口服非病毒基因递送用于慢性蛋白质替代治疗

摘要

1.简介

口服基因传递可能提供许多有趣的治疗选择。基因可以通过口服来治疗局部疾病，如炎症性肠病¹和结肠癌，²以及血友病等全身性疾病。^三此外，由于胃肠道（GI）中有大量的免疫诱导组织，这将是一种有趣的DNA疫苗接种方式。²由于患者的依从性和可重复用药，这也是最具吸引力的分娩方式。换言之，非病毒传播将是未来的发展方向。然而，尽管有一线希望，⁴,⁵非病毒口服基因传递的成功一直是难以捉摸的。

由于胃肠道中的生理（苛刻的胃pH值和许多降解酶）和解剖（粘膜上皮）屏障，基因载体的口服给药面临着最具挑战性的障碍之一。此外，肠上皮细胞的快速自我更新（2-3天）会阻止持续的治疗基因表达。⁶因此，要治疗糖尿病等慢性疾病，非病毒载体必须通过粘膜上皮传递，通过血流传递，然后在全身组织中积累，从而有机会延长观察到的典型转基因表达数天。

壳聚糖（CS）对细胞毒性低，是一种有吸引力的基因载体⁷和可调的物理化学特性。改变分子量(M（M） _W公司)CS的脱乙酰度（DA）可以在生理pH下生成具有不同生物降解性和电荷密度的多糖。当pH低于6时，CS可以很容易地复合质粒DNA（pDNA）、小干扰RNA（siRNA）或微RNA（miRNA）形成纳米粒子（NP；多聚酶）。然而，与许多其他非病毒基因载体相比，CS的体外转染效率一般。CS息肉细胞内的缓慢解封是主要原因之一。⁸,⁹,¹⁰然而，尽管20多年来对替代品进行了研究，但在口服基因传递方面，还没有比CS更好的候选者。化学稳定性以及因此导致体外转染不良的多聚酶解包速度缓慢，可能有助于通过口腔途径进行导航，且降解程度最低。已知CS的黏附性也可能有助于延长其在胃肠道的滞留时间，以促进肠道上皮的吸收和转运。¹¹这导致了CS用于开发口服DNA疫苗。然而，CS的转染效率必须提高，以获得任何翻译机会。聚乙烯亚胺（PEI）是最有效的基因载体之一，因为它在酸性内体pH下具有高缓冲能力。¹²支链结构的标准PEI组合物（bPEI）具有M（M） _W公司然而，（25 kDa）对于体内应用来说毒性太大。¹³下部的bPEIM（M） _W公司（600–1800 Da）毒性较小，但效率也较低。¹⁴

尽管之前的研究已经研究了将bPEI接枝到CS以提高CS的转染效率，但只有在广泛筛选后，我们才得出一种成分，包括高密度PEI接枝至低密度M（M） _W公司CS可以实现有效的口服非病毒基因传递。在这项研究中，我们报道了含有CS的非病毒口腔基因载体的开发(M（M） _W公司=15 kDa和DA=85%）接枝bPEI(M（M） _W公司=0.8 kDa），高接枝取代度（DS≈40%）（CS‐g‐bPEI），用于口服胰岛素pDNA。在对绿色荧光蛋白（GFP）报告基因进行体外表征和体内优化后，我们发现CS‐g‐bPEI/pDNA NPs可以有效地传递人胰岛素质粒，以降低链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠的血糖水平(图 1 ). 经口灌胃给药的NP中单剂量600µg胰岛素pDNA可将糖尿病小鼠的血糖降低至基线水平的50–80%，持续10天。间隔10天再重复两次给药，可在降低血糖水平方面产生相同的治疗效果，且无明显肝毒性。

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图1

合成CS‐g‐bPEI共聚物，制备CS‐g-bPEI/pDNA NPs，使用口服喂食针口服制备好的NPs，NPs跨肠上皮细胞转运，在肝脏中系统细胞转染以表达胰岛素，以及糖尿病小鼠肌肉细胞中胰岛素刺激的葡萄糖利用。

