学院格林巴姆癌症中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21201；†马里兰州巴尔的摩退伍军人事务医疗系统，马里兰州21201；和¶澳大利亚新南威尔士州悉尼新南威尔斯大学生物化学与分子遗传学学院，邮编：2052
杰米·牛顿
以下部门*胃肠科医学‡微生物学和免疫学，‖马里兰州大学医学院格林巴姆癌症中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21201；†马里兰州巴尔的摩退伍军人事务医疗系统，马里兰州21201；和¶澳大利亚新南威尔士州悉尼新南威尔斯大学生物化学与分子遗传学学院，邮编：2052
程玉兰
以下部门*胃肠科医学‡微生物学和免疫学，‖马里兰州大学医学院格林巴姆癌症中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21201；†马里兰州巴尔的摩退伍军人事务医疗系统，马里兰州21201；和¶澳大利亚新南威尔士州悉尼新南威尔斯大学生物化学与分子遗传学学院，邮编：2052
哈里·L·T·莫布里
以下部门*胃肠科医学‡微生物学和免疫学，‖马里兰州大学医学院格林巴姆癌症中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21201；†马里兰州巴尔的摩退伍军人事务医疗系统，马里兰州21201；和¶澳大利亚新南威尔士州悉尼新南威尔斯大学生物化学与分子遗传学学院，邮编：2052
基思·威尔逊
以下部门*胃肠科医学‡微生物学和免疫学，‖马里兰州大学医学院格林巴姆癌症中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21201；†退伍军人事务马里兰州医疗保健系统，马里兰州巴尔的摩，邮编21201；和¶澳大利亚新南威尔士州悉尼新南威尔斯大学生物化学与分子遗传学学院，邮编：2052
以下部门*胃肠科医学‡微生物学和免疫学，‖马里兰州大学医学院格林巴姆癌症中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21201；†马里兰州巴尔的摩退伍军人事务医疗系统，马里兰州21201；和¶澳大利亚新南威尔士州悉尼新南威尔斯大学生物化学与分子遗传学学院，邮编：2052
§现住址：南阿拉巴马大学医学院微生物与免疫学系，MSB 2078，Mobile，AL 36688。
由加利福尼亚大学洛杉矶医学院Louis J.Ignarro编辑，2001年9月28日批准
摘要
一氧化氮（NO）的抗菌作用是先天免疫的重要组成部分。宿主对人类胃病原菌的强烈反应幽门螺杆菌尽管胃粘膜中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）上调，但未能根除该生物体。这里我们报告了野生型菌株幽门螺杆菌在生理浓度为我-精氨酸，iNOS和精氨酸酶的常见底物。基因失活岩石（rocF），编码组成性表达的精氨酸酶幽门螺杆菌，恢复了巨噬细胞产生的高输出NO。通过使用HPLC分析，我们表明我-野生型精氨酸在培养基中被有效消耗，但精氨酸酶缺乏幽门螺杆菌.巨噬细胞与岩石（rocF）-不足幽门螺杆菌导致有效杀灭细菌，而野生型幽门螺杆菌在这些条件下没有表现出生存损失。精氨酸酶缺乏的杀灭幽门螺杆菌是NO-依赖性的，因为来自iNOS的腹腔巨噬细胞−/−小鼠未能影响岩石（rocF）突变体。因此，细菌精氨酸酶允许幽门螺杆菌通过下调真核生物NO的生成来逃避免疫反应。
H（H）幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性微需氧菌，选择性定植于人类胃。当前流行率幽门螺杆菌约占美国人口的40%(1)而在欠发达地区则要高得多。幽门螺杆菌导致慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和淋巴瘤，因此被归类为I类致癌物(2). 尽管刺激了大量的急慢性免疫和炎症反应，幽门螺杆菌感染通常持续到宿主的一生。了解细菌如何逃避宿主反应仍是管理这种感染的公共卫生负担的关键问题。
