协调的ESCRT和网格蛋白募集波确定了腔内小泡形成的时间和形态

ESCRT蛋白的主要活性在EGFR激活后早期

为了提高分析的时间分辨率，我们决定将荧光标记的ESCRT蛋白用于活细胞显微镜实验。为此，我们使用了现有的稳定细胞系HeLa-CHMP4B-GFP和HeLa-CHMP3-GFP³⁰并使用慢病毒载体产生了额外稳定的HeLa细胞系，其表达接近内源性。ESCRT表达细胞系的表达水平如附图所示¹以及在以下实验中。我们还验证了标记的ESCRT蛋白的表达并没有增加双核或多核细胞的数量或影响其增殖（补充图²). 为了进一步测试标记的ESCRT蛋白的功能，我们进行了救援实验。内源性CHMP4B的耗尽导致EGFR降解受到抑制，这可以在稳定表达抗小干扰RNA（siRNA）的CHMP4B-GFP的细胞系中挽救（补充图^3A–D级). 重要的是，CHMP4B-GFP的存在并没有延迟内源性CHMP4B存在时EGFR的降解，尽管其表达略高于内源性水平（补充图^3A–D级). 同样的救援装置也验证了我们的mCherry-HRS稳定表达细胞系的功能（补充图^3E、F).

在活细胞成像实验中，我们将荧光标记的EGF配体添加到稳定表达荧光标记的内吞标记物或ESCRT蛋白组合的HeLa细胞中2分钟。洗去未结合的配体后，在所有三个通道中每3秒拍摄一帧，获取图像30分钟（图2a个，补充电影¹). 通过这种方式，我们可以遵循EGF配体通过早期（RAB5、SNX15、EEA1）和晚期（RAB7）内吞蛋白标记的降解途径^31,32为了定量EGF与内吞标记物或ESCRT蛋白随时间的变化，我们计算了每帧共现点的平均数量，如图所示2亿正如预期的那样，我们观察到EGF在成像开始后早期与早期内吞标记物重叠最多，在成像开始之后与晚期标记物RAB7重叠最多（图2亿)，与固定细胞成像结果一致（图1亿).

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图2

ESCRT蛋白在EGF刺激后5至15分钟协同作用。一实验装置和电影中的代表性图像显示EGF-Al647被摄入内吞囊泡。比例尺，5µm（左）和1µm。b条通过在通常包含一个或两个HeLa细胞的完整框架上进行半自动阈值分割，在所有三个荧光通道中分割斑点，从而实现内胚体定位的量化。低于阈值距离<5像素（400 nm）的斑点被视为与EGF共现，这在灰度上显示，白色显示最小共现，黑色显示最大共现。正如预期的那样，早期内吞标记物在开始肝细胞成像后的早期时间点与EGF的共现率最高，晚期标记物在后期时间点出现。ESCRT子组合的代表根据示意图进行颜色编码。RAB5:6出口；SNX15:5经验值。；EEA1:7出口。；RAB7:6出口；HRS:55扩展。；HD-PTP:7出口。；TSG101:7出口。；CHMP4B:32出口。；CHMP3:14出口。；VPS4A:13经验。c（c）对单个EGF-阳性内体的追踪显示，随着时间的推移，mCherry-HRS和CHMP4B-GFP的招募和分离及其归一化荧光强度。一个代表性内体在指定时间点的图像以及随时间变化的相应荧光强度测量（单位：min）。来自9个独立实验的30多首曲目的代表性示例。比例尺，0.5µm。d日追踪稳定表达ESCRT-0（HRS）或ESCRT-III（CHMP4B）与其他ESCRT蛋白组合的细胞系中单个EGF-阳性内体。每个组合中≥4个独立实验中≥25个轨迹中的一个代表轨迹随时间的归一化荧光强度。轨迹一直显示，直到内体失去焦点。注意ESCRT蛋白的协同招募和解离，它们显示慢波和渐变波（HRS、HD-PTP、TSG101）或快速和瞬态动力学（CHMP4B、CHMP3、VPS4A）。e（电子）共有23个协调HRS和CHMP4B募集的孤立荧光谱分别在0到100之间进行标准化，然后取平均值。ESCRT波±SD的平均强度分布。来自14个追踪内体、6个独立的活细胞成像实验的数据

我们成功地可视化了来自ESCRT-0（HRS）、ESCRT-I（TSG101）、ESCRT-III（CHMP4B、CHMP3）以及VPS4和Bro1域蛋白HD-PTP的标记亚基，并分析了它们与EGF随时间的共现性。引人注目的是，所有分析的ESCRT和相关蛋白在成像的前15分钟内与EGF的共现率最高（图2亿). 只有TSG101与EGF长期共存，这可能反映了其内化为ILV³³这些发现表明，“早期”和“晚期”ESCRT蛋白在EGFR刺激后的早期就有其主要活性，并且不同的ESCRT亚复合物可能会在同一个内体室中重合。

ESCRT显示出一致和重复的招聘动态

为了详细研究同一内胚体室中“早期”和“晚期”ESCRT的募集和消失，我们利用荧光标记的货物，在活细胞成像实验中可以跟踪30分钟。我们通过降解途径追踪了单个EGF阳性囊泡的内吞摄取。我们观察到，mCherry-HRS（ESCRT-0）和CHMP4B-GFP（ESCRT-III）在同一内体上瞬时重合（图2厘米，上部面板）。荧光强度测量显示mCherry-HRS逐渐积累和分解，CHMP4B-GFP荧光突然上升和逐渐下降（图2厘米中间面板，补充电影²). 当这两种蛋白质同时解离时，招募动力学遵循不同的动力学。长时间追踪同一囊泡显示出多个协同荧光峰，每次当HRS在内体处的荧光强度达到最大值时，CHMP4B被吸收（图2厘米下部面板）。