2.结果

2.1. CS-g-bPEI的合成与表征

传统的PEI接枝到CS的方法基于多相反应，通常导致低接枝DS（≈5–20%）。¹⁵,¹⁶在本研究中，在均匀的水环境中，采用两步工艺合成了CS‐g‐bPEI共聚物。简单地说，CS（15 kDa）首先与预定量的琥珀酸酐反应，得到在N个主干上的位置（图​（图1）。1). 低利率M（M） _W公司然后在过量的1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDC）存在下，将bPEI（0.8 kDa）与制备的琥珀酸CS的羧基偶联/N个羟基琥珀酰亚胺（NHS），确保几乎所有的琥珀酰基团都与bPEI（CS‐g‐bPEI）偶联。简洁的CS光谱在2.4 ppm时产生了信号，这是¹CS的H NMR谱和可归因于琥珀酰基团上的亚甲基质子，验证了琥珀酰基可替换到CS主链上(图 2 A） ●●●●。CS结构中琥珀酰基团的DS由亚甲基质子积分峰（-CH）的比值获得₂中国₂-)琥珀酰基团为2.4 ppm，CS主链上H‐2质子的积分峰为3.0 ppm。使用均相反应条件代替非均相反应条件以获得更高的产率和更好的DS控制，¹⁷合成了一系列不同DS（≈10%、30%、40%、50%和70%）的琥珀酸CS，在2.67~3.26ppm范围内表现出较强的质子信号，属于宽峰（-NCH₂中国₂-)bPEI的。¹⁸

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图2

CS‐g-bPEI共聚物和CS‐g‐bPEI/pDNA NP的理化性质。CS、琥珀酸CS和CS‐g‐bPEI:A）的特性¹H NMR光谱和B）傅里叶变换红外光谱（FT-IR）光谱。C） CS、bPEI（25 kDa）和CS‐g‐bPEI与bPEI的各种DS的缓冲能力。使用D）CS‐g‐bPEI:pDNA重量比固定在6:1，不同的bPEI和E）DS不同的CS‐g-bPEI40%：pDNA重量比率制备的CS‐）g-bPEI/pDNA NP的大小和zeta电位(n个=每组6人；误差条表示标准偏差）与CS组相比具有统计学意义(对< 0.05).

FT-IR光谱的结果与从¹H NMR分析（图​（图2B）。2B） ●●●●。琥珀酸CS的FT-IR光谱在1567厘米处出现峰值⁻¹CS光谱中没有，对应于羧基（-COO⁻)琥珀酰基团（图​（图2B）。2B） ●●●●。在CS‐g‐bPEI光谱中，1567 cm处的吸收峰⁻¹bPEI特征峰位于1470 cm⁻¹（亚甲基C-H弯曲），2979厘米⁻¹（亚甲基N-H弯曲），3415厘米⁻¹（N-H拉伸）¹⁶从而证实了琥珀酸CS上的琥珀酰基团与bPEI偶联。

2.4. CS‐g‐bPEI/pDNA NPs的转染效率和细胞毒性

针对HT1080细胞和血清富集培养基（10%胎牛血清；FBS）进行评估，该培养基通常用于在体内使用前评估非病毒载体的血清耐药性。¹⁹荧光激活细胞分选仪分析显示，在CP:pDNA比率为6:1时，CS-g-bPEI-40%DS的性能最佳(图 三 A、 B）。值得注意的是，它的细胞毒性大大低于25kDa bPEI（图​（图3C）。三C） ●●●●。将DS保持在40%不变，转染效率也随着CP:pDNA比率的增加而增加，在10:1到15:1左右达到峰值，再次超过25kDa bPEI，荧光强度增加了7.5倍（图​（图3D，E）。三D、 E）。细胞毒性确实随着CP:pDNA比率的增加而增加，但即使在最高比率为20:1时，细胞毒性仍比25kDa-bPEI低两倍以上。上述结果表明，CP:pDNA重量比为12:1的测试NP具有最高水平的基因表达（图​（图3E）三E） 和有限的乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性（图​（图3F）三F） 因此被选作后续实验。

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图3

就转染效率和细胞毒性而言，优化CS‐g‐bPEI/pDNA NPs的配方。bPEI的DS对CS‐g‐bPEI:A）荧光图像的影响；B） 转染效率；和C）LDH细胞毒性。CS-g-bPEI40%：pDNA重量比：D）荧光图像的影响；E） 转染效率；和F）LDH细胞毒性。*：统计意义重大(对< 0.05); ‡: 与CS组相比，具有统计学意义（P<0.05）。£:与bPEI组相比具有统计显著性(对< 0.05).