一氧化氮（NO）是先天免疫的核心成分，也是一种有效的抗菌剂(三). 这种活性对细胞内病原体尤其显著，例如结核分枝杆菌(4)和大型利什曼原虫(5)，它们被依赖于NO的机制杀死。活性氮中间体也能有效杀死细胞外寄生虫(6,7)和细菌，如大肠杆菌(8). NO和过氧亚硝酸盐的化学来源对幽门螺杆菌(9,10). 然而，细胞来源的NO对幽门螺杆菌尚未进行调查。生存幽门螺杆菌尽管巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）显著诱导(11)和胃组织(12)，表明该细菌已开发出避免NO-依赖性杀伤的机制。
精氨酸酶是一个原始酶家族，在各个王国中高度保守(13). 哺乳动物精氨酸酶与NO合成酶竞争共同底物我-精氨酸(14)将氨基酸水解成尿素我-鸟氨酸。因此，精氨酸酶可以调节细胞NO的生成(15,16)并抵消NO的生物效应(7,17).幽门螺杆菌拥有基因岩石（rocF），编码精氨酸酶(18). 我们之前的工作表明幽门螺杆菌在高浓度培养条件下加入巨噬细胞我-精氨酸的可用性导致大量NO生成(11). 这里我们报告了幽门螺杆菌精氨酸酶对生理条件下巨噬细胞NO生成的影响我-精氨酸浓度。尽管是野生型（WT）幽门螺杆菌和缺乏岩石（rocF）刺激类似水平的iNOS mRNA表达，用岩石（rocF）-缺乏菌株。这一发现可归因于我-WT消耗精氨酸，但精氨酸酶缺乏细菌不消耗精氨酸类。精氨酸酸酶活性的丧失导致显著的NO-依赖性杀灭幽门螺杆菌表明细菌精氨酸酶已进化为一种生存机制，可能有助于幽门螺杆菌为了宿主的生命成功地在人类胃中定植。据我们所知，我们的数据首次描述了原核精氨酸酶对真核生物NO生成的调节。
材料和方法
细菌。
幽门螺杆菌菌株SS1(19)和26695(20)使用。在这些菌株中岩石（rocF）基因被插入第3页盒，产生突变体(岩石（rocF）∷图A3)完全缺乏精氨酸酶活性(18). 这个第3页用于中断的磁带岩石（rocF）不太可能对其他基因产生任何极性影响，因为上游基因(惠普1398)与的方向相反岩石（rocF）和下游基因的5′端(1400小时)超过3′端500 bp岩石（rocF）此外，岩石（rocF）随后是预测的近一致性rho依赖性转录终止子（CUUUUCAAACCN11GGUGAAAAAAG），其次是AU-富集区(18). WT和岩石（rocF）突变体在布鲁氏菌属含有10%羊血的琼脂平板，或在含有3%FBS的米勒-欣顿肉汤中培养（纽约州格兰德岛生命科技公司）。在当前的实验中，WT和突变菌株的冷冻库存传代数始终相同。幽门螺杆菌菌株在指数生长期从生长培养基中获得，洗涤两次，悬浮在PBS中，并用于实验。所有细菌培养物均在微需氧条件下培养。细菌浓度采用OD分光光度法测定600如所述(11).
开发其他准备工作幽门螺杆菌，进行了以下操作。法国新闻裂解物幽门螺杆菌通过在20000 psi（1 psi=6.89 kPa）下通过法国压力传感器获得；参考。11). 通过旋转10获得水提取物9细菌在1ml水中浸泡5分钟(21). 对裂解液和水提取物进行12000×离心克培养10min，取上清液进行检测。细菌也在PBS中煮沸30分钟。
对于幽门螺杆菌杀菌研究，幽门螺杆菌通过连续稀释和血琼脂平板培养，测定共培养前后的集落形成单位。
细胞。
小鼠巨噬细胞系RAW 264.7保存在DMEM（Life Technologies）中，并在湿润的5%CO中补充10%FBS/100单位/ml青霉素/100μg/ml链霉素/1 mM丙酮酸钠/10 mM Hepes2大气。在实验中，RAW 264.7细胞与完整或溶解的细胞共培养幽门螺杆菌在10到100倍的感染率（moi）下，有或没有过滤器支架（0.2μm孔径；Transwell，Nunc）。要控制我-共培养物中的精氨酸浓度，无血清DMEM，无血清我-使用精氨酸和酚红（生命技术），并补充1 mM丙酮酸钠/10 mM Hepes/4 g/l BSA（Sigma）。巨噬细胞（106将每毫升细胞数）置于24孔板中，4小时后更换培养基。iNOS特异性抑制剂，n个-亚氨基乙基-我-赖氨酸（100μM；Alexis生化公司，圣地亚哥）和各种浓度的我-然后向细菌中添加精氨酸（Sigma）。在一些实验中，在添加幽门螺杆菌持续6小时。
从C57BL/6 WT和iNOS中分离出腹腔巨噬细胞−/−小鼠（杰克逊实验室）(22)并与幽门螺杆菌在DMEM-BSA中。
NO浓度的测量。
NO、NO氧化产物的浓度2−，通过Griess反应进行评估，如其他地方所述(11). 总活性氮化合物的浓度(23)使用NO分析仪NOA280（Sievers，Boulder，CO）进行测量，NOA280是一种基于NO和臭氧之间气相化学发光反应的高灵敏度检测器(24).
