PPAR（购电协议）-γ在大鼠脑出血模型中通过结合珠蛋白-CD163促进血肿清除

2.2. 动物治疗组、实验组和对照组

所有大鼠随机分为以下组：假手术组(n个=25），车辆组(n个=27），单胞菌素治疗组（10 mg/kg，每天两次，n个=26）和Glivec治疗组（100 mg/kg/天，n个= 29). 在最终评估之前，替换死动物。所有灌胃均在脑出血后6 h通过胃灌注进行，直至终点。

2.3. 大鼠脑出血模型

在头部立体定向仪下，将胶原酶IV注射到纹状体，制作脑出血模型[13]. 简单地说，实验大鼠用水合氯醛（300-350 mg/kg）腹腔注射麻醉。麻醉后，将大鼠置于立体定向仪（中国上海江湾1C型仪器）中。将一根1 mm的针头穿过颅骨的毛刺孔插入纹状体，参考框架如下：前0.5 mm，腹5.8 mm，前角外侧2.3 mm。然后，我们使用了5μL平头微量注射器（Hamilton 600，瑞士）注入0.5 U IV型胶原酶（Sigma-Aldrich，美国），该胶原酶溶解于2.5μL盐水。输液后，针头需要在里面再保持3分钟，然后慢慢拔出。假手术组2.5μ使用相同的方法注入L盐水。手术后，颅骨上的洞被封闭，头皮被很好地缝合。动物是在没有病原体的特定设施中饲养的。此外，他们可以不受控制地获取食物和水。

2.4. 大脑含水量

如前所述，对大鼠脑组织进行含水量测定[13]. 我们用4%水合氯醛腹腔注射对大鼠进行深度麻醉，然后将大鼠斩首，测量脑含水量。脑组织迅速从颅骨中取出，然后在穿刺点周围分成4 mm的切片。我们从同侧基底神经节采集的所有脑组织样本立即用电子微量天平称重，以确定湿重（Ww）。然后将组织置于100°C的干燥箱中48小时以干燥。然后，我们可以得到干重（Dw）。脑含水量按以下公式计算：（Ww−Dw）/Ww×100%。

2.5. 血红蛋白测定

在制造商的指导下，通过血红蛋白分析测定脑出血后脑血红蛋白的定量。简单地说，将成功的建模大鼠处死，并迅速取出脑组织，分别放入四个玻璃器皿中。总计1000μ将L预冷冻PBS缓冲液添加到每个玻璃皿中。通过超声波粉碎脑组织，收集在离心管中，并在4°C、12000 rpm下离心30分钟。25 μ将各组上清液L放入96 well板中，以1:4的比例向上清液中添加Drabkin试剂。在室温下培养5分钟后，用分光光度计在400 nm处测量OD值。每个样品的OD值由空白组校准。

2.6。PPAR的表达-γWestern Blot检测不同组的CD163和Hp

粉碎脑组织，加入含有PMSF的RIPA裂解缓冲液，提取每个样本中的总蛋白，进行Western blot分析。蛋白质浓度通过双钦酸（BCA）测定。50 μ将每g样品裂解液装入10%十二烷基硫酸钠凝胶中，在90伏电压下电泳2小时。在电泳过程后，将皮带转移到聚偏氟乙烯膜上。在37°C下用5%BSA封闭缓冲液封闭膜2小时，并用第一抗体培养：多克隆抗PPAR-γ兔（1:1000，Bioss）、兔抗CD163（1:500，Bios）和兔多克隆抗Hp（1:500）在4°C恒温器振动器中过夜。同时，用探针探测其他膜β-肌动蛋白（1:3000，生物世界）作为内部控制。用TBST缓冲液清洗后，将所有膜与第二抗体在37°C下孵育2小时。免疫反应膜用ECL Plus化学发光分析试剂盒处理。之后，可以通过成像系统（Bio-Read、ChemiDoc）对其进行可视化。最后，分别使用其内部控制对波段强度进行标准化，并使用ImageJ软件进行数字化。

2.7. 血肿和脑水肿体积的MRI测量

在山西医科大学附属第二医院ICH术后3天，所有大鼠在1.5 T临床扫描仪（GE Signa HDx，GE healthcare Milwaukee）上用膝盖线圈进行脑部MRI扫描。在MRI成像扫描过程中，大鼠在俯卧位使用5%水合氯醛后保持良好麻醉状态。我们在研究中获得了一系列MR序列，方案包括T2加权成像（T2WI）和T2 Flair，以评估水肿和扫描参数[13]如下所示：重复时间（TR）/回波时间（TE）=2400/129 ms，视野（FOV）=18×18 mm，层厚=2.0 mm，矩阵尺寸=512×448，间隔=0.2 mm。在T2流体衰减反转恢复（T2 Flair）中，TR/TE=8502/128.6 ms，FOV=12×12 mm，层厚度 = 2.0毫米，矩阵尺寸=512×448，间距=0.2毫米。T2^∗-加权成像（T2^∗采用WI）和敏感性加权成像（SWI）确定血肿大小；扫描参数如下：T2^∗WI，TR/TE=400/15 ms，FOV=18×18 mm，层厚=2.0 mm，矩阵尺寸=448×384，间距=0.2 mm，翻转角度=15°。SWI:TR/TE=49.9/4.5 ms，FOV=18×18 mm，层厚=1.5 mm，翻转角度=15°，矩阵大小=448×448。MRI后处理由两名经验丰富的神经科医生在离线工作站上进行，他们不知道组设置和扫描日期。测量过程中采用了包含外部水肿和血肿的脑出血面积的绝对体积。通过积分脑出血切片的损伤面积来计算绝对体积的总值。所有评估分别重复三次。结果显示为平均值和标准偏差。

