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分子生物学细胞。2001年12月；12(12): 4013–4029.
数字对象标识：10.1091桶/2013年12月12日
预防性维修识别码：PMC60772型
PMID：11739797

肌动蛋白丝和肌球蛋白Iα与微管协同溶酶体运动V⃞

Marie-Neige Cordonnier公司,* 丹尼尔·道宗内,† 丹尼尔·卢瓦德,*和伊芙琳·库德雷尔*‡
J.Richard McIntosh，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

早先的一份报告表明，肌动蛋白和肌球蛋白Iα（MMIα），一种与内体和溶酶体相关的肌球蛋白，参与了内化分子向溶酶体的传递。为了确定肌动蛋白和MMIα是否参与溶酶体的运动，我们用延时视频显微镜分析了活小鼠肝癌细胞（BWTG3细胞）溶酶体动态，产生绿色荧光蛋白肌动蛋白或MMIα的非功能结构域。在GFP-actin细胞中，溶酶体表现出依赖微管的快速长距离定向运动、短时间随机运动和停顿（有时是肌动蛋白丝）的组合。我们发现，细胞松弛素D对肌动蛋白丝动力学的抑制增加了肌动蛋白结构上溶酶体的停顿时间，而使用latrunculin A解聚肌动蛋白纤维增加了溶酶体流动性，但削弱了其长距离运动的方向性。MMIα非功能结构域的产生损害了溶酶体的细胞内分布及其长距离运动的方向性。总之，我们的观察结果首次表明，肌动蛋白丝和MMIα都有助于溶酶体与微管及其相关分子马达协同运动。

简介

溶酶体是由单个膜界定的酸性细胞器，含有一组特征水解酶。它们的尺寸在0.3至0.5μm之间，具有电子密度高的核心。它们是内化分子积累的最终场所，在细胞内分子降解中起着重要作用。最近的电镜形态学分析和体外无细胞分析表明，晚期内体和溶酶体之间存在异型融合，表明晚期内体可能在核周区与溶酶体融合(斯托沃格尔等。, 1991;福特等。, 1996;马洛克等。, 1998;布奇等。, 2000;卢齐奥等。, 2000). 除了细胞内消化功能外，造血细胞和其他几种细胞类型的实验证据表明，溶酶体参与分泌，因此能够与质膜融合(安德鲁斯，2000). 溶酶体可能在核周区域与晚期内涵体融合，并在细胞外围与质膜融合，这表明它们是高度动态的，能够从核周区域移动到细胞外围，反之亦然。

人们普遍认为，微管和相关的分子马达负责细胞器和小泡的细胞内运动。Matteoni和Kreis（1987）他们首先观察到溶酶体在微管上移动。溶酶体的运动已被证明需要细胞质动力蛋白和驱动蛋白(霍伦贝克和斯旺森，1990年;安妮托等。, 1993;巴尼尼斯等。, 2000). 最近，肌动蛋白丝还参与维持内体和溶酶体的稳态分布，以及这两个细胞器之间的膜运输(范·德乌斯等。, 1995;杜尔巴赫等。，1996年a;线路接口单元等。, 1997;巴鲁瓦等。, 1998). 内吞作用中肌动蛋白需求的分子机制可能是基于内吞体和溶酶体使肌动蛋白集合成核并在动态肌动蛋白彗星尾部顶端火箭发射的能力(梅里菲尔德等。, 1999;汤顿等。, 2000). 除肌动蛋白外，与肌动蛋白相关的分子马达，如肌球蛋白，也可能参与这一分子机制，正如我们在早期综述中提出的那样(库德里耶等。, 1992). 事实上，I类肌球蛋白与多种生物体内吞途径的不同方面有关。酵母I类肌球蛋白，以及这些肌球蛋白在阿米巴和巢状曲霉，已提出通过重组皮层肌动蛋白网络在囊泡形成期间的内吞第一阶段发挥作用(诺瓦克等。, 1995;奥斯塔普和波拉德，1996年;荣格（Jung）等。, 1996;Geli和Riezman，1996年;Yamashita和1998年5月). 此外，最近有研究表明，酵母I类肌球蛋白可以参与肌动蛋白的组装(福音派等。, 2000;Geli公司等。, 2000;李等。, 2000,荣格（Jung）等。2001). I类肌球蛋白的其他成员参与了内吞作用的后期步骤：肌球蛋白B的缺失网柄柄菌诱导液相内吞缺陷、溶酶体酶分泌过多和膜循环减少，而这个家族的哺乳动物成员（肌球蛋白Iα）与内吞体和溶酶体相关，调节内化分子向溶酶体的传递(特梅斯瓦里等。, 1996;拉波索等。, 1999,Neuhaus和Soldati 2000). 总之，这些观察结果表明，溶酶体膜上细胞溶质肌动蛋白的募集可能有助于推动这些细胞器穿过细胞质，而I类肌球蛋白的成员可能参与了这种募集。或者，I类肌球蛋白可能会对肌动蛋白丝施加作用力，以移动溶酶体，或将其暂时固定在肌动蛋白丝上，从而控制其运动。

为了区分这些假设，我们通过延时视频显微镜分析了活小鼠肝癌细胞（BWTG3细胞）中溶酶体的运动，产生绿色荧光蛋白标记的肌动蛋白（GFP肌动蛋白）或肌球蛋白Iα的非功能结构域（MMIα）。总之，我们的观察首次表明，肌动蛋白丝与微管协同作用，促进肝癌细胞中溶酶体的运动，而I类肌球蛋白参与了这一过程。

材料和方法

抗体

我们使用了一种针对转铁蛋白受体胞质尾部的单克隆抗体H68.4，根据白色等。(1992)和针对Myr 1氨基末端的多克隆抗体，Myr 1是MMIα的小鼠同源物，被称为Tü29(鲁珀特等。, 1993). 针对Lamp1的单克隆抗体从PharMinen（加利福尼亚州洛杉矶）获得，针对GFP的单克隆疫苗从Roche（法国梅兰）获得。