测量我-精氨酸浓度。
幽门螺杆菌SS1 WT和岩石（rocF）∷第3页(108/ml）在用于共培养实验的培养基中培养24小时，其中含有0.4 mM我-精氨酸。氨基酸分析在Beckman-Coulter 7300氨基酸分析仪上采用高效液相色谱法，采用阴离子交换色谱法。该系统使用了四种提高pH值和离子强度的氯化锂洗脱缓冲液，与茚三酮的柱后反应，以及570和440 nm的双波长检测。使用Beckman Coulter System Gold进行数据采集和峰积分。
北方斑点分析。
RAW 264.7巨噬细胞（106/ml）播种在75厘米2烧瓶，用幽门螺杆菌SS1 WT或岩石（rocF）∷第3页(107/ml）。6小时后，取出培养基，用PBS洗涤细胞两次。如所述进行总RNA提取和Northern印迹分析(11). 对于iNOS mRNA检测32使用P随机引物标记的小鼠iNOS全长（3.9 kb）cDNA探针（取自纽约康奈尔大学医学院的Q.W.Xie和C.Nathan）。通过与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH；CLONTECH）cDNA探针杂交来标准化mRNA的浓度。
结果
RAW 264.7巨噬细胞对WT和精氨酸酶缺乏反应产生NO的分析幽门螺杆菌.
因为幽门螺杆菌拥有基因岩石（rocF）编码细菌精氨酸酶，我们使用了等基因岩石（rocF）突变株的作用研究幽门螺杆菌-衍生精氨酸酶对宿主细胞NO生成的影响。在我-精氨酸浓度为0.4mM，幽门螺杆菌SS1 WT抑制NO的生成2−RAW 264.7巨噬细胞（图。A类). 相反，精氨酸酶缺乏幽门螺杆菌NO的受刺激浓度依赖性增加2−水平。受刺激巨噬细胞NO的差异2−WT和岩石（rocF）∷第3页菌株发生在我-精氨酸浓度为0.8 mM或更低，但不是更高水平（图。B)表明细菌精氨酸酶和巨噬细胞iNOS之间的竞争性抑制可以被过量底物的添加所淹没。使用WT和岩石（rocF）∷第3页突变株幽门螺杆菌26695（未显示）。
幽门螺杆菌精氨酸酶抑制NO2−RAW 264.7细胞生成。(A类)幽门螺杆菌SS1 WT（开口钢筋）或岩石（rocF）∷第3页（实心棒）与巨噬细胞在含有0.4 mM的DMEM-BSA中共同培养我-精氨酸的moi在10到100之间。NO的生产2−24小时后通过Griess反应在上清液中测定。数值表示为重复进行的四个实验的平均值±SEM。(B)幽门螺杆菌SS1 WT（□）或岩石（rocF）∷第3页（●）菌株以100个moi的比例添加到RAW 264.7巨噬细胞中我-精氨酸浓度。[否2−]培养24h后测量。数据表示重复进行的三个实验的平均值±SEM。对于A类和B, *,P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01; ***,P（P）<0.001幽门螺杆菌未配对WT vs.rocFaphA3突变株吨测试。(C类)幽门螺杆菌SS1 WT（开杆）或岩石（rocF）∷第3页(岩石（rocF）−; 固体棒）在0.4 mM的存在下培养我-精氨酸。24小时后[我-精氨酸]通过HPLC分析进行评估。数据表示一式三份的两个单独实验的平均值±SEM。**，P（P）与单独培养基和岩石（rocF）∷第3页Student–Newman–Keuls多重分析比较得出的应变。(D类)RAW 264.7巨噬细胞RNA的Northern blot分析幽门螺杆菌SS1 WT和岩石（rocF）∷第3页突变体(岩石（rocF）−)以100的摩尔分数。6小时后，采集巨噬细胞的总RNA，每条泳道加载10μg。将印迹依次与小鼠iNOS和人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）探针杂交。
通过使用NO分析仪（NOA 280），我们验证了总NO代谢物减少了3.1±0.1倍(P（P）< 0.05,n个=6）幽门螺杆菌在0.4 mM下进行的研究中，将SS1 WT与精氨酸酶缺乏菌株进行比较我-精氨酸和moi为100。
单靠巨噬细胞不能产生可检测到的NO水平2−和iNOS选择性抑制剂，n个-亚氨基乙基-我-赖氨酸，完全抑制巨噬细胞NO2−突变体和WT的反应产物幽门螺杆菌菌株（未显示）。NO的差异2−暴露于WT或岩石（rocF）∷第3页不归因于巨噬细胞存活率的变化，这是通过使用台盼蓝排除法的细胞计数或使用组蛋白-DNA片段化ELISA分析巨噬细胞凋亡来确定的。
利用我-精氨酸（WT）和精氨酸缺乏菌株幽门螺杆菌.