对其他ESCRT成分的研究表明，它们的动力学与HRS的动力学相似，表现出缓慢波动的波（TSG101，HD-PTP）或快速瞬态的CHMP4B动力学（CHMP3和VPS4A）（图二维). 这将ESCRT亚基分为两个动力学上不同的组，其中ESCRT-0、-I和Bro1结构域蛋白属于“慢型”，ESCRT-III和VPS4A属于“瞬时”型内体定位动力学。通常，在30分钟的时间间隔结束之前，内体上的ESCRT活性停止，这也符合我们对活体成像数据的逐帧分析（图2亿)将主要ESCRT活动置于EGF刺激后的早期时间点。

为了描述内体上的协同ESCRT动力学，我们对几个显示HRS和CHMP4B的追踪内体的23个分离图谱进行了平均（图第二版). HRS显示平均驻留时间（从招募开始到分离的时间）为195±67 s（SD），CHMP4B为80±29 s（SD。起效动力学差异显著，HRS在122±50 s（SD）以上呈缓慢线性累积，CHMP4B在12±5 s（SD。解离动力学与t吨_远离的（HRS）=73±25 s（SD）和t吨_远离的（CHMP4B）=68±27 s（SD），同步发生，表明ESCRT-0和ESCRT-III的协同释放。值得注意的是，虽然CHMP4B完全分离，但HRS通常没有达到基线荧光，尽管显示出明显的荧光降低。综上所述，这些数据表明货物分拣（ESCRT-0）和膜重塑（ESCRT-III）在时间上是协调的。在下文中，我们将这些特征性的协同荧光剖面称为“ESCRT波”。

一个ESCRT波导致一次形成一个ILV

一个关键问题是一个ESCRT募集波是否对应于一次形成一个或多个ILV。为了在超微结构水平上研究ILV的形成，我们用识别EGFR胞外部分的抗体标记表面EGFR，然后在冰上标记与10 nm金（PAG10）结合的蛋白A，以此标记新形成的内体（补充图^4A级). 由于可能的受体交联，标记既没有损害EGFR降解，也没有导致EGF-非依赖性EGFR降解（补充图^4B类). 我们通过在高压冷冻、冷冻替代和电子显微镜（EM）之前的特定时间段内添加EGF配体来刺激EGFR的内吞摄取。

我们决定计算直径在40至60 nm之间的ILV，因为发现人类细胞中依赖于ESCRT的ILV大于40 nm³⁴ILV的平均尺寸约为50 nm³⁵，这也符合我们的测量结果（补充图^4摄氏度). 我们在EGF刺激5分钟后观察到新形成的（金标记）ILV，证实了内吞后ESCRT活性的惊人早期发作（图3a年). 在以后的时间点，内体通常包含多个ILV。值得注意的是，脱落的ILV主要聚集在含有EGFR的HRS/甲氰菊酯涂层附近（图3a、b，补充图^{4D（四维）})，它标志着内吞体的分选微域，在内吞体界膜处呈电子致密结构^5,36,37重要的是，我们还观察到ILV直接位于未标记内体的限制膜下，反对受体通过抗EGFR抗体将ILV简单地栓系在一起。

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图3

一次ESCRT招募波导致每次形成一个ILV。一来自用EGF刺激5、10或15分钟的HeLa细胞的内体的代表性电子显微照片。10纳米金颗粒标记新内化的EGFR（另请参见补充图^4A级). 注意5分钟样品中的ILV出芽情况（箭头所示），随着时间的推移，ILV的数量不断增加，始终靠近内胚体EGFR/HRS/网格蛋白涂层（用箭头标记的边界）。b条对带有多个ILV的金标内体的250 nm厚切片进行电子断层扫描。请注意，完全脱落的ILV（红色）靠近内胚体EGFR/HRS/网格蛋白涂层（蓝色）。c（c）EGF刺激5min后ESCRT波数量的量化（上部直方图）和EGF刺激5 min后电子显微镜下每个内体切片观察到的ILV数量的量化。从21个独立的活细胞成像实验的64个内体中计算ESCRT波。为了进行EM分析，从3个独立样本中分析了至少100个金标记的内体。另请参见补充图^{4 F、G、H}.d日稳定表达HeLa细胞CHMP4B-GFP和mCherry-RAB7的追踪EGF-阳性内体随时间的荧光强度分布。请注意，在内体获得RAB7后，CHMP4B-GFP闪烁继续。该轨迹是5个独立的活细胞成像实验中总共15个轨迹中的一个示例。e（电子）EGF刺激后25分钟，金标记的内体的电子显微照片。注意，该内体显示ILV出芽轮廓（箭头），同时显示降解结构（星号）。箭头表示EGFR/HRS/网格蛋白涂层的边界。所有刻度条，100 nm

接下来，我们计算了活细胞成像前5分钟内ESCRT波的数量，并将其与EM中观察到的金标记内体切片中ILV的数量相关联。从64个分析的内体轨迹中，我们在前5分钟平均观察到1.0±0.8个波（图3立方厘米). 我们观察到平均每150 nm内体切片有0.5个ILV，其中87%的切片有零个或一个ILV（图3立方厘米). EGF刺激5分钟后，金标内体的平均直径为251 nm±129（SD）（补充图^第四版). 由于150 nm厚的EM切片约占5分钟内体体积的一半，因此观察到的ILV数量低于每个内体的ESCRT波数量，这与预期相符。综上所述，这说明每个ESCRT波有几个ILV同步形成。