重组cDNA的构建与转染

通过删除片段获得编码GFP-MMIαΔn295的重组质粒巴姆HI–高巴姆HI来自编码GFP-Myr 1b（MMIα的小鼠同源基因）的重组质粒，根据拉波索等。(1999)重组质粒的表达导致GFP蛋白和MMIα截短蛋白（aa 296-1041）之间添加了12个氨基酸（SGLRSRAQASNS）。编码GFPβ-actin的重组质粒是B.Imhof慷慨赠送的礼物(巴勒施特雷姆等。, 1998). 根据拉波索等。(1999)24小时后，向细胞补充0.7 mg/ml的Geneticin（苏格兰佩斯利生命科技公司），并在该培养基中永久生长。克隆后用免疫荧光法筛选出三个稳定的产生GFP-MMIαΔn295的细胞克隆。80%以上的细胞在我们目前使用的克隆中产生重组蛋白。通过pEGFP载体转染BWTG3细胞获得模拟细胞的细胞克隆，无需任何插入物，并选择与GFP-MMIαΔn295表达细胞类似的细胞。GFP-actin细胞作为一个基因耐药细胞池保存，以在同一培养物的不同细胞中获得不同水平的蛋白表达。

细胞培养

小鼠肝癌细胞系BWTG3(斯皮勒和斯皮勒，1975年)或产生GFP-MIαΔn295、GFPβ-肌动蛋白的细胞克隆，或模拟细胞在37°C、10%CO下生长2在补充有10%FCS（Seromed）的Coon’s F-12修饰培养基（Seromed，Berlin，Germany）中。对于野生型细胞，将青霉素（10 U/ml）和链霉素（10 mg/ml；血清）添加到培养基中，同时在Geneticin存在下培养细胞克隆。在分析之前，将产生GFP-MMIαΔn295、GFPβ-actin或模拟细胞的细胞克隆与10 mM丁酸钠孵育过夜

免疫荧光显微镜

细胞用3%多聚甲醛和0.025%戊二醛固定，用含有0.1%皂苷的PBS渗透，并用间接免疫荧光分析。首先用一级抗体培养细胞30分钟，然后用Alexa 488结合二级抗体培养30分钟（分子探针、尤金、OR）。用共焦激光扫描显微镜观察细胞(莱卡牌手表德国海德堡）。

膜分离和免疫印迹

细胞在175厘米内生长5天2烧瓶，通过刮擦收集，并重新悬浮在含有10 mM三乙醇胺、pH 7.4、0.25 M蔗糖、1 mM EDTA和西格玛（密苏里州圣路易斯）产蛋白酶抑制剂混合物的1 ml均质缓冲液中。然后将它们通过22G 1′1/4规格的针头进行两次均化。通过1000×离心将未破碎的细胞和细胞核从细胞匀浆中去除克持续10分钟，将核后上清液（PNS）中包含的粗膜部分装入25%Percoll中，置于1 M蔗糖垫上，方法如下绿色等。(1987).在22500×离心20分钟后克，收集的组分在三个池中组合之前，对β-己糖胺酶和碱性磷酸二酯酶活性进行了分析，如拉波索等。(1999).

不同组分的蛋白质通过SDS-PAGE分离，并在20 mM Tris、150 mM甘氨酸和0.0375%SDS存在下转移到硝化纤维素膜上。使用德国曼海姆Boehringer Mannheim的化学发光印迹底物进行抗体检测。

胃蛋白酶抑制素A-BODIPY-TR-盐酸卡达夫林的化学合成

N个-将羟基琥珀酰亚胺（2.32 mg，0.0201 mmol）和1,3-二环己基碳二亚胺（3.78 mg，0.0183 mmol）依次添加到胃蛋白酶抑制素a（Sigma，12.55 mg，0.0183mmol）在无水DMF（3 ml）中的搅拌溶液中。将混合物在氩气下在室温下搅拌过夜，直到开始的胃蛋白酶抑制素A完全消失，如TLC所判断的那样（使用二氯甲烷/甲醇8:2的混合物作为洗脱剂，并使用磷钼酸喷雾检查平板）。然后将从Molecular Probes购买的商用5-[（（4-（4,4-二氟-5-（2-噻吩基）-4-bora-3a，4a-二氮杂-s-吲哚-3-基）苯氧基）乙酰基）氨基]戊胺盐酸盐（BODIPY-TR-盐酸卡达夫林，10 mg，0.0183 mmol）添加到一份中。然后将过量的三乙胺（40μl）引入反应介质中，在使用前通过氢化钙蒸馏干燥通过释放游离胺的注射器。将混合物在室温下在氩气下进一步搅拌16小时。在减压下去除挥发性化合物，然后进行闪光色谱法（使用二氯甲烷/甲醇混合物8:2作为洗脱剂），在溶剂蒸发后，提供19.78 mg（92%）纯度令人满意的想要的荧光探针作为深蓝色粉末。MS-FAB:米/z1199（M+Na）+.

BODIPY-TR肽抑制素A的内化与药物治疗

GFP-actin和GFP-MMIαΔn295产生细胞分别在25 mm直径的盖玻片上生长1或2 d，然后在37°C的培养基中与1μM BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A孵育90 min。然后在培养基中清洗盖玻片三次，并将其安装在一个装有1.5毫升培养基的小型开放室（BELLCO Glass.）中。将小型开放式室引入37°C，5%CO2显微镜载物台上的调节室，由可拆卸的膜覆盖，可选择性地渗透气体。在开始采集之前，在显微镜下用培养基进行20分钟的追逐。

在药物治疗的情况下，将1ml培养基添加到安装的细胞中，并获得一个对照序列的连续图像。然后立即在显微镜下向样品中添加含有诺卡唑、细胞松弛素D或latrunculin A的500μl培养基，使最终药物浓度分别为1μM、1μM和0.5μM。孵育10分钟（诺可唑，细胞松弛素D）或5分钟（latrunculin A）后，拍摄同一细胞和其他细胞的一系列序列图像。诺卡唑孵育时间的测定允许微管的扰动，而不会扰动肌动蛋白丝，这是通过使用抗微管蛋白抗体和卵磷脂的免疫荧光来判断的（我们未发表的结果）。同样，选择肌动蛋白药物的孵育时间，以允许在不干扰微管的情况下干扰肌动蛋白细胞骨架。每个序列的图像数量设置为31，以便能够制作同一细胞的两个序列图像，例如药物治疗前后的图像，而不会用太强的照明干扰细胞。