HPLC分析用于评估我-含有精氨酸的细胞培养基中精氨酸浓度幽门螺杆菌.24小时后，我-WT培养物中精氨酸浓度显著降低幽门螺杆菌，但不在岩石（rocF）突变菌株（图。C类). 这些数据支持以下假设：幽门螺杆菌精氨酸酶有效降低我-精氨酸，通过iNOS底物可用性的丧失，导致巨噬细胞NO生成减少。
诱导巨噬细胞iNOS mRNA表达幽门螺杆菌WT和岩石（rocF）∷第3页.
iNOS Northern印迹分析用于排除WT与岩石（rocF）∷第3页的突变体幽门螺杆菌.通过以下方式刺激巨噬细胞幽门螺杆菌SS1 WT和rocF公司∷第3页与未刺激巨噬细胞中未检测到的基础iNOS水平相比，iNOS mRNA水平显著增加（图。D类). 因为我们已经证明iNOS mRNA水平与iNOS酶活性直接相关幽门螺杆菌刺激(11)这些数据表明，细菌精氨酸酶调节巨噬细胞NO的生成独立于对iNOS表达的影响。
的影响幽门螺杆菌NO上的精氨酸酶2−由IFN-γ激活的巨噬细胞产生。
为了确定细菌精氨酸酶是否可以通过抑制巨噬细胞NO而不受巨噬细胞刺激过程的影响，我们用IFN-γ预处理RAW 264.7细胞，然后添加幽门螺杆菌.以集中依赖的方式，幽门螺杆菌SS1 WT抑制巨噬细胞NO2−由预激活细胞产生（图。). 相反，精氨酸酶缺乏幽门螺杆菌rocF∷第3页不影响NO2−水平。这些数据强烈表明，细菌精氨酸酶通过预制iNOS抑制NO释放。
幽门螺杆菌精氨酸酶抑制NO2−由预先激活的巨噬细胞产生。用IFN-γ（100单位/ml）刺激RAW 264.7巨噬细胞24小时幽门螺杆菌SS1 WT（开口钢筋）或岩石（rocF）∷第3页在含有0.4 mM的介质中添加（实心棒）我-精氨酸moi为10、100或1000。[否2−]6小时后在上清液中进行评估。值表示为重复进行的六个实验的平均值±SEM。**，P（P）< 0.01; ***,P（P）<0.001，适用于幽门螺杆菌第1阶段岩石（rocF）∷第3页与未成对WT相比吨测试。
现场幽门螺杆菌-含有精氨酸酶是抑制巨噬细胞NO所必需的2−生成。
为了进一步评估幽门螺杆菌为了防止NO的产生，我们用不同的幽门螺杆菌准备工作。添加热杀菌细菌、水提取物或幽门螺杆菌导致WT对NO生成的抑制作用丧失幽门螺杆菌（表). NO的预防2−释放发生时完好无损幽门螺杆菌或者用过滤支架将细菌从宿主细胞中分离出来。这些数据表明，iNOS的功能抑制需要活菌，但不需要与巨噬细胞接触。因此，有活力的细菌有效地消耗我-精氨酸可在细胞外环境中获得，从而有效抑制NO的生成。
表1
不同制剂的效果幽门螺杆菌SS1和SS1岩石（rocF）∷第3页在NO上2−RAW 264.7巨噬细胞生成
| 准备 | [否2−]，微米
| 增加折叠次数 | P（P） |
|---|
| 第一阶段 | 第1阶段岩石（rocF）∷第3页 |
|---|
| 细菌，未经处理 | 2.5 ± 1.1 | 17.3 ± 1.8 | 6.8 | <0.0001 |
| Transwell中的细菌 | 5.9 ± 1.9* | 19.1 ± 1.5 | 3.2 | 0.0002 |
| 煮沸的细菌 | 26.3 ± 4.6 | 30 ± 4.8 | 1.1 | NS公司 |
| 水提取物 | 19.6 ± 1.2 | 17 ± 2.1 | 1.1 | NS公司 |
| 法国压榨裂解液 | 22.3 ± 3.3 | 21.3 ± 3.8 | 0.9 | NS公司 |
细菌精氨酸酶对宿主细胞NO生成的调节幽门螺杆菌生存机制。