2.5. CS‐g‐bPEI/pDNA NP在特定pH环境中的物理稳定性

CS‐g‐bPEI/pDNA NP在pH值为2.0–7.4的范围内的物理稳定性代表了胃肠道不同部分的pH条件，通过透射电子显微镜（TEM）和DLS进行了表征。图 4 A、 B表明CS‐g‐bPEI/pDNA NP在所有检查的pH条件下保持其形状；此外，DLS数据显示，粒径和zeta电位在整个pH范围内保持近似恒定。

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图4

CS‐g‐bPEI/pDNA NP在模拟其通过胃肠道转运的不同体外环境中的物理稳定性、pDNA保护和跨细胞能力。NPs在不同pH条件下的物理稳定性：A）TEM图像和B）粒径和zeta电位；C） 在各种pH环境中保护NP的pDNA，并使用DNase I和溶菌酶进行核酸酶消化。4或37°C时Caco‐2细胞单层中NP的细胞吞噬能力，通过D）TEER减少进行评估，E）跨细胞渗透，使用构建的3D CLSM图像进行可视化，以及F）对 _应用程序值。黑色箭头表示从顶端层到基底外侧层的方向。*：统计意义重大(对< 0.05).

2.8. CS‐g‐bPEI/pDNA NPs的系统积累及其转基因表达

在用CS‐g‐bPEI/pDNA NP在去离子（DI）水中的悬浮液口服治疗小鼠后，使用体内成像系统（IVIS）检查NP的生物分布。为了追踪NP并评估其在全身组织中的转基因表达，用Cy5荧光标记CS‐g‐bPEI共聚物，并将pEGFP用作模型基因。口服治疗后12小时(图 5 A） 在包括肝脏和肾脏在内的全身组织中检测到Cy5‐CS‐g‐bPEI/pEGFP NPs，表明至少有一部分口服NPs越过肠道屏障进入体循环。使用巨噬细胞标记物F4/80的免疫荧光分析表明，CS-g-bPEI/pDNA NPs被F4/80内化⁺库普弗电池（如图中白色箭头所示​图5B）5B） 或沿肝窦滞留。口服治疗48小时后，在肝脏中可以清楚地观察到GFP的表达（图​（图5C）。5C） ●●●●。尽管有一组报告称，由于肾脏从心脏接收大量血液，因此与其他器官相比，肾脏会收集更多的全身循环微粒，²⁵我们没有在肾脏中检测到任何基因表达，这与其他报道一致，即肾脏可能是由具有连续内皮屏障的毛细血管灌注的。²⁶,²⁷

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图5

CS‐g‐bPEI/pDNA NP在小鼠体内的生物分布和组织表达动力学：A）口服裸pDNA或NP后12 h，测试NP在隔离的主要器官中累积的体外荧光图像；B） 肝切片中检测NPs和Kupffer细胞的共定位；C） 口服裸pDNA或NP 48小时后，测试NP在分离的主要器官中表达的体外荧光图像；D） 口服单剂量裸胰岛素质粒或胰岛素质粒NP后主要组织中胰岛素的免疫染色。

2.10. CS‐g‐bPEI/pDNA NPs降低血糖水平

进行了一项研究，以确定CS‐g‐bPEI/pDNA NPs表达的胰岛素水平是否能够降低糖尿病小鼠的血糖水平。根据图 6 A、 单剂量口服NPs能够确保血浆中显著水平的人胰岛素表达约10天，有效降低血糖水平。值得注意的是，每10天重复给糖尿病小鼠注射一次NP也可以获得类似的结果。

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图6

口服去离子水（未经治疗的对照）、裸胰岛素质粒或胰岛素质粒NPs的糖尿病小鼠中的人胰岛素表达和胰岛素刺激的葡萄糖利用：A）表达血浆人胰岛素水平和血糖水平随时间的变化；B） PET/CT图像显示¹⁸肌肉组织中F-FDG摄取和半定量累积放射性浓度。图像显示前视图（ANT）、右视图（RT）、后视图（POST）和左视图（LT）的标准摄取值（SUV）。*：统计意义重大(对< 0.05).