将此相关性扩展10和15分钟后，每个内体切片的ILV平均数量逐渐增加（补充图^{3英尺，克})这表明ILV随时间线性增加。从20分钟起，一些金色标记的内体显示出降解结构，无法进行进一步的ILV定量分析。EM在EGF刺激后5、10和15分钟观察到的ILV数量与在同一时间点从活细胞成像中观察到的波数量密切相关（补充图^三F、 H），由于我们从未观察到与含EGFR的HRS/甲氰菊酯外壳相关的多个出芽轮廓，因此我们得出结论，一个ESCRT募集波反映了一次一个ILV的形成。

依赖于ESCRT的ILV形成与内体成熟无关

从我们的共现分析中，我们观察到从早期到肝细胞成像约15-20分钟的主要ESCRT活性，而RAB7内体成熟转换似乎发生在约15分钟及以后（图2亿). 为了研究ESCRT招募是否与内体成熟相协调，我们追踪了来自CHMP4B-GFP和mCherry-RAB7双稳定细胞系的EGF-阳性内体。我们经常观察到CHMP4B在获得RAB7的内体上继续募集（图三维). 此外，我们还可以在含有降解结构的内体限制膜上观察到ILV出芽情况（图第三版)，证实ILV的形成和内体成熟/酸化可以并行发生，并且很可能彼此独立。

正常ESCRT动力学需要向内体补充氯菊酯

在哺乳动物细胞中，氯氰菊酯被招募到与内体上HRS相同的微域中^三,5,37为了阐明氯氰菊酯向内体补充的动力学，我们使用了图中介绍的相同的活细胞成像设置和分析2a个Clathrin动力学与CHMP4B动力学相协调，与HRS动力学非常相似（图4a、b)正如预期的那样，因为HRS将网格蛋白募集到内体中^三,37.

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图4

氯氰菊酯的耗尽导致HRS和TSG101在内切体上过度稳定。一荧光强度随时间变化的曲线。在5个（HRS/Clathrin-LC）和4个（CHMP4B/Clathrin-LC）独立的活细胞成像实验中，共有11个（HRS/Clathrin-LC）和13个（CHMP 4B/Clathrin-RC）径迹具有代表性。b条随着时间的推移，网格蛋白和HRS与EGF的框架-框架共定位分析。另请参见图2亿了解详细信息。来自8个独立实验的数据。c（c）Western blot（WB）显示内源性氯氰菊酯HC（CHC）的KD。d日免疫染色显示，在EGF刺激或非刺激的细胞中，mCherry-HRS过度招募到缺乏氯氰菊酯HC的内体。通过高含量显微镜量化每个细胞内体mCherry-HRS的总荧光强度，并表示为AU（×10⁵)±SD。每种条件下，来自4个独立实验的>2500个细胞的数据。控制（−EGF）与siCHC（−EGF）：第页 < 0.001; Ctrl（+EGF）与siCHC（+EGF）：第页 < 0.001 (t吨-测试）。箭头：mCherry-HRS和氯氰菊酯阳性EEA1内体。e（电子）免疫染色显示，内源性HRS过度募集到缺乏氯氰菊酯HC的内体。量化按照d日数据来自4个独立实验中每种条件下>2500个细胞。t吨-测试：***第页 < 0.001. 箭头：mCherry-HRS-和氯氰菊酯阳性EEA1内体。（f）追踪的EGF-阳性内体的活细胞成像和荧光强度曲线随时间的推移显示，在氯氰菊酯HC-depleted细胞内体中，mCherry-HRS的招募时间延长。来自至少4个独立实验的12个（对照）和23个（siRNA网格蛋白HC）轨道的代表性实例。克WB显示内源性氯氰菊酯HC（CHC）的KD。小时免疫染色显示mEGFP-TSG101过度募集到缺乏氯氰菊酯HC的内体。箭头：mEGFP-TSG101定位于中体。我追踪EGF-阳性内体的活细胞成像和荧光强度曲线显示，在氯氰菊酯HC-depleted细胞内体中，mEGFP-TSG101和mCherry-HRS的招募时间延长。来自至少4个独立实验的13个（对照siRNA）和15个（siRNA网格蛋白HC）轨迹的代表性示例。标尺，20µm和5µm（插入）

接下来，我们询问对内体分选微结构域的氯氰菊酯补充的干扰是否会改变ESCRT动力学。因此，我们在表达mCherry-HRS的细胞中通过siRNA耗尽了氯氰菊酯（图4c类). 令我们惊讶的是，当击倒氯氰菊酯（KD）时，mCherry-HRS被过度招募到内体中，这与EGF刺激无关（图第4天). 重要的是，内源性HRS也积累在缺乏氯氰菊酯的细胞内体上（图第四版). 缺乏氯氰菊酯导致EGF-Al647摄取受损；然而，增加EGF浓度会导致荧光EGF的适度摄取，从而可以追踪mCherry-HRS-和CHMP4B-GFP-表达细胞中的内体。与固定细胞成像一致（图第4天，第5天)，对单个内体的跟踪表明，HRS在每波中都有延长的募集，而CHMP4B仍然显示出短暂的动力学（图第4页). 为了研究其他ESCRT复合物是否会受到网格蛋白缺失的影响，我们在mEGFP-TSG101表达细胞中进行了KD实验（图4克). 固定和活细胞成像显示，mEGFP-TSG101稳定，表明TSG101动力学与HRS动力学一样，受到内体上缺乏网格蛋白的影响（图4小时，i).