NO杀死微生物的能力使其成为原始宿主防御的重要组成部分。因为我们发现只有活着幽门螺杆菌可以调节我-iNOS的精氨酸底物可用性，我们推断细菌精氨酸酶有助于幽门螺杆菌。我们测试了幽门螺杆菌精氨酸酶对一氧化氮介导的幽门螺杆菌通过巨噬细胞。与RAW 264.7巨噬细胞共培养24小时后，幽门螺杆菌SS1 WT没有任何存活损失（图。A类)而精氨酸酶缺失突变株的大肠杆菌免疫单位减少了5个对数级以上（图。B). 为了证明幽门螺杆菌不依赖，我们暴露了岩石（rocF）∷第3页从WT或iNOS获得的常驻腹膜巨噬细胞菌株−/−老鼠。尽管WT巨噬细胞的存活率下降了450倍以上（图。C类)，没有杀死精氨酸酶缺乏者幽门螺杆菌与iNOS共培养后−/−巨噬细胞。
幽门螺杆菌通过精氨酸酶活性逃避巨噬细胞衍生NO的影响。幽门螺杆菌重量(A类)或rocF公司∷第3页(B)菌株在巨噬细胞（mφ）存在下单独培养或在过滤器支架上培养，其moi为100和0.4 mM我-培养基中的精氨酸。集落形成单元和NO2−共培养24h前后测定浓度。四份独立实验的结果用平均值±SEM表示。**，P（P）与Mann–Whitney的单独培养基相比<0.01U型测试。不2−SS1WT的水平为5.8±0.7μM，SS1的水平为20.3±1.2μMrocF公司∷第3页. (C类)幽门螺杆菌第1阶段岩石（rocF）∷第3页从WT或iNOS向腹腔巨噬细胞添加过滤器支架−/−moi为100的小鼠，0.4 mM我-培养基中的精氨酸。**，P（P）<0.01，作者：Mann–WhitneyU型测试。不2−WT和iNOS的水平分别为16.3±2.5μM和2.1±0.1μM−/−腹腔巨噬细胞。
讨论
iNOS衍生NO是对病原体先天免疫反应中的一个中心效应分子。我们当前研究的一个主要发现是细胞外幽门螺杆菌可被活化的巨噬细胞释放的NO杀死。我们证明了这一点幽门螺杆菌精氨酸酶与宿主细胞iNOS竞争共同底物我-精氨酸。因此，WT幽门螺杆菌防止宿主细胞产生NO。精氨酸酶缺乏幽门螺杆菌不能限制巨噬细胞NO的生成，并被巨噬细胞衍生NO有效杀死。这些观察结果与iNOS转录调控的任何影响无关。我们认为我们的结果代表了细胞外感染细菌免疫逃逸的独特途径的描述，利什曼原虫具有精氨酸酶活性；然而，这是一种专性细胞内寄生虫，精氨酸酶的生物学重要性与NO合成的调节无关(25). 哺乳动物精氨酸酶在宿主与病原体的相互作用中也能调节NO的生成，但我们的数据表明，原核生物精氨酸蛋白酶也能产生同样的作用。
WT对巨噬细胞NO生成的抑制作用幽门螺杆菌发生在生理浓度为我-精氨酸(7)和模拟记录条件的mois体内(26)支持我们观察到的数据具有直接相关性的可能性体内事实上，SS1rocF公司当前研究中使用的突变株削弱了小鼠的定殖能力(18). 这一发现提出了iNOS衍生NO在幽门螺杆菌感染体内因为我们之前已经证明iNOS表达在人类中上调幽门螺杆菌胃炎(12)，我们感染了iNOS−/−小鼠和带有WT SS1的WT C57BL/6小鼠。我们发现，尽管iNOS在WT小鼠胃中的表达一致，但在定植水平或组织损伤评分方面没有显著差异（K.T.W.，未发表的观察结果）。基于体外这里提供的数据，我们假设iNOS缺乏小鼠和WT小鼠在幽门螺杆菌感染可能与幽门螺杆菌精氨酸酶通过iNOS调节WT小鼠粘膜NO合成。有了这个独特的见解，我们实验室已经开始进行实验，以比较岩石（rocF）∷第3页iNOS中的WT SS1菌株−/−与WT小鼠相比，WT小鼠有望确定宿主iNOS诱导和幽门螺杆菌精氨酸酶体内试验。幽门螺杆菌位于胃粘膜层的胃上皮附近，这导致iNOS在上皮和固有层中表达(12). 因此，很可能幽门螺杆菌由于细菌和iNOS表达细胞之间的密切相互作用，精氨酸酶可以直接调节iNOS衍生的NO水平。胃液中还存在由唾液硝酸盐和亚硝酸盐酸化引起的非酶形成的NO，但这不太可能在幽门螺杆菌由于细菌在粘液层中的位置而存活。