时间推移视频显微镜

使用莱卡牌手表倒置显微镜(莱卡牌手表)配备Plan Apochromat 100×1.4 NA浸油镜头。使用电动荧光滤光片轮依次观察德克萨斯红（N21激发BP515–560，二溴565，发射LP 590）和绿色荧光蛋白（L5激发BP480/40，二氯甲烷505，发射BP527/30）。照明由卤素灯通过绿色滤光片提供，用于相位对比观察，或由50W HBO汞灯提供荧光。所有图像均使用普林斯顿冷却CCD相机（Micromax，普林斯顿仪器，新泽西州特伦顿）拍摄，由Metamorph软件（Universal Imaging，Media，PA）控制，每6秒拍摄一对GFP/Texas Red帧（曝光时间分别为200 ms和100 ms）。GFP和Texas Red荧光之间的切换以及外部快门限制样品的曝光也由Metamorph软件控制。

图像分析

60–150个荧光粒子的位置是在连续的帧中手动确定的，使用Metamorph软件甚至对小管也可以，因为它们的大小不超过几个像素。存储了给定时间内荧光粒子的相应坐标，并允许计算连续粒子位置之间的距离d（i）和速度[d（i/Δt]，其中Δt是帧之间的时间间隔（Δt=6s）。还使用Sigma Plot软件（SPSS，Chicago，IL）计算了最大位移dmax（粒子从其初始点可以覆盖的最大距离）和最大速度vmax（连续粒子位置之间的最高速度）。为了绘制显示dmax和vmax分布的直方图，将dmax值和vmmax值分别舍入到最接近的整数值或十分之一。我们定义了持久性(对)运动粒子的距离与初始点和最终点之间的距离之比：

方程式M1
1

其中A和B是粒子轨迹的起点和终点，d（AB）是A和B之间的距离。

颗粒随机运动的特征是其均方位移随时间的变化，<d2（t） >。根据阿布尼等。(1999)，<d2（t） >使用Sigma Plot软件计算并拟合到一个模型方程，该模型方程显示了两个术语，第一个术语描述扩散运动，第二个术语描述定向运动：

方程式M2
2

哪里，d日是位移，t吨时间，D类扩散系数，以及五模型中粒子的速度。括号<>表示平均值，按照阿布尼等。(1999)误差线计算为平均值的SE。

结果

胃蛋白酶抑制素A在BWTG3细胞中与溶酶体共分布

胃蛋白酶抑制素A抑制并特异性结合组织蛋白酶D（一种主要溶酶体天冬氨酸内肽酶），可用作溶酶体的示踪剂(陈等。, 2000). 为了跟踪产生GFP标记蛋白的活细胞中溶酶体的运动，我们合成了与BODIPY-TR尸胺盐酸盐共价偶联的胃蛋白酶抑制素A（BODIPY-TR胃蛋白酶抑素A）。在荧光肽和chase内化后，BWTG3细胞在细胞质中显示出点状染色。这些囊泡状结构与Lamp 1严格共定位，我们之前已经证明Lamp 1可以在电子显微镜水平标记肝癌细胞系的溶酶体(拉波索等。1999)（图​)（图1A1A和B）。它们的细胞内分布与转铁蛋白受体的分布显著不同，转铁蛋白是早期内体和再循环室的标记（图​（图1C1C和D）。这些观察结果表明，大多数胃蛋白酶抑制素A装载区与溶酶体相对应。因此，我们在这些条件下使用BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A来监测活细胞中溶酶体的运动。

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BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A在BWTG3细胞中的亚细胞分布。在将BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A内化90分钟并在37°C下追踪20分钟后，用抗Lamp1（B）或抗转铁蛋白受体（D）抗体标记固定和渗透细胞。（A，B）BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A和Lamp1在细胞基底附近的共聚焦截面上的分布。（C，D）BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A和转铁蛋白受体分别在细胞基底附近的共聚焦截面上的分布。棒材=10μm。插入显示更高的放大倍数

溶酶体在微管上进行快速定向运动，有时在肌动蛋白丝上进行短时间随机运动和暂停

为了同时追踪溶酶体和肌动蛋白，我们用延时视频显微镜分析了稳定表达GFP-actin的BWTG3细胞内化BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A的动态。我们在这些细胞的较薄区域观察到典型的外周肌动蛋白电缆标记（图​（图2A）。2A） ●●●●。在细胞固定和渗透后，这些丝状结构也可以用罗丹明-卟啉标记（我们未发表的结果）。此外，我们观察到弥散染色可能是由于微丝的松散致密网络或细胞质中的单体GFP-actin池（图​（图2A）。2A） ●●●●。茉莉花素内酯处理后，这个弥漫的GFP-actin池被招募到肌动蛋白丝状结构中，这表明来自这个细胞溶质池的GFP-肌动蛋白能够并入肌动蛋白丝中，正如之前通过巴勒施特雷姆等。(1998)（我们未公布的结果）。

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用延时视频显微镜分析产生GFP-actin的细胞中BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A填充的隔室运动。对BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素a内化后产生GFP-actin的细胞，以每6秒一对的速度拍摄31对GFP/Texas Red图像。（A） 延时序列的第一个GFP肌动蛋白框架。（B） 第一个BODIPY-TR pepstatin延时序列的一个框架。（C） BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素在面板A和B中显示的细胞部分中的延时序列，以每12秒一张图像的速率显示（图片上给出了确切的时间），显示不同类型的运动。粒子数1表现出短期随机运动和快速定向运动的组合，粒子数2短暂地伸长并执行短期随机运动，粒子数3经历快速的远程定向运动。（D） 在面板A和B中所示的部分细胞中，BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A（红色）和GFP-actin（绿色）延时序列以每12秒1张图像的速率显示，一个充满BODIPY-TR胃酶抑制素的隔间朝向肌动蛋白电缆并停在那里（粒子数4），另一个隔间停在肌动蛋白线上并逃逸（粒子数5），以及富含F-actin的区域，该区域包含几个不动的BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素a填充的隔间，包括粒子数6。（E） A和B所示细胞中BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A填充腔室的轨迹示例（彩色线和点）。为了清晰起见，为每个粒子指定了一组颜色和点形状；一个较大的圆点表示每个轨迹的开始。细胞及其细胞核的轮廓由延时序列开始时拍摄的相位对比图像表示（连续线）。黑色矩形中的数字指出（C）和（D）后面对应的粒子。数字7和8显示振荡溶酶体的轨迹示例，数字9、10、11和12分别显示向心和离心轨迹示例。（F） 均方位移（带误差条的点）和对应拟合（实线）的示例(2)对于正在扩散运动的溶酶体（编号8）和正在扩散和定向运动的溶菌体（编号7）。还显示了受限溶酶体的均方位移（数字6）。它不能用方程式（2）拟合。虚线是强调粒子6（蓝色）和7（绿色）的均方位移曲率的直线。为了清楚起见，在绘制之前，将颗粒7和8的均方位移除以10。棒材=5μm。