为了验证我们在网格蛋白KD实验中的发现，并在不干扰其他地方网格蛋白功能的情况下，专门废除网格蛋白靶向内体的做法，我们删除了HRS的网格蛋白盒（图第5页)并产生稳定的细胞系，表达抗siRNA的HRS^重量或HRS⁷⁷⁰.内源性HRS的有效消耗导致HRS替代了内源性HRS^重量或HRS⁷⁷⁰接近内源性水平（图5亿)，并在缺乏内源性HRS的细胞中进行以下实验。HRS⁷⁷⁰之前的研究表明，缺失突变体不能结合氯氰菊酯^三,37我们通过免疫荧光（IF）染色、固定细胞定量共现分析、免疫共沉淀和活细胞成像实验（补充图^{5A、B、C、D}). 与HRS相反^重量，人力资源⁷⁷⁰未能按预期将网格蛋白补充到内体中（补充图⁵A、 B、C、D^三,37).

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图5

内体网格蛋白的缺乏导致HRS在内体上过度稳定。一HRS的结构域和HRS突变体⁷⁷⁰缺乏氯氰菊酯结合域。b条WB显示内源性HRS耗竭和siRNA-resistant mCherry-HRS表达水平^重量或mCherry HRS⁷⁷⁰以HeLa-CHMP4B-GFP细胞系（“C4B”）为背景。c（c）单独或与mCherry-HRS联合稳定表达CHMP4B-GFP的HeLa细胞^重量或-HRS⁷⁷⁰通过siRNA耗尽内源性HRS，如图5b所示。追踪EGF-阳性内体随时间变化的活细胞成像和荧光强度曲线。13个典型示例（HRS^重量)，12（小时⁷⁷⁰)来自3个以上独立实验的8条（无HRS）轨迹。d日单个mCherry-HRS或CHMP4B-GFP波的驻留时间采用盲法手动量化。高分辨率分光计^重量：62（HRS）和55（CHMP4B）波，HRS⁷⁷⁰：29（小时⁷⁷⁰)和83（CHMP4B）波c（c）。错误栏指示SD。t吨-测试***第页 < 0.001，不显著。e（电子）以盲法手动量化mCherry-HRS或CHMP4B-GFP波的周期。仅包括覆盖至少200帧的轨迹。高分辨率分光计^重量：11条轨道，HRS⁷⁷⁰：中描述的数据集中的11条磁道c（c）。错误栏指示SD。t吨-测试**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001，无统计意义

在亲本细胞系中，内源性HRS的耗竭导致CHMP4B没有像预期的那样被招募到内体中（图5c、 上部面板）。mCherry-HRS的表达^重量挽救了CHMP4B-GFP的募集（图5厘米，中间面板），而mCherry-HRS⁷⁷⁰发现其在内胚体上高度富集（补充图第五版)，模仿网格蛋白KD表型（图4d、 e）。对单个内体的追踪表明HRS的补充时间延长⁷⁷⁰而CHMP4B动力学似乎未受影响（图5厘米，下部面板），再次模拟氯氰菊酯消耗（图第4页). 实际上，停留时间的量化（图5天)和周期性（图第五版)显示HRS持续时间更长⁷⁷⁰与HRS相比^重量鉴于HRS中HRS和CHMP4B的周期性测量值相似^重量-表达细胞强调了它们协调的招募模式，它们在HRS中的周期性存在明显差异⁷⁷⁰电池（图第五版)强调了HRS的长期持续性⁷⁷⁰而不是CHMP4B。这表明，氯菊酯调节ESCRT-0（HRS）和ESCRT-I（TSG101）的分离，但不调节ESCRT-III（CHMP4B）。

氯氰菊酯补充到内体影响内体PtdIns3P水平

ESCRT-0对内体的补充依赖于磷脂酰肌醇-3-磷酸（PtdIns3P），它结合HRS的FYVE结构域²⁷因此，我们接下来测试单个内体追踪观察到的特征ESCRT波是否依赖于PtdIns3P。我们通过使用高度特异性抑制剂SAR405抑制PtdIns3P-激酶III类（VPS34）来急性耗尽PtdIns3P³⁸正如预期的那样，HRS向EGF-阳性内体的补充被强烈减少，下游ESCRT组分CHMP4B（图6a–c类). 二甲基亚砜（DMSO）存在时，ESCRT波没有变化，但在SAR405处理的细胞中没有（图6天)EGFR降解严重受损（图第六版)与之前的研究结果一致³⁹.