2.8. 实时PCR检测不同人群的结合珠蛋白和CD163

按照制造商的说明，使用TRIzol试剂（日本Takara公司）从血肿周围的脑组织中提取不同组的总RNA。在完成提取过程后，通过Nano drop 2000（Thermo Fisher，USA）测定总RNA，在260nm处具有UV吸光度以确保纯度。使用一步PrimeScript™RT Master Mix试剂盒（日本Takara公司）逆转录互补DNA，共20个μ包含1的L反应混合物系统μg总RNA在37°C下进行15分钟；最后，互补DNA被保存在-80°C的环境中。实时PCR分析在BIO-RAD iCycler Thermal Cycler中使用互补DNA和SYBR®Premix Ex Taq™Kit（日本Takara Inc.）进行RT-PCR（美国BIO-RAD）。基于寡核苷酸PCR的引物如下：结合珠蛋白：5′-gaaaggcgctgtaagtctgtg-3′（正向引物）和5′-tcccttccaggtgaattg-3′（反向引物）以及CD163:5′-ga cagaccacagcttaca-3′（向前引物）与5′-ggtcacaaacttcaaccgga-3′（逆向引物）。该实验使用25μL体积总反应混合物反应系统，含2μ稀释互补DNA产物的L，12.5μSYBR Premix Ex Taq Mix的L（日本Takara公司），1μ正向/反向引物分别为L和8.5μL无RNase水。实时PCR反应条件如下：预变性步骤在95°C下处理1分钟。扩展过程将变性设置为95°C 30秒，退火和延伸设置为55°C 45秒，并将扩展过程重复40个循环。对每个样本进行三次逆转录PCR。为了标准化结合珠蛋白和CD163 mRNA的表达，参考基因的水平β-平行测定每个样品的肌动蛋白。最终结果的表达是目标基因拷贝数与β-肌动蛋白转录物。目标基因的表达由2^-ΔΔCt方法。

3.2. 帕帕-γAgistic Monascin降低脑含水量

与假手术组相比，所有手术组的脑含水量均显著增加(^∗第页<0.05与假手术组相比；图1). PPAR（购电协议）-γ激动剂monascin显著降低血肿周围脑组织含水量，而PPAR-γ与车辆组相比，拮抗剂Glivec的行为方式相反(^#第页< 0.05;图1).

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图1

PPAR的影响-γ术后3天与脑出血相关的脑含水量(^∗第页与假手术相比<0.05；^#第页与车辆相比<0.05）。

3.3. PPAR（购电协议）-γAgistic Monascin降低血红蛋白水平

所有手术组的血红蛋白水平均明显高于假手术组(^∗第页< 0.05;图2). 与溶媒组相比，单胞菌素显著降低了血红蛋白水平(^#第页与车辆相比<0.05），而Glivec增加了(^#第页与车辆相比<0.05）。

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图2

PPAR的影响-γ术后3天与脑出血相关的血红蛋白水平(^∗第页<0.05与假手术组相比；^#第页与车辆相比<0.05）。

3.4. Monascin和Glivec对脑出血后CD163和Hp表达的影响

Western blot和PCR结果显示PPAR显著增加-γ与假手术组相比，ICH后同侧脑组织中Hp和CD163的表达(^∗第页< 0.05,图3). 与载药相比，单胞菌素增加了PPAR-γWestern blot检测Hp和CD163的表达(^#第页<0.05，数字3（a）–3（d）)和实时PCR(^#第页<0.05，数字3（e）和3（f）). 同时，服用格列卫下调PPAR的表达-γ、血红蛋白和CD163(^#第页< 0.05,图3).

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图3

Glivec和红曲霉素对PPAR的影响-γ、触珠蛋白和CD163与ICH相关。PPAR的代表性图像显示为Western blot分析（a–d）和实时PCR（e和f）-γ同侧脑组织内的结合珠蛋白和CD163水平。采用单向方差分析（ANOVA）和Tukey检验。(^∗第页<0.05与假手术组相比；^#第页与车辆相比<0.05）。

本研究得到了国家自然科学基金项目（项目编号：81771294）的支持。