胃蛋白酶抑制素A填充的隔室分布在活细胞的细胞质中，与在固定细胞中观察到的分布相似（图​（图2B2B与数字​图1A，1A、，​A、 1C）。1C） ●●●●。GFP-actin表达细胞中这些隔室的运动和分布与在未转染细胞或产生GFP的细胞中观察到的相似（我们未发表的结果）。主要是小泡状的，胃蛋白酶抑制素A填充的腔室在小管中短暂拉长（图​（图2C，2C、 和视频2C粒子2）。轨迹分析表明，这些隔间中的大多数都经历了快速的长方向运动、短时间的随机运动和停顿（图​（图2C，2C、 和视频2C粒子1号和3号，另请参见图中相应的轨迹​图22E） ●●●●。

在细胞中心和外围之间的离心和向心方向上观察到快速的长方向运动（图​（图2E2E粒子9和10用于向心运动，粒子11和12用于离心运动）。诺卡唑是一种解聚微管的药物，加入诺卡唑后，完全消除了这些定向运动，而在这些条件下仍然可以观察到短时间的随机运动（图​（图11B11B与图​图11A）。11A） ●●●●。因此，我们假设这里观察到的快速双向运动与微管有关，正如前面几组所描述的那样(Matteoni和Kreis，1987年;普雷克里斯等。, 1999). 诺卡唑治疗后，所有溶酶体的速度均低于0.3μm/s。此外，只有7%的溶酶体在3分钟后能够从初始追踪点延伸到2.5μm以上，而在未治疗的细胞中，这一比例为63-69%（表​（表1，1，图​图3，三、A和B）。我们选择了五=0.3μm/s和dmax公司=2.5μm，持续3分钟，分别作为将微管依赖性速度与其他速度和诺可唑敏感轨迹分离的任意极限。在未经处理的细胞中，约50%的溶酶体以高于0.3μm/s的速度至少移动一次（表​（表11和图​图3B）。三B） ●●●●。对于图中所示的细胞，微管依赖性速度的平均值（以高于0.3μm/s的速度的平均数计算）和长程定向溶酶体的最大速度（溶酶体距离其初始跟踪点超过6.5μm）分别为0.46±0.02μm/s和0.66±0.06μm/s​图22在相同条件下分析的其他细胞也一样（从3个不同的细胞中提取150个溶酶体，其平均速度优于0.3μm/s，为0.45±0.01μm/s）。

表1

GFP-actin和GFP-MMIαΔn295表达细胞溶酶体运动的定量

dmax<2.5μm的溶酶体百分比（溶酶体总数）限制性溶酶体（占总溶酶体的百分比）v>0.3μm/s的溶酶体百分比
GFP-actin 1号一34 (91)2147
GFP-肌动蛋白2号b条37 (95)2752
GFP-肌动蛋白3号c（c）31 (104)1956
GFP-肌动蛋白诺卡唑d日93 (154)800
GFP-actin细胞松弛素D 1号e（电子）65 (96)5033
GFP-actin细胞松弛素D 2号82 (80)5612
GFP-actin细胞松弛素D 3号81 (67)5110
GFP-MMIαΔn295编号1（f）41 (71)2844
GFP-MMIαΔn295 2号37 (65)3251
GFP-MMIαΔn295编号3c（c）29 (89)2956
GFP-MMIαΔn295诺卡唑d日94 (86)850
一 与图中的单元格相同​图22. 
b条 图形单元格​图55细胞松弛素D治疗前。 
c（c） 与图中的单元格相同​图1111诺卡唑治疗前。 
d日 与图中的单元格相同​图1111诺卡唑治疗后。 
e（电子） 与图中的单元格相同​图55. 
（f） 与图中的单元格相同​图99. 
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分析添加诺康唑前后，产生GFP-actin的细胞的BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A填充区记录的最大位移和最大速度分布。（A） 和（B）分别表示最大位移的分布dmax公司3分钟的时间和最大速度的分布vmax（最大值）治疗前（黑色条）和治疗后（灰色条）。分别在药物治疗前后追踪104和154个荧光粒子。给定荧光粒子数dmax公司或vmax（最大值）计算为所分析荧光粒子总数的百分比。

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诺康唑对GFP-actin和GFP-MMⅠαΔn295表达细胞中BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素a亚区运动的影响。A和B显示了在延时序列上跟踪的轨迹示例，显示了在没有（A）或添加（B）诺卡唑的情况下，产生GFP-actin的细胞中BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A腔室的动态。C和D显示了延时序列上跟踪的轨迹示例，显示了在没有（C）或添加（D）诺卡唑的情况下，产生GFP-MMⅠαΔn295的细胞中BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A分室的动态。注意，轨迹分布在对照细胞的细胞质中，而在产生GFP-MMⅠαΔn295的细胞中，轨迹集中在细胞核附近。

在所分析的每个GFP肌动蛋白表达细胞中，约34%的溶酶体从其初始追踪点移动的距离不超过2.5μm（表​（表1，1，图​图3A）。三A） .～这些溶酶体中95%的速度低于0.3μm/s，并且没有一个表现出长距离的定向运动。对于图中所示的细胞，这些随机运动的溶酶体的平均速度和最大速度分别为0.026±0.002μm/s和0.12±0.01μm/s​图2，2以及在相同条件下分析的其他细胞。随机运动通常分为三类：扩散、受限扩散和扩散与定向运动的组合。当粒子正在进行扩散和/或扩散和定向运动的组合（五=0表示扩散）。另一方面，均方位移作为时间的函数，不符合方程（2），可能表明粒子的受限扩散(阿布尼等。, 1999)，（见图​图2E2E和​和2F2F用于进行扩散的溶酶体的例子[粒子数8]、扩散和定向运动的组合[粒子数7]和受限扩散[粒子数6]）。图所示细胞溶酶体总数的百分之二十一​图2，2，从三个不同的细胞分析的290个溶酶体中，22%的溶酶体具有均方位移，其曲率与方程（2）预测的曲率相反，并且无法进行拟合（表​（表1）。1). 这些观察结果表明，这些溶酶体被限制在其初始追踪点附近的一个区域，在我们的实验条件下可能经常是不动的。