2.12. 急性肝脏毒性

为了确定积聚在肝脏中的CS‐g‐bPEI/pDNA NP是否会诱发任何急性肝毒性，在重复口服试验NP之前，采集并分析血液样本，以评估不同时间点的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性，以及在研究结束时。接受裸胰岛素质粒的小鼠和未经处理的小鼠为对照组。如所示图 7 A、 所有研究组的ALT和AST水平相似(对> 0.05). 对采集的肝组织样本进行组织学评估，以确定测试NP是否导致组织损伤或炎症。根据图​图7B，7B、 肝标本中肝细胞显示正常，未见明显炎性浸润。

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图7

反复口服去离子水、裸胰岛素质粒或胰岛素质粒NPs对糖尿病小鼠肝功能和组织学的影响：A）血清ALT和AST水平与时间的关系，B）肝脏切片的典型显微照片（H&E染色）。n.s.：不重要(对> 0.05).

3.讨论

自2012年欧洲药物管理局批准使用腺相关病毒治疗罕见的脂蛋白脂肪酶缺乏性遗传病以来，基因治疗正在复苏。一些使用病毒载体治疗包括视网膜营养不良、脊髓性肌萎缩和X连锁肾上腺脑白质营养不良在内的疾病的晚期临床试验也正在进行中。²⁹虽然这一令人兴奋的进展正在实现基因治疗的潜力，特别是一次性给药，但长期应用可能仍需要非病毒基因载体来传递。然而，非病毒基因传递面临着体内转染效率低和瞬时转基因表达的固有弱点。这需要频繁的行政管理才能有效。反过来，这将要求给药途径方便，使慢性应用的非病毒基因治疗具有吸引力。口服将是首选。

口服非病毒载体进行基因传递必须克服其在胃肠道转运过程中的各种困难，例如载体在特定pH条件下的物理稳定性，载体携带的pDNA在恶劣胃肠环境中的保护，以及载体通过肠上皮细胞的转胞作用。自从pK（K） _一bPEI约为8.4，³⁰CS‐g‐bPEI共聚物在广泛的pH值范围内显示出正电荷，使得CS‐g-bPEI和pDNA的复合物在胃肠道的各种pH环境中保持稳定（图​（图44A、 B）。

裸露的核酸可以在胃酸pH下变性，并被肠道中的酶降解，从而降低其有效性；这些效应可能会抑制靶细胞的功能传递。³¹凝胶阻滞试验表明，阳离子CS‐g‐bPEI共聚物具有较强的pDNA结合能力，对pDNA具有高度的保护作用；因此，CS‐g‐bPEI载体有效地保护pDNA在胃肠道恶劣环境中免受酸性变性和酶降解。在转运过程中，增强颗粒对胃pH值和肠道酶降解的稳定性将提高目标细胞的摄取概率，提高转染效率。

体内有效系统细胞转染的先决条件是，口服载体必须穿过粘膜上皮进入血流，最终积聚在全身组织中。在体外Caco‐2细胞单层中研究了CS‐g‐bPEI NPs通过肠上皮转运的潜在机制。基于图​图4D、F、，4D、 F，确定了CS‐g‐bPEI/pDNA NP跨Caco‐2细胞转运的能量依赖性机制，转运机制涉及跨细胞作用。这与文献一致，即具有正zeta电位的NP通常在细胞转染中有效。³²