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图6

缺乏向内体补充网格蛋白会增加PtdIns3P水平。一实验装置如图所示2a个，但添加了DMSO或SAR405。b条活细胞成像的代表性图像显示，SAR405治疗会损害HRS和CHMP4B对内体（箭头）的定位。比例尺，1µm。c（c）帧间共生分析（另请参见图2亿)显示SAR405治疗后HRS或CHMP4B与EGF之间的重叠显著减少。数据来自6个（DMSO）和5个（SAR405）独立实验。HRS和CHMP4B的共现率归一化为DMSO控制的最大值。请注意，CHMP4B对内体的定位非常短暂，因此在任何时间点都只能观察到很少的斑点，因此，SAR405治疗后的共现减少似乎不像HRS那样明显，HRS由于与内体的关联更稳定，因此具有更大的“动态范围”。d日荧光强度随时间的变化曲线显示，DMSO存在时ESCRT波正常，SAR405存在时HRS或CHMP4B缺乏补充。e（电子）WB定量分析显示，严重受损的EGFR在严重急性呼吸系统综合征405治疗后的降解。三个独立实验的平均值±SD。t吨-测试**第页 < 0.01.（f）SAR405治疗导致ILV形成急剧减少。电子显微照片显示EGF刺激15分钟后有代表性的内体。星号：ILV；箭头：形成ILV芽。每个条件下≥100个金标内体中每个内体部分的ILV数量。点图：平均值±标准偏差。t吨-测试***第页 < 0.001. 比例尺，500纳米和100纳米（插图）。克定量高含量显微镜显示mCherry-HRS几乎完全缺失^重量经SAR405处理后从内体中分离。此外，大多数mCherry-HRS⁷⁷⁰在SAR405治疗后消失，但仍有一个稳定的水池。数字：内体HRS的剩余强度（对照组±SD的%）。来自4个单独图像序列中每种情况下≥1600个细胞的数据。比例尺，20µm。小时稳定共表达mCherry-HRS的细胞⁷⁷⁰与mCherry-HRS相比，内体上GFP-2xFYVE的水平增加^重量.总荧光强度±SD。4个独立实验中每种条件下>4000个细胞的数据。t吨-测试**第页 < 0.01. 标尺，20µm和5µm（插入）

为了通过电子显微镜研究SAR405处理细胞的ILV形成，我们通过将EGF配体与SAR405或DMSO一起添加来刺激EGFR的内吞摄取。根据先前发表的使用特异性较低的磷酸肌醇3-激酶抑制剂Wortmannin的结果^39–43，经SAR405处理后内体尺寸略有增加（补充图^第6页)在EGF刺激15分钟后，SAR405处理的细胞显示ILV数量显著减少（图第6页³⁹). 这些发现证实了ESCRT波和ILV形成之间的相关性，并表明内体上重复的ESCRT波反映了MVE的产生。

接下来，我们问超稳定HRS是否⁷⁷⁰将同样依赖于新合成的PtdIns3P作为HRS^重量为此，我们培育了mCherry-HRS^重量-和-HRS⁷⁷⁰-表达用DMSO或SAR405耗尽内源性HRS的细胞。高分辨率分光计^重量在SAR405治疗后，如预期的那样，几乎完全从内体中消失，而HRS⁷⁷⁰在DMSO对照组中，其强度降低到高含量显微镜定量的三分之一左右（图6克). 阐明HRS的池⁷⁷⁰对严重急性呼吸系统综合征405敏感，我们进行了活细胞成像实验。在EGF-Al647摄取的帮助下追踪新形成的内体显示缺乏HRS⁷⁷⁰在SAR405处理的细胞中这些囊泡的补充（补充图^6亿)，类似于HRS^重量（图6天)，而结构对HRS已经有利⁷⁷⁰表现出持续的HRS⁷⁷⁰信号（图6克). 我们将这些数据解释为PtdIns3P对ESCRT-0初始招募的要求，而HRS中发现的超稳定涂层⁷⁷⁰似乎能够抵抗产生PtdIns3P的VPS34酶的抑制。因此，我们试图通过使用2xFYVE探针来研究内体PtdIns3P的水平，该探针与PtdIns3P特异结合，并报告该磷脂的定位⁴⁴我们产生了低表达GFP-2xFYVE的稳定细胞系（补充图^6厘米)其中PtdIns3P与HRS一起出现在早期内体上^重量（图6小时，补充图^第6天)如前所述⁴⁵有趣的是，我们观察到HRS中PtdIns3P的水平严重增加⁷⁷⁰救援情况（图6小时)以及在缺乏氯氰菊酯的细胞中（补充图^第6天)这些结果表明，内体网格蛋白在调节内体PtdIns3P周转中发挥作用。

高效ILV形成需要内体网格蛋白

解决HRS的长期招聘⁷⁷⁰影响EGFR降解，我们进行了救援实验。而HRS耗尽后受损的EGFR降解可以通过HRS完全修复^重量（补充图^3E、F)、HRS⁷⁷⁰突变体不能挽救受损的EGFR降解（图第7页，补充图^第7章)并显示EGFR在EEA1阳性细胞室中积聚（补充图^7亿)³⁷。接下来，我们使用与所述相同的实验装置通过EM分析了货物的定位（补充图^4A级). 在EGF刺激后60分钟的对照细胞中，发现金色标记的EGFR积聚在降解细胞器的内腔中（图7亿). 相反，在HRS中⁷⁷⁰-表达细胞中，金标EGFR积聚在内胚体的界膜中（图7亿). 这可能是由于货物分拣和/或ILV编队受损所致。因此，我们进行了15分钟EGF刺激的EM实验，以计算每150 nm黄金标记内体切片中ILV的数量。如前所述，HRS耗竭导致内体尺寸略有增加³⁴HRS也有同样的趋势⁷⁷⁰突变体（补充图^7摄氏度). 重要的是，在HRS耗尽的细胞中观察到的ILV数量急剧减少³⁴无法被HRS救出⁷⁷⁰突变体（图7c、d). 相比之下，HRS^重量与未受扰动的细胞相比，显示出完全解救（图7c、d). 值得注意的是，HRS的耗尽导致20-40 nm小型ILV的数量增加（补充图^第7天)，这可能表示如上所述，ESCRT相关ILV形成的上调^34,46此外，HRS⁷⁷⁰突变体表现出小ILV的适度增加（补充图^7天). 这些结果表明，氯氰菊酯在ESCRT依赖型ILV的形成中起作用，这对EGFR降解很重要。