溶酶体暂停可能持续几秒钟（图​（图2C，2C、 和视频2C粒子1，图​图2D2D和视频2D粒子5），并且经常伴随着方向的改变（图​（图2D2D和视频2D，粒子5）。有趣的是，细胞外周充满胃蛋白酶抑制素A的部分细胞似乎在肌动蛋白电缆上短暂停止（图​（图2D2D和视频2D粒子4、5和6，另请参见图中的相应轨迹​图2E，2E、 颗粒4、5和6）。

总之，我们的观察结果表明，大多数溶酶体是高度动态的颗粒，其快速双向运动依赖于微管。然而，它们有时会暂时停止运动，其中一些甚至无法扩散：它们受到限制。这表明可能存在一种机制，可以在溶酶体沿着微管移动的不同步骤上固定溶酶体。

肌动蛋白丝对溶酶体运动的贡献

由于细胞外周充满胃蛋白酶抑制素A的部分细胞室似乎在肌动蛋白电缆上暂时停止，我们想知道肌动蛋白丝是否有助于溶酶体的运动。我们通过延时视频显微镜研究了BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A在2种药物（细胞松弛素D和latrunculin A）干扰肌动蛋白细胞骨架的情况下填充腔室的行为。

细胞松弛素D与肌动蛋白丝的倒刺末端结合，因此，通过与内源性肌动蛋白帽蛋白竞争，影响肌动蛋白细胞骨架的组织(库珀，1987年). 在15分钟内，将1μM细胞松弛素D添加到BWTG3细胞或表达GFP-actin的BWTG三细胞中，导致F-actin快速重组为分散在细胞质中的无定形斑块（图​（图4C，4C、 和5A）。然而，这种处理既不影响细胞的大体形态（图​（图5F5F vs.5G）或微管的胞质内组织（图​（图4D）。4D） ●●●●。药物治疗10分钟后，超过65%的胃蛋白酶抑制素A填充的隔间距离其初始追踪点的移动不超过2.5μm（表​（表1，1，图​图6A）6A） 并用肌动蛋白补丁定位（图​（图5A）。5A） ●●●●。肌动蛋白贴片和胃蛋白酶抑制素A填充的隔间都被运动所激活，这些运动似乎相互关联，表明胃蛋白酶抑素A标记的结构被困在肌动蛋白补丁中（图​（图5C，5C、，​C、 5D时，5D、 和视频5）。事实上，均方位移分析显示50%的溶酶体被限制（表​（表1）。1). 因此，药物治疗后，速度高于0.3μm/s的荧光室百分比下降（表​（表1，1、和图​图6B）。6B） ●●●●。有趣的是，肌动蛋白斑块中未被捕获的荧光小室正在经历一系列快速的多向运动（图​（图5E5E和视频5），其中高于0.3μm/s的平均速度与在对照细胞中计算的速度相似（对于3个不同细胞的49个溶酶体，为0.44±0.02μm/s，而对于150个未处理细胞的溶酶体则为0.45±0.01）。与对照细胞中溶酶体动态分析的实验一致，该实验表明，当溶酶体靠近肌动蛋白丝时，溶酶体可以暂时不动。

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破坏肌动蛋白丝的药物不会影响微管的组织。在37°C下用1μM细胞松弛素D（C，D）孵育15分钟后，或在37°下用0,5μM latrunculin A（E，F）孵养10分钟后，不用处理（A，B），用荧光指骨肽（A，C，E）和抗管蛋白抗体（B，D，F）标记BWTG3细胞。棒材=10μm。

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细胞降钙素D处理将BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A填充的隔间固定在产生GFP-actin的细胞的肌动蛋白补丁中。（A） 和（B）细胞松弛素D治疗10分钟后（C）、（D）和（E）中出现的延时序列的第一帧。（A） 显示了合并的GFP-actin和BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A图像和（B）BODIPY-TR胃酶抑制素A图像。（C） A和B所示细胞核周区的BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A（红色）和GFP-actin（绿色）延时序列。（E） 肌动蛋白补丁中未捕获荧光隔间的示例。箭头指出了其中一个具有较大随机运动的物体。为了强调胃蛋白酶抑制素A填充的小室和肌动蛋白贴片的不动性，从延时序列中只显示了一张图像，大约每24秒一张。（F） 细胞松弛素D处理前的细胞相位对比图。（G） 细胞松弛素D处理后的细胞相位对比图，正好在（C）、（D）和（E）所示的延时序列的开始处。棒材=5μm。

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在添加细胞松弛素D之前和之后，对BODIPY-TR pepstatin A填充的产生GFP肌动蛋白的细胞的隔间记录的最大位移和最大速度的分布的分析。（A）和（B）分别显示了最大位移的分布数据最大值3 min内和最大速度分布vmax（最大值）细胞松弛素D治疗前（黑色条）和治疗后（灰色条）。药物治疗前后分别追踪了95个和96个荧光粒子。给定荧光粒子数dmax公司或vmax（最大值）计算为所分析荧光粒子总数的百分比。

Latrunculin A是一种结合肌动蛋白单体的药物，因此将细胞中的F-actin/G-actin平衡朝着G-actin方向移动(吕比莫娃等。, 1997). 治疗10分钟后，BWTG3细胞的肌动蛋白丝部分解聚（图​（图4E4E与图​图4A）4A） 但微管仍然保存着（图​（图4F4F与图​图4B）。4B） ●●●●。由于这种处理增加了非聚合肌动蛋白的细胞内池，因此在表达GFP-actin的活BWTG3细胞中检测GFP-actim丝更加困难。GFP-actin染色弥漫于细胞质（图​（图7A）。7A） ●●●●。在这些条件下，大多数充满胃蛋白酶抑制素A的小室都具有高度的动态性，在随机方向上经历了一系列快速运动（图​（图7C，7C、，​C、 第7天，7D、 视频7），这使得它们很难跟踪，甚至对于最动态的细胞来说也不可能（超过84%的溶酶体在延时序列中丢失，而对照细胞则为57%）。与未经处理的细胞相比，它们也更常被拉长（7D、箭头和图​图7B7B对2B）。对可操纵舱室轨迹的分析使我们无法获得与控制单元计算的数据进行合理比较的数据。