离体荧光图像显示口服给药的Cy5‐CS‐g‐bPEI/pEGFP NP在肝脏中的积聚（图​（图5A），5A） 验证了一些测试颗粒已经通过肠绒毛沿线的上皮细胞被血液吸收，从那里进入肝脏。在肠道吸收后，营养化合物通过肝门静脉直接输送到肝脏。³³哺乳动物的肝脏含有许多常驻巨噬细胞（库普弗细胞），这些巨噬细胞能有效地吸收和保留血液中循环的异物（图​（图55B） ●●●●。³⁴随后在肝脏中清楚地观察到转基因表达（图​（图5C），5C） 这表明Kupffer细胞是表达胰岛素的细胞类型之一。沿着肠绒毛的上皮细胞也可能起到蛋白工厂的作用，将胰岛素分泌到血液中（图​（图55D） ●●●●。

肝脏中表达的胰岛素对调节葡萄糖稳态至关重要。³³生理上，胰岛内源性分泌的胰岛素通过门脉循环输送到肝脏。²⁸体内研究表明，口服胰岛素质粒NP可在STZ诱导的糖尿病小鼠中产生持续的治疗基因表达，胰岛素表达水平足以改善糖尿病小鼠10天以上的高血糖（图​（图6A）。6A） ●●●●。我们发现，表达的胰岛素增加了肌肉细胞质膜上葡萄糖转运蛋白（谷氨酸4）的浓度，²⁸促进他们的血糖(¹⁸F‐FDG）利用率（图​（图6B），6B） 从而降低血糖水平。基因治疗的一个优点是可以减少维持治疗药物浓度所需的给药次数。³⁵重复口服胰岛素质粒NPs后，进一步证实糖尿病小鼠体内胰岛素的充分表达，这表明这种新的非病毒基因传递系统可能适用于慢性蛋白替代治疗。

在安全性研究中，用胰岛素质粒NP重复三次给药未引起血清ALT/AST活性的任何显著变化或肝脏中任何可检测到的组织学变化（图​（图7A、B），7A、 B），表明这些NP的肝毒性没有问题。

非病毒口服基因传递的一个限制是喂食和转基因表达之间的滞后时间。虽然这与药物治疗中口服药物与静脉注射没有区别，但由于基因转移过程中的所有细胞内屏障和分子处理，基因治疗中的延迟加剧了。因此，它无法满足糖尿病治疗中随需应变和快速反应的要求；它只适用于基础补充剂，以减少所需的注射并防止低血糖事故。然而，在慢性蛋白质替代治疗中，这一问题并不严重，因为频繁的口服给药是可能的。本研究的另一个局限性是，由于口服制剂技术很难应用于小鼠，因此我们尚未探索宏观制剂来改善NP向胃肠道的传递。在较大的动物中，当然在人类中，NP可以用带有肠溶涂层和辅料的明胶胶囊包装，以保护NP在通过胃的过程中不被降解。大剂量制剂可能会进一步提高这种口服基因传递系统的功效。

研究中开发的CS‐g‐bPEI共聚物可能适用于重复口服其他治疗基因。基于这一低毒性发现，很容易推测这种新的基因传递系统可能会在siRNA或miRNA治疗中得到应用。然而，高PEI嫁接密度是否会产生良好的细胞内解封动力学以产生治疗效果尚待观察，该密度在本研究中起到良好的作用，但可能会更紧密地结合较短的siRNA或miRNA。然而，利用本研究所示的化学性质，可以很容易地优化聚乙烯亚胺在CS上的接枝密度。

这种非病毒口服基因传递系统的翻译潜力需要在涉及大型动物的进一步临床前实验和长期研究中进行评估，以证明其安全性和有效性。此外，还必须解决涉及这些聚合物NP大规模生产和质量控制的生物制造问题。最近的研究表明，闪光纳米复合可能特别适合制造这些纳米颗粒。³⁶,³⁷自从第一份报告提出使用非病毒载体通过口服产生治疗效果的可行性以来，已经有20年的时间了。⁷随后的几年只产生了因疗效不佳和再现性低而备受困扰的希望。这项研究表明，CS上的高电荷密度对克服这些缺点至关重要。