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图7

EGFR降解、货物分拣和有效ILV形成需要内体网格蛋白。一mCherry-HRS公司⁷⁷⁰在内源性HRS耗竭后，EGFR的降解并不能挽救。实验与补充图并肩进行^3E、F三个实验的平均值±SD。t吨-测试***第页 < 0.001.b条如图所示，稳定表达的HeLa细胞缺乏内源性HRS5亿并按照补充图所述进行EM处理^4A级在EGF刺激60分钟后，10nm金颗粒标记内化的EGFR。请注意，在HRS中^重量-表达细胞中的金颗粒在降解细胞器内呈簇状，表明金标记的EGFR降解。相反，在HRS中⁷⁷⁰-在表达细胞中，金标记的EGFR仍然存在于限制膜中，它覆盖了表面的大部分，表明货物分拣受损。比例尺，200 nm和50 nm（插图）。c（c）如图所示，稳定表达的HeLa细胞缺乏内源性HRS5亿并按照补充图所述进行EM处理^4A级在EGF刺激15分钟后，10nm金颗粒标记新内化的EGFR。星号表示ILV（直径40–60 nm），箭头表示内胚体EGFR/HRS/甲胎蛋白（HRS）的边界^重量)或EGFR/HRS（HRS⁷⁷⁰)外套。注意，在没有HRS的情况下，完全没有这种电子密度（左侧面板）。比例尺，500 nm和100 nm（插图）。d日每个内体切片ILV数量的量化。数据表示为点图，平均值±SD。Kruskal–Wallis检验：第页 < 0.0001; 邓恩多重比较试验：***第页 < 0.001，无统计学意义。在每种条件下，从至少3个不同的样品中分析了100多个带有金色标记的内体

免疫染色、抗体和试剂

用0.05%的皂苷在PEM缓冲液（80 mM K-Pipes，pH 6.8，5 mM EGTA和1 mM MgCl）中渗透盖玻片上生长的细胞₂)在3%甲醛中固定15分钟之前，在冰上放置5–10分钟，以降低蛋白质细胞溶质池中的荧光信号⁶⁵细胞在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤两次，在含有0.05%皂苷的PBS中洗涤一次，然后用所示的一级抗体染色1h。在PBS中0.05%皂甙中洗涤三次后，用二级抗体染色细胞1hh、 并在PBS中清洗三次。将细胞安装在含有2 mg ml的Mowiol中⁻¹赫斯特33342（Sigma-Aldrich）。

抗体：小鼠抗GFP（克隆7.1和13.1，11814460001，免疫荧光1:400，western blot 1:500）、小鼠抗β-actin（A5316，westernblot 1:10000）和小鼠抗Vinculin（V9131，wester-blot 1:400）来自Sigma-Aldrich，人抗EEA1血清⁶⁶，免疫荧光1:160000）是来自澳大利亚墨尔本Ban Hock Toh的礼物，兔抗HRS（免疫荧光1:100，蛋白质印迹1:1000）已经在前面描述过^三，小鼠抗RAB5（4F11，免疫荧光1:2500）是意大利莱切大学C.Bucci赠送的，兔抗RAB7（D95F2，免疫荧光1:200）是来自细胞信号技术（9367），小鼠抗LAMP1（H4A3，免疫萤光1:2500）来自发育研究杂交瘤库，兔抗HD-PTP来自Proteintech（10472-1-AP，免疫荧光1:100），兔抗CHMP4B如前所述生成⁶⁷（免疫荧光1:500，western blot 1:1000），羊抗EGFR（20-ES04，免疫荧光1:4000，westernblot 1:7000）来自Fitzgerald，小鼠抗EGFR的（555996，EGFR的胞外标记）来自Pharmingen，山羊抗mCherry（AB0040-200，免疫荧光1:1400，westerd-blot 1:1000）小鼠抗网格蛋白HC（X-22，免疫荧光1:500）来自Acris抗体，兔抗网格蛋白HC（ab21679，western blot 1:1000）来自Abcam。用于免疫荧光研究的所有二级抗体均来自杰克逊斯免疫研究实验室或分子探针（生命技术）。用于免疫印迹的二级抗体来自LI-COR Biosciences GmbH，辣根过氧化物酶偶联二级抗体则来自Jackson。SAR405（A8883；ApexBio）的工作浓度为6μM；DMSO（D2650；Sigma-Aldrich）0.2%。

siRNA转染

所有siRNAs均购自Ambion®（赛默飞世尔科技公司），并包含Silencer Select修改。按照制造商的说明，使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂（Life Technologies）转染50%融合率的细胞。用靶向人HRS（5′-GCACGUUCCAGAAUUC-3′）、人CHMP4B（5′-AGAAGAAGAGAGAGACG公司-3′）或人网格蛋白HC（5′-AUCCAUUCGAAGACAAAU-3′）5天。HRS和CHMP4B转基因是小鼠序列，并且对这些siRNA具有抗性。使用非靶向对照Silencer Select siRNA（预先设计，目录号4390844）作为对照。