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Latrunculin A处理诱导快速BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A填充的腔室运动，并使产生GFP-actin的细胞失去方向性。（A） 和（B）分别显示添加latrunculin A后5分钟，与（C）和（D）中显示的BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A延时序列的第一帧相对应的GFP-actin和BODIPY-TR胃酶抑制素A图像。（C） ：时间序列（每12秒一张图像）显示两个动态伸长的BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A填充的隔室，在核周区域没有真正的方向性（箭头）。（D） ：时间序列（每12秒一张图像）显示一个外围区域，其中BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素a填充的隔间非常动态，无法单独跟踪（圆圈），以及BODIPY-TR胃酶抑制素a-填充的隔层形状变化非常快（箭头）。棒材=5μm。

Latrunculin A通过诱导肌动蛋白解聚降低溶酶体结合肌动蛋白丝的可能性。在这些条件下，溶酶体仍然快速移动，但不偏向任何特定方向。

总之，这些实验与我们的假设一致，表明扰乱肌动蛋白网络完整性的药物会影响溶酶体的运动。F-肌动蛋白网络可能有助于溶酶体方向性的持久性，因为它们在沿着微管运动的特殊步骤中暂时保留这些隔室。

GFP-MMIαΔn295蛋白过度表达影响内源性MMⅠα与膜组分的相关性

我们之前已经证明，I类肌球蛋白家族的一个成员MMⅠα控制着内化分子从晚期内体向溶酶体的传递(拉波索等。, 1999). 因此，我们分析了这种分子马达是否参与溶酶体的运动。因为我们之前观察到，瞬时转染编码GFP-截断的MMⅠα（GFP-MMⅠαΔn295）的cDNA会影响内吞小室的细胞分布(拉波索等。, 1999)，我们建立了一个产生这种GFP-MMⅠα突变体的永久性细胞系，以分析其对溶酶体动力学的影响。

我们首先研究了细胞分离后过表达的GFP-MMIαΔn295的分布。与内源性MMIα类似，离心核后上清液后，在颗粒中检测到一部分GFP-MMIαΔn295，表明GFP-MMIαΔn 295与细胞膜有关（图​（图8A，8A、 PΔ列，车道1和2）。此外，与内源性蛋白一样，GFP-MMIαΔn295与不同的膜组分有关（图​（图8B，8B、 GFP-MMIαΔn295细胞，P1、P2、P3列，车道1），包括溶酶体部分（图​（图8B，8B、 GFP-MMIαΔn295细胞，P1列，通道1 vs.通道3），根据Percoll梯度从GFP-MMI-αΔn 295表达细胞的PNS中分离。相反，大多数GFP在PNS的可溶性细胞溶质部分中检测到，PNS来源于仅产生GFP的细胞（图​（图8A，8A、 Sg列，车道1）。有趣的是，在用表达GFP-MMIαΔn295的细胞制备的PNS的细胞溶质部分中检测到内源性MMⅠα（图​（图8A，8A、 柱SΔ，通道2），而从产生GFP的细胞衍生的PNS的细胞溶质部分几乎没有观察到（图​（图8A，8A、 Sg列，车道2）或野生型单元格(拉波索等。, 1999). 总之，这些数据表明GFP-MMIαΔn295缺乏包含ATP结合位点的结构域，与溶酶体相关，类似于野生型蛋白。此外，它可以与内源性MMⅠα竞争，并将其从细胞膜（包括这些细胞器）中分离出来。

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在产生GFP或GFP-MMⅠαΔn295的BWTG3细胞亚细胞组分中检测MMIα或GFP-MM-IαΔn 295。（A） 两种细胞系的核后上清液在300000×克收集颗粒和上清液。用7.5%SDS-PAGE分离10毫克匀浆（Hg，HΔ）、PNS（PNSg，PNSΔ），来自相当于10μg PNS的颗粒的蛋白质（Pg，PΔ）和来自相当于100毫克PNS的上清液的蛋白质（Sg，S△），并转移到硝化纤维素膜上。用抗GFP（通道1）和抗MMIα抗体（通道2）探测细胞膜。（B） 用Percoll密度梯度法从两种细胞系中分离PNS后收集的组分合并成三个池，将溶酶体与内体和质膜分离，正如前面对野生型细胞所描述的那样(拉波索等。, 1999). 将每个池中相同数量的蛋白质（P1、P2、P3）以及相关PNS（PNS）的相同数量的蛋白加载到7.5%SDS-PAGE上，并用抗GFP（第1道）、抗MMIα（第2道）和抗Lamp1抗体（第3道）进行免疫印迹分析。P1中显示的部分富集为溶酶体标记，并显示内源性MMIα和GFP-MMⅠαΔn295。

GFP-MMⅠαΔn295的过度表达对溶酶体运动的影响

为了确定MMⅠα在溶酶体运动中的作用，我们研究了稳定表达GFP-MMⅠαΔn295的BWTG3细胞中充满胃蛋白酶抑制素A的腔室的运动。免疫荧光显微镜观察到GFP-MMIαΔn295在细胞内的分布，在固定细胞或活细胞的细胞质中形成弥散模式(拉波索等。, 1999、和图​图9A），9A） ，其可能对应于PNS离心后在上清液中检测到的蛋白质（图​（图8A，8A、 SΔ列，车道1）。与野生型细胞或产生GFP、GFP-MMⅠα或GFP-actin的细胞一样，内化的BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A在细胞质中引起点状染色，在产生GFP-MMⅡαΔn295的细胞中与Lamp1共分布（我们未发表的结果）。正如之前在瞬时转染后观察到的那样，溶酶体主要位于核旁区域，而在对照细胞中分散分布（图​（图9B9B和​和11C11C与数字​图1B，1B、，​B、 2B型2B和​和11A）。11A） ●●●●。有趣的是，在野生型细胞中，荧光溶酶体比溶酶体大（图​（图9A，9A、 圆圈2中的粒子与2C中的粒子1、2和3）。它们的运动似乎是相关的，这可能表明它们与邻近的荧光溶酶体有关（图​（图9C，9C、 和视频9）。