4.结论

尽管在过去二十年中，CS作为基因载体进行了广泛研究，但它一直受到口服基因传递效率和再现性差的困扰，直到目前的研究表明，CS上的低分子量bPEI高密度嫁接可以克服具有挑战性的口服传递障碍。在本研究中，我们通过口服单剂量NPs（600µg质粒胰岛素（pINS）），证明了在10天以上保护糖尿病小鼠免受高血糖的影响。间隔10天重复给药，一个月内产生降糖效果，未检测到肝毒性。本研究提供了一个平台，在此平台上可以建立非病毒口服核酸治疗药物。

5.实验段

材料：CS(M（M） _W公司=15 kDa），≈85%DA购自Koyo Chemical Co.Ltd.（日本兵库），而琥珀酸酐bPEI(M（M） _W公司=0.8和25 kDa）、EDC和NHS均来自Sigma‐Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。研究中使用的pEGFP-N2（4.7 kb）和INSL4（5.3 kb）质粒分别购自Clontech（加利福尼亚州帕洛阿尔托）和OriGene（美国马里兰州罗克维尔）。所有其他化学品和试剂均为分析级。

质粒制备：使用DH5α分别扩增pEGFP‐N2和INSL4质粒，然后使用Qiagen Plasmid Mega Kit（美国加利福尼亚州巴伦西亚）按照制造商的说明进行纯化。通过凝胶电泳（1.0%琼脂糖）分析扩增质粒的纯度，并使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE，USA）测量其浓度。

CS-g-bPEI的合成与表征：开发了在均匀水环境中合成CS‐g‐bPEI共聚物的两步工艺。在第一步中，将预定量的琥珀酸酐（0.4、1.2、2.0、2.8或3.6 g）添加到含水CS（1.0 g CS溶于2%乙酸，80 mL）中。在室温下搅拌1小时后，将混合物调节至pH值7.0，然后通过添加乙醇沉淀。将沉淀（具有各种DSs的琥珀酸CS）过滤，用过量乙醇洗涤，并在真空中干燥。在第二步中，将琥珀酸CS（0.1 g）和bPEI（0.8 kDa，1 g）溶解在去离子水中（9 mL）；通过添加1，将混合物的pH值调整为5.5n个将HCl、EDC（0.29 g）和NHS（0.035 g）通过磁力搅拌添加24 h以启动反应。将合成的CS‐g‐bPEI与去离子水进行透析3 d，以去除未结合的bPEI。琥珀酸CS和CS‐g‐bPEI共聚物的特征如下¹H NMR（Avance 500，Bruker DRX，Rheinstetten，德国）和FT‐IR（Perkin−Elmer Spectrum RX1 System，Buckingham shire，英国）。¹⁶

CS‐g‐bPEI的缓冲能力：通过酸滴定实验，将CS‐g‐bPEI共聚物的缓冲容量与未改性CS和bPEI（25 kDa）的缓冲容量进行了比较。¹⁸将试验聚合物分别溶解在20 mL 0.15中米氯化钠溶液，以获得0.2 mg mL的最终浓度⁻¹; 然后使用0.1将每种试验溶液的pH值调整为10.0n个氢氧化钠。然后用0.1滴定样品溶液n个盐酸滴注，并使用pH计监测溶液的pH值。对照组为不含测试聚合物的氯化钠溶液。

CS‐g‐bPEI/pDNA NPs的制备和表征：将合成的CS‐g‐bPEI共聚物溶解在DI水中，得到1%w/v的储备溶液，将其储存在4°C下直至使用。通过使用移液管将25µL CS‐g‐bPEI水溶液（40、50、60、80、100或200µg）添加到等体积的pDNA水溶液（10µg）中，然后通过涡旋将混合物充分混合30 s，然后在室温下放置至少1 h，获得具有不同CP:pDNA重量比（范围为4:1至20:1）的测试NP。然后使用DLS（Zetasizer Nano‐ZS，Malvern，Wocestershire，UK）在去离子水中获得制备好的NP的尺寸和zeta电位。