免疫印迹法

用冰镇PBS清洗细胞，并用25 mM Hepes、pH 7.2（H4034；Sigma-Aldrich）、125 mM醋酸钾（104820；Merck Millipore）、2.5 mM醋酸镁（105819；Merck MilliporemM二硫苏糖醇（DTT；D0632；Sigma-Aldrich）补充有蛋白酶抑制剂混合物（P9340；Sigma Aldrich。裂解液在10%或4-20%梯度凝胶上进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（mini-PROTEAN TGX；Bio-Rad）。蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（TransBlot®Turbo^TM（TM）LF-PVDF，Bio-Rad），然后在含有0.1%吐温-20的Tris缓冲盐水中2%牛血清白蛋白中培养抗体。用荧光二级抗体（IRDye680或IRDye800；LI-COR）孵育的膜是用奥德赛红外扫描仪（LI-COR。使用Odyssey软件对免疫印迹进行量化。请参阅补充图⁹–¹¹用于未截取的膜。

共免疫沉淀

稳定表达mCherry-HRS的HeLa细胞^重量或-HRS⁷⁷⁰（HeLa-CHMP4B-GFP-mCherry-HRS^重量/770)用EGF（50 ng ml）刺激12分钟⁻¹)或未经刺激，在25 mM HEPES（pH 7.2）、125 mM醋酸钾、2.5 mM醋酸镁、5 mM EGTA、0.05%NP40、1 mM DTT、蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich）、磷酸停止（Sigma Aldrich。在16000×克上清液用山羊抗mCherry抗体（每个样品3µg抗体，Acris抗体）和DynabeadsTM蛋白g（10004D，Thermo Fisher）在4°C下旋转20分钟进行免疫沉淀。免疫沉淀物在裂解缓冲液中洗涤三次，用2×样品缓冲液洗脱，并如上所述进行免疫印迹。

脉冲相位实验和共定域分析

对于脉冲相实验，用50 ng ml刺激细胞2分钟⁻¹EGF-Al647（E35351，赛默飞世尔科技公司），然后用温热的DMEM洗涤。在指定的追踪时间后，按照“免疫染色、抗体和试剂”中的描述固定细胞并进行免疫染色。在低于饱和度的固定强度设置下，使用0.7µm共聚焦切片通过共聚焦荧光显微镜获取图像。使用ImageJ插件“JACoP”量化EGF的Colocalization⁶⁸和曼德斯共定位系数（MCC）⁶⁹用于描述EGF与内吞标记物或ESCRT蛋白的重叠。对用50 ng ml刺激的细胞进行相同类型的图像采集和分析⁻¹EGF 12分钟，以评估HRS和氯氰菊酯之间的共定位。

共焦荧光显微镜

共焦荧光显微镜使用蔡司LSM 710或780显微镜（卡尔蔡司MicroImaging GmbH），使用标准滤光片组和激光线以及Plan Apo 63×1.4 N.a.油透镜。一个数据集中的所有图像都是在低于饱和度的固定强度设置下拍摄的。

活细胞成像和定量图像分析

稳定表达荧光标记的内吞标记物或ESCRT的HeLa细胞在MatTek 35 mm玻璃底培养皿中生长（MatTek公司）。用200 ng ml刺激细胞2分钟⁻¹EGF-Al647（E35351，Thermo Fisher Scientific），然后用温暖的Live-Cell Imaging缓冲液（Invitrogen）清洗。在网格蛋白耗竭的细胞和相应的对照中，600 ng/ml⁻¹使用EGF-Al647代替200 ng ml⁻¹.在配备奥林巴斯60×Plan Apochro 1.42数字孔径物镜、三个冷却PCO.edges CMOS相机、固态光源（InsightSSI）和基于激光的自动对焦的OMX V4系统（DeltaVision OMX Microscope Applied Precision，GE Healthcare）上进行了活细胞成像。环境控制由加热阶段和目标加热器提供。5%CO₂湿度通过CO提供₂混合器（Okolab）。在常规模式下以0.33 Hz的帧速率进行三种彩色活细胞成像。GE Healthcare服务人员每年进行两次硬件校准。这个xyz公司校准是定期控制的，必要时由我们的核心设施工作人员使用珠滑进行调整。确保最佳xy公司对于每个实验装置，我们使用“GE Image Registration slide”测试每个活细胞成像会话前后的对齐。需要时，在将图像文件输入反褶积和对齐的后处理之前，利用此幻灯片重新校准对齐文件。使用Softworx软件（Applied Precision，GE Healthcare）对采集的图像进行去卷积和对齐，并在ImageJ/FIJI中进一步处理。需要时，使用ImageJ漂白剂校正对电影进行脱色。使用定制的Python脚本进行逐帧共现分析。简言之，通过半自动阈值法在所有三个通道中分割斑点。当间隔小于5像素（即400 nm）时，分割的斑点被视为共现。计算每部电影每帧中EGF共存点的数量。每个条件下所有电影中每帧共现点的平均数量随时间以灰度值显示。使用定制的Python脚本手动跟踪ImageJ中的单个EGF阳性内体，并测量其随时间变化的荧光强度。为了避免来自同一内体上多个微结构域的荧光信号重叠，只追踪到具有典型荧光ESCRT斑点的小EGF阳性囊泡。

高含量显微镜

Olympus ScanR照明系统具有UPLSAPO 40×物镜，用于从甲醛固定、免疫染色的稳定细胞系中采集和定量大量细胞。在一个实验中，对所有治疗应用相同的成像和分析设置。ScanR分析软件用于背景校正和自动图像分析。用ScanR软件对荧光点进行分割，并在每个细胞中测量分割点的总荧光强度。通过检测Hoechst核染色定量细胞总数。