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用延时视频显微镜分析产生GFP-MMⅠαΔn295的细胞中充满BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A的隔室的运动。在BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素a内化后，以每6秒一对的速度拍摄了31对GFP/德克萨斯红图像，用于产生GFP-MMⅠαΔn295的细胞。（A） 延时序列的第一个GFP-MMⅧαΔn295。（B） ：第一个BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素延时序列的一帧。B中的白色箭头表示细胞外围没有溶酶体。（C） 胃蛋白酶抑制素（Pepstatin）：在面板A和B中显示的矩形区域中，以每12秒一张图像的速率出现的延时序列（图片上给出了确切的时间），表明小泡的运动受到相邻小泡的限制或干扰。圆圈1、2、3表示溶酶体似乎相互影响的区域。（D） 图A和图B所示细胞内充满胃蛋白酶抑制素A的腔室的轨迹示例，在与图相同的条件下进行跟踪​图2。2.Bar=10μm。

GFP-MMIαΔn295表达细胞中大多数充满胃蛋白酶抑制素A的隔室都在经历短时间的随机运动或在所有方向上快速连续的短时间线性运动（图​（图9C，9C、，​C、 9D、，9D、 和视频9）。在产生GFP-MMIαΔn295的3个不同BWTG3细胞克隆中观察到这种表型。溶酶体从其初始追踪点移动<2.5μm的比例与在产生GFP-actin的细胞中观察到的比例相似（表​（表1）。1). 通过均方位移研究分析，限制性溶酶体的百分比与产生GFP-actin的细胞中限制性溶菌体的百分比相当。微管依赖性速度的平均值也与产生GFP-actin的细胞的计算值相似（0.44±0.01μm/s，取5个不同细胞中202个溶酶体的平均值）。然而，与在产生GFP-actin的细胞中观察到的相应最大位移相比，荧光室的长距离定向运动似乎不太频繁，最大位移更短。6%的溶酶体延伸超过8.5μm，而在表达GFP肌动蛋白的细胞中为12%（这些值是针对每种情况下3个不同细胞的溶酶体计算的）。图​图1010显示了一个表达GFP-actin的细胞与表达GFP-MMIαΔn295的细胞的最大位移分布的示例。与表达GFP-actin的细胞相比，表达GFP-MMIαΔn295的细胞在3分钟内的最大位移减小。在溶酶体行为中检测到的这些变化导致用于在两点之间移动的轨迹长度整体增加。这种现象也可以用溶酶体的持续存在来描述（见方程式1)：当囊泡从起始点直接到达终点时，溶酶体持续时间为1。相同两点之间轨迹长度的增加对应于更大的持续性。事实上，在产生GFP-actin的细胞中，溶酶体距离其初始追踪点超过2.5μm的持续时间为4.62±0.45（分析了来自3个不同细胞的192个溶酶体超过2.5μm的情况），与GFP-MMIαΔn295表达细胞6.22±0.42相比（分析了来自5个不同细胞的248个长度超过2.5μm的溶酶体）。这两种坚持的价值观显著不同（学生t吨测试成功，p=0.01，自由度为438度）。

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分析产生GFP-actin和GFP-MMⅠαΔn295的细胞的BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A填充区记录的最大位移分布。这里分析的单元格是图中描述的两个单元格​图2，2、和​和9。9在产生GFP-actin和GFP-MMⅠαΔn295的细胞中分别追踪到91和71个荧光颗粒。给定荧光粒子数dmax公司3min内的荧光粒子数按所分析荧光粒子总数的百分比计算。两倍以上的BODIPY-TR胃蛋白酶抑制素A填充隔间具有dmax公司肌动蛋白-GFP细胞比GFP-MMⅠαΔn295细胞高6.5μm。

为了确定这些紊乱的运动是否仍然依赖微管，我们用诺卡唑处理表达GFP-MMⅠαΔn295的细胞。治疗10分钟后，GFP肌动蛋白表达细胞中随机定向运动的连续性受到抑制，取而代之的是与诺康唑治疗后观察到的类似的短时间随机运动。表达GFP-MMIαΔn295的细胞经诺卡唑处理后的平均速度和最大速度分别为0.030±0.001μm/s和0.090±0.006μm/s，而表达GFP-actin的细胞经nocodazole处理后的速度分别为0.023±0.001和0.081±0.005μm/s（图​（图11，11、和表​表1）。1).

GFP-MMⅠαΔn295在肌动蛋白结合位点的氨基末端被删除，但仍显示肌动蛋白连接位点的假定序列。因此，我们想知道GFP-MMⅠαΔn295的作用是通过肌动蛋白细胞骨架的去组织直接还是间接的。我们比较了肌动蛋白和微管在产生GFP-MMⅠαΔn295的细胞中的分布及其在模拟细胞中的分配。这些细胞中用荧光性阴茎倍体蛋白修饰的肌动蛋白丝的分布与它们在产生GFP的细胞中的分布相似（图​（图12E12E与F）。此外，微管在两种细胞类型中的分布也相似（图​（图12G12G与H）。

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GFP-MM¦ΒαΔn295的产生不影响肌动蛋白网络和微管细胞的分布。用荧光鬼笔肽（E，F）或抗微管蛋白抗体（G，H）标记产生GFP-MM¦ΒαΔn295的细胞（A、C、E和G）或模拟细胞（B、D、F和H）。A、 B、C和D分别显示GFP-MMⅠαΔn295和GFP的细胞分布。棒材=10μm。

总之，这些实验表明，GFP-MMⅠαΔn295突变影响溶酶体的长距离运动，尽管溶酶体仍沿微管进行无组织运动。

讨论

在这项研究中，我们研究了肌动蛋白对一种类型的内吞室溶酶体运动的贡献。我们观察到溶酶体是高度动态的小管-囊泡结构，从细胞外围移动到核旁区域，反之亦然。这些运动符合这样一个事实，即溶酶体可能分别与细胞外围和核旁区域的质膜和晚期内体相互作用(安德鲁斯，2000).

溶酶体表现出快速长双向运动、短随机运动和停顿的组合。诺卡唑抑制速度大于0.3μm/s、距离大于2.5μm的快速长双向运动，因此具有微管依赖性。此处计算的微管依赖性溶酶体平均速度（0.45±0.01μm/s）慢于计算的海马神经元内体运动速度（0.85±0.1μm/s，Prekeris公司等。, 1999). 在NRK细胞中，长程定向溶酶体的最大速度（0.66±0.06μm/s）也比酸性小室的最大速度慢（2.5μm/s）(Matteoni和Kreis，1987年). 这些差异的原因尚不清楚，但可能是由于所使用的不同演算方法、细胞器之间的差异（溶酶体与内体或酸性隔室），或所研究细胞器的细胞起源。有趣的是，我们计算的微管依赖性溶酶体的平均速度与大鼠肝细胞在体外沿微管移动的内胚体平均速度一致（0。55±0.23μm/s，默里等。, 2000).