CS‐g‐bPEI/pDNA NPs的转染效率和细胞毒性：GFP用于评估CS-g-bPEI/pDNA NPs在HT1080细胞系中的体外转染效率。将细胞接种在8.0×10的24孔板上过夜⁴每孔细胞数，然后以70-90%的合流率转染。转染前，去除培养基并补充0.3 mL完整培养基（补充有10%FBS的DMEM），该培养基含有浓度为1µg pDNA/孔的测试NP。转染24小时后，在荧光显微镜下观察细胞（Carl Zeiss Optical，Chester，VA，USA）或通过流式细胞术收集细胞以评估其转染效率（Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA。²⁰通过使用LDH细胞毒性检测试剂盒（德国曼海姆罗氏诊断有限公司）测量处理细胞胞液中释放的LDH活性，获得相应的细胞毒性。转染bPEI（25kDa）的细胞作为阳性对照，未处理的细胞作为未处理的对照。

CS‐g‐bPEI/pDNA NP在特定pH环境中的物理稳定性：为了确定CS‐g‐bPEI/pDNA NP在运输过程中的物理稳定性，通过TEM（JEOL 2010F，日本东京）检查了它们在用于模拟胃肠道的特定pH值下的形态变化；用DLS测定了它们的粒径和zeta电位。

CS-g-bPEI对pDNA的保护作用：CS‐g‐bPEI在各种pH条件（pH 2.0、6.0、6.6或7.4）下以NP形式保护pDNA（1µg）或抵抗肠道酶（首先是DNAse I（4µg mL）的能力⁻¹，25µL）或DNAse I，然后是溶菌酶（0.5 U mL⁻¹（pH 5.5，8µL）））。²⁰添加5µL 0.5终止酶降解米乙二胺四乙酸（EDTA）。通过凝胶电泳（1.0%琼脂糖凝胶）评估pDNA的完整性。

CS‐g‐bPEI/pDNA NP的细胞吞噬能量依赖性：使用Caco‐2细胞单层，在Costar Transwell的组织培养聚碳酸酯过滤器上生长，每板12孔，在体外研究温度对CS‐g‐bPEI/pDNA NP跨上皮转运的影响（美国纽约州科宁市科宁Costar Corp.）。³⁸在4或37°C下添加测试NP后，TEER的变化开始于600–800Ωcm的范围²，使用Millicell电阻系统（Millipore Corp.，Bedford，MA，USA）测量细胞单层的紧密性。

CS‐g‐bPEI/pDNA NP跨Caco‐2细胞单层的运输：在本研究中，使用标签IT Cy3核酸标记试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊市Mirus Corp.）合成了Cy3标记的pDNA；然后将这种Cy3-pDNA用于制备荧光NP。将荧光NP（每孔5µg pDNA）引入Caco‐2细胞单层的供体室。在4或37°C下培养3小时后，抽吸测试NP。固定后Z轴细胞单层的堆叠图像是使用反向CLSM（蔡司LSM780，卡尔蔡司，Jena GmbH，Jena，Germany）获得的。同时，从接收室提取样品；使用微孔板分光光度计（SpectraMax M5，Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA）和对 _应用程序值（cm s⁻¹)净现值的计算方法如别处所述。²²

动物研究：在动物实验中使用了ICR小鼠（约30 g，BioLasco，Ilan，台湾），实验是按照国家科学院出版社1996年出版的《实验动物护理和使用指南》进行的。国立清华大学机构动物护理和使用委员会批准了所有研究。

CS‐g‐bPEI/pDNA NP的生物分布及其基因转染：在生物分布研究中，根据制造商的协议（美国佛罗里达州布罗沃德Lumiprobe公司），使用Cy5‐NHS酯合成了Cy5标记的CS（Cy5­CS）；合成的Cy5‐CS用于制备荧光NP。为了防止自身荧光，在实验之前和实验期间，用不含苜蓿的特殊饮食喂养试验小鼠至少3天。使用口服喂食针，用手和口服含有1 mg pEGFP‐N2悬浮液（200µL）的荧光NP抑制通宵禁食的小鼠。在治疗后的预定时间间隔（12或48小时），处死试验小鼠，采集其器官并通过IVIS（美国加利福尼亚州阿勒米达市Xenogen）观察荧光NPs的生物分布或GFP的表达(n个=每组3人）。³⁹