氨基酸代谢对幽门螺杆菌增长(27).我-精氨酸不是由幽门螺杆菌因此，细菌必须从细胞外来源获得这种氨基酸(28). 实际上，我-精氨酸是人体完全消耗的氨基酸之一幽门螺杆菌肉汤培养(29,30). 通过直接分析我-精氨酸的利用，我们发现幽门螺杆菌消耗≈70%我-精氨酸在细胞培养基中24小时以上可用我-精氨酸很可能是幽门螺杆菌在无血清DMEM的最低培养基中。尽管如此，我们的数据表明我-WT消耗精氨酸幽门螺杆菌菌株解释了宿主NO生成的抑制。巨噬细胞iNOS缺乏显著的NO生成，尽管残余水平为0.1 mM我-培养基中的精氨酸可能是由以下因素引起的我-巨噬细胞对精氨酸的摄取或代谢我-精氨酸通过其他生化途径。WT对NO生成抑制作用的丧失幽门螺杆菌热处理与精氨酸酶的变性相一致。水提取物或法国压榨裂解物对NO生成缺乏影响与活性丧失一致我-精氨酸转运(31)因为精氨酸酶与细胞膜有关，所以可以通过精氨酸酶类进行后续代谢，或者在离心裂解液后细菌精氨酸蛋白酶的损失(32). 我们对我-暴露于培养基中的精氨酸水平幽门螺杆菌表明活菌能有效地消耗我-精氨酸可在细胞外环境中获得，为减少巨噬细胞NO生成提供了一种手段。
细菌已经发展出各种机制来逃避免疫系统的影响。例如，细胞内病原体，洋葱伯克霍尔德菌导致囊性纤维化患者肺部感染的，似乎通过抑制宿主NO的生成来提高巨噬细胞凋亡后自身的存活率，但其机制尚未建立(33). 对于NO，大肠杆菌通过上调soxR公司是抵抗氧化应激所必需的基因(34).幽门螺杆菌类似地，他们开发了防御氧化应激的策略，例如组成性表达超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，这两种酶分别对超氧阴离子和过氧化氢解毒(35)和烷基过氧化氢还原酶(36)，对过氧亚硝酸盐进行解毒。因此，幽门螺杆菌精氨酸酶并不是提高细菌存活率的唯一潜在策略，但它有几个不寻常的特性：它不是抵抗有毒自由基，而是阻止NO的生成，并且它不需要从头开始基因转录。与其他细菌的诱导性精氨酸酶相反(37,38)和酵母(39),幽门螺杆菌精氨酸酶组成性表达(29). 它的活性存在于迄今为止测试的所有菌株中(18,32)表明精氨酸酶在幽门螺杆菌作为一种重要的酶。
通过抑制宿主NO生成幽门螺杆菌不仅可以保护细菌，还可以防止粘膜损伤。高水平的NO和过氧亚硝酸盐可杀死真核细胞并导致DNA损伤(40,41)和脂质过氧化(42). 通过消耗限制主机NO生产我-精氨酸可能是成功适应幽门螺杆菌胃粘膜的生态位。宿主生命中的慢性感染将受益于宿主粘膜破坏的限制，这被比作一种寄生形式(43)在以下情况下幽门螺杆菌.
致谢
这项工作得到了美国国立卫生研究院DK53620（向K.T.W.）、DK02469（向K.T.W.提供）、DK56938（向K.S.W提供）、AI25567（向H.L.T.M.提供）和AI10098-01（向D.J.M.）的支持；以及退伍军人事务部医学研究办公室（K.T.W.）。
缩写
| iNOS系统 | 诱导型一氧化氮合酶 |
| 重量 | 野生型菌株幽门螺杆菌 |
| 莫伊 | 多重感染 |
脚注
这篇论文是直接提交给PNAS办公室的（第二轨道）。
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