诺康唑治疗后残留的短时间随机运动远慢于之前在动态肌动蛋白彗星尾巴尖端观察到的快速溶酶体运动爪蟾受精后的卵子或受刺激的肥大细胞中的卵子（分别为0.026μm/s和0.17和0.24μm/s，汤顿等。, 2000;梅里菲尔德等。, 1999). 此外，我们没有在BWTG3细胞中观察到之前在配体活化细胞中描述的肌动蛋白彗星尾。因此，在我们的实验条件下，肌动蛋白似乎不会被募集到溶酶体的膜上，从而推动这些细胞器穿过细胞质。然而，由于一些不动溶酶体位于肌动蛋白丝附近，我们想知道肌动蛋白细胞骨架是否有助于溶酶体的运动。事实上，我们观察到细胞松弛素D处理后，溶酶体很少从新形成的肌动蛋白结构中释放出来。因此，在这些条件下，溶酶体的运动大大减少。此外，latrunculin A对肌动蛋白丝的解聚增加了管状溶酶体的流动性，以至于实验开始时观察到的大多数溶酶体在几秒钟后消失。总之，我们的观察结果表明，F-actin网络参与溶酶体的运动。肌动蛋白网络可能在溶酶体沿微管运动期间暂时保留溶酶体。在缺乏F-肌动蛋白的情况下，溶酶体可能仍在微管上移动，但可能经常从微管中释放出来，如在体外通过默里等。(2000)导致随机方向的快速移动。

我们以前的观察表明，MMⅠα通过控制内化分子从内体向溶酶体的传递而参与内吞过程(拉波索等。, 1999). 因此，我们分析了MMⅠα是否参与溶酶体运动。我们发现，缺失ATP结合位点的截短型GFP-MMⅠαΔn295的产生是非功能性的，它改变了溶酶体的动态和分布。溶酶体在产生GFP-MMⅠαΔn295的细胞中进行一系列快速的短时间随机运动，这些运动对诺卡唑敏感。尽管GFP-MM¦ΒαΔn295仍然表现出肌动蛋白结合位点，但它不会影响肌动蛋白网络的细胞内分布。因此，GFP-MM¦ΒαΔn295的过量产生所诱导的修饰可能是由于蛋白质对溶酶体的直接影响，而不是对肌动蛋白细胞骨架的组织的影响。MMIα在产生GFP-MMαΔn295的细胞的胞质部分中的释放表明，GFP-MMαΔn295可能通过与该蛋白竞争其在溶酶体上的受体而对内源性MMIα的功能产生显性负面影响。总之，这些观察可能表明MMIα有助于溶酶体沿微管的长距离运动。最近的证据表明，来自酵母和阿米巴的肌球蛋白I可能有助于肌动蛋白聚合和肌动蛋白网络组织(伊万格利斯塔等。, 2000;Geli公司等。, 2000;李等。, 2000,荣格（Jung）等。2001). 然而，MMIα对溶酶体长程运动的贡献不太可能基于这种分子机制，因为它不包含该机制所需的氨基酸序列（第二个肌动蛋白结合位点、SH3基序或类似于结合Arp 2/3复合物的WASp的a结构域的COOH酸性区域）.MMIα和F-actin网络可能作为调节机制的一部分，在溶酶体沿着微管移动的过程中暂时保留溶酶体。这个假设与MMIα的动力学分析相一致，表明这种分子马达可以维持货物和肌动蛋白丝之间的张力，而不是在肌动蛋白纤维上移动货物(Coluccio和Geeves，1999年).

与之前的研究一致，我们在未经处理的细胞中观察到了小管囊泡溶酶体(霍普金斯大学等。, 1994;富特牌手表等。, 1998). latrunculin A处理后，溶酶体形状变为长管状结构，细胞松弛素D处理后变为聚集结构，或GFP-MMíαΔn295产生后变为连接结构，这与微管和肌动蛋白网络参与维持这些细胞器形状相一致。事实上，最近已经观察到，内胚体伸长，当它们与微管结合时能够裂变(巴尼尼斯等。, 2000). 根据我们的数据，很容易假设肌动蛋白丝与MMIα一起参与溶酶体的同型融合和/或与晚期内体的异型融合。这一假设与细胞松弛素D处理后将溶酶体固定在肌动蛋白贴片上时观察到的聚集结构以及在产生GFP-MMⅠαΔn295后观察到的可能连接的较大小泡相一致。先前的观察也支持了这一观点，即内化分子向溶酶体的传递需要肌动蛋白丝和功能性肌球蛋白的完整性(范·德乌斯等。, 1995;杜尔巴赫等。，1996年a和1996年b;拉波索等。, 1999)以及MMIα的细胞分布。事实上，在核周区和细胞外周区都检测到了MMⅠα，后者发生了晚期内体和溶酶体之间的融合事件，后者可能在溶酶体与质膜的融合中发挥作用，如特梅斯瓦里等。(1996)肌球蛋白Ib网柄柄菌(布奇等。, 2000;拉波索等。, 1999).

器官运输被提议沿着微管进行，以实现远距离运输和通过肌动蛋白丝用于局部递送。该模型表明V类肌球蛋白是以肌动蛋白为基础的分子马达，并得到了不同细胞类型中色素运输和神经元分泌途径中色素运输的研究支持(吴等。, 1998;布里奇曼，1999年). 我们的实验表明，涉及肌动蛋白丝和I类肌球蛋白成员的第二类调控机制控制微管上细胞器的轨迹，因此可能介导微管、肌动蛋白和相关马达之间的合作。

补充材料

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致谢

我们感谢居里研究院（CNRS Institute Curie）的J.B.Sibarita博士就延时视频显微镜和图像分析提出的有益建议，以及J.Plastino博士和F.Amblard博士对手稿的批判性评论。这项工作得到了癌症研究协会（ARC n°5459）向E.Coudray提供的资助。科尔多尼耶是法律控制癌症基金会的受益者。

脚注

V⃞本文的在线版本包含数字视频材料​图2，2,​,5,5,​,7,7、和​和9。9。在线版本可从www.molbiolcell.org获取。

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会