Kupffer细胞和人胰岛素的免疫组织化学检测：为了检测肝组织中的Kupffer细胞，冷冻切片被固定，然后用5%的山羊血清在37°C下封闭1小时。切片在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中清洗后，用抗鼠F4/80抗体（eBioscience，San Diego，CA，USA）以1:100的稀释度孵育，然后是1:50稀释的Cy3偶联山羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。切片用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）进行复染，以显示细胞核。为了检测人类胰岛素，冷冻切片被固定，然后用Vector MOM试剂盒（Vector Laboratories Inc.，加利福尼亚州伯灵盖姆，美国）封闭。然后用小鼠抗DDK单克隆抗体（Origene，Rockville，MD，USA）以1:100的稀释度对切片切片进行染色，然后以1:50的稀释度用Dylight 633共轭山羊抗鼠IgG（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA。

葡萄糖降低作用：通过腹腔注射STZ（50 mg kg⁻¹d日⁻¹持续4天）。空腹血糖水平高于300 mg dL的小鼠⁻¹被视为糖尿病患者并纳入研究。⁴⁰将以下配方分别口服给糖尿病小鼠：去离子水（未经处理的对照）、裸胰岛素质粒（200µL去离子水中含有600µg pDNA）和胰岛素质粒NP（200μL去离子水中含600µgpDNA），每10天一次，共30天(n个=每组6个）。从尾静脉采集血样，并在禁食后4 h使用手持式血糖仪（美国加利福尼亚州米尔皮塔斯市LifeScan公司）测定空腹血糖水平。此外，还使用超敏胰岛素ELISA试剂盒（瑞典乌普萨拉，摩卡迪亚）分析了血浆胰岛素水平。

增强¹⁸F‐FDG利用率：通过给药评估葡萄糖利用率¹⁸口服含去离子水或胰岛素质粒的NP（600µg pDNA）后第2天，给相同的糖尿病小鼠服用F‐FDG（0.2 mL中11.1 MBq）。使用PET扫描仪在治疗后1小时获得动态PET图像（Siemens Medical Solutions，Knoxville，TN，USA）。使用2D有序子集期望最大化（OSEM）方法（4次迭代和16个子集）重建这些图像，并进行衰减校正。PET扫描后，使用NanoSPECT/CT（Bioscan，Washington，DC，USA）获得全身CT图像。²⁸3D图像，¹⁸使用图像工作站和PMOD 3.7版（瑞士苏黎世PMOD Technologies Ltd.）融合F-FDG PET和CT扫描。在以下组织上手动绘制感兴趣区域（ROI）：颈部肌肉、肩胛肌、咬肌、前腿肌肉和后腿肌肉。不同组织对示踪剂的吸收被量化为每克平均注射剂量百分比（%ID g⁻¹)，计算为ROI活性除以注射剂量乘以100%。

急性肝毒性：用去离子水（未经处理的对照）、裸胰岛素质粒或胰岛素质粒NP处理的动物的急性肝毒性是通过测量血清ALT和AST活性随时间变化而获得的。⁴¹肝脏活检标本固定在10%磷酸缓冲福尔马林中，嵌入石蜡中，切片厚度为5µm，然后用苏木精和伊红（H&E）染色。

统计分析：所有结果均以平均值±标准差表示。为了比较成对组之间的平均值，双尾Studentt吨使用了测试。差异被认为具有统计学意义对< 0.05.

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

支持信息

致谢

笔记

林P.Y。，Chiu Y.‐L。，黄J.‐H。，Chuang E.‐Y。，米弗勒。，林克杰。，Juang J.‐H。，宋浩伟。，梁家伟。，高级科学。2018,5, 170107910.1002/advs.201701079[PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]

参与者信息

兴文成，电子邮件：wt.ude.uhtn.xm@gnuswh.

Kam W.Leong，电子邮件：ude.aibmuloc@gnoel.mak.

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