电子显微镜

HeLa细胞生长在聚乙烯上-我-赖氨酸涂层蓝宝石光盘。为了在EGF刺激后标记新内化的EGFR，首先用冰镇PBS清洗细胞，并用识别EGFR胞外部分的抗体（小鼠抗EGFR，Pharmingen）在冰上培养细胞。用冰镇PBS洗涤四次后，用蛋白质-A-10 nm金结合物（乌得勒支大学细胞生物学系）培养细胞，该结合物可识别小鼠IgG2b一级抗体的Fc部分。细胞再次用冰镇PBS清洗四次，然后用EGF在温热的DMEM中刺激指定的时间，然后进行高压冷冻。使用徕卡HPM100高压冷冻蓝宝石光盘，并按如下方式进行冷冻替代：为蓝宝石光盘设计的样品载体填充4 ml冷冻替代物（丙酮中0.1%（w/v）乙酸铀酰，1%氢₂O） 并放置在配备FPS机器人的温控AFS2（徕卡）中。在将温度升高到−45°C之前，在−90°C下进行48小时的冷冻替代。样品在−45℃下的冷冻替代物中保存5小时，然后用丙酮洗涤3次，随后将温度升高（每小时5°C）至−35°C，然后随着Lowicryl HM20浓度的增加渗透（分别为10%、25%、75%、4h）。在最后两个步骤中，温度逐渐升高至−25°C，然后用100%Lowicryl渗透3次（每次10小时）。随后在−25°C下引发紫外线聚合48小时，然后将温度均匀升高至+20°C（每小时5°C）。然后在20°C下继续聚合24小时。连续切片（约150 nm，用于计数内体中的ILV；150–250 nm用于断层扫描）在Ultracut UCT超微切片机（德国莱卡）上切割，并收集在formvar涂层网格上。在JEOL-JEM 1230电子显微镜中在80 kV电压下观察样品，并使用iTEM软件和Morada相机（德国奥林巴斯）记录图像。在Thermo ScientificTM TalosTM F200C显微镜中观察为层析成像准备的样品，并在−60°和60°倾角之间以2°增量采集图像序列。使用Ceta 16M相机记录单轴序列。使用IMOD软件包，使用加权反投影计算断层图。使用IMOD软件4.9版进行断层图的显示和分割⁷⁰.

在电子显微照片上手动计数，并使用测量工具在FIJI中测量直径和长度。为了确定是否在靠近出芽轮廓的地方发现了金颗粒，我们使用定制的ImageJ宏绘制了一个圆，每个金颗粒周围的像素直径定义为40 nm。当圆圈接触到萌芽轮廓的限制膜时，它被视为近端。

流式细胞术

将细胞固定在70%乙醇中，并用兔抗组蛋白H3（磷酸化S10）抗体（ab5176，Abcam）染色1 h，然后用Alexa Fluor 647山羊抗兔IgG（Jackson）孵育30 min。用Hoechst 33242（1.5µg ml）对DNA进行染色⁻¹). 使用FACS Diva（BD Biosciences）软件在LSRII流式细胞仪（BD bioscience）上进行流式细胞术分析，并使用FlowJo软件分析数据。对于群体中多核细胞的百分比，含有>4N DNA含量的细胞已被选通。

EGFR降解实验

用EGF（50 ng ml）刺激HeLa细胞⁻¹)在含有10%胎牛血清的DMEM中放置15分钟和60分钟，然后在3%多聚甲醛中固定1小时。环己酰亚胺（10µg ml⁻¹)在EGF脉冲前60分钟添加，并在脉冲相实验期间出现，以阻止EGFR的合成。用抗EGFR抗体对细胞进行染色，并用共焦显微镜进行分析，或如上文所述进行裂解和免疫印迹。图中的救援实验第7页和补充图^3E、F他们并排表演，但由于说教的原因，在数字上出现了分歧。IF染色的盖玻片是在与western blots相同的实验中制作的，而活细胞成像是在与KD实验相同的平行读数中制作的。

统计分析和考虑因素

单个实验的数量和所分析的细胞或内体的数量在图例中显示。实验数量根据预期效果大小和实验之间的预期一致性进行调整。我们测试了数据集的正态分布，并使用GraphPad Prism 5.01版选择了相应的测试。未付款t吨-该检验用于检验两个方差相等的样本，而Mann-Whitney检验用于检验方差不等的样本。对于两个以上的样本，我们使用了单向方差分析（ANOVA）或Kruskal–Wallis检验以及适当的事后检验。所有误差条表示每个图形图例中所示的平均值±SD或SEM*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001. 样本未随机用于实验。没有样本被排除在分析之外。

我们感谢Marianne Smestad和Linn F.Kymre在电子显微镜样品处理方面的专家帮助，感谢Anne Engen在细胞培养方面的专家协助，感谢Chema Bassols在IT方面的帮助。我们感谢Anthony A.Hyman和Ina Poser对CHMP4B-eGFP和CHMP3-GFP BAC HeLa细胞的支持，感谢Coen Campstejin对HeLa-HAeGFP-VPS4A细胞系的支持，以及Marte Pedersen-Øverleir对产生稳定细胞系的帮助。奥斯陆大学医院先进光学显微镜和电子显微镜的核心设施提供了相关显微镜。流式细胞术核心设备被公认用于稳定细胞系的分类。E.M.W.是挪威东南部地区卫生局的高级研究员（2015014年拨款）。K.O.S.和C.R.是挪威癌症协会的高级研究员。A.C.承认挪威研究委员会的资助，项目编号263056。S.W.S.由挪威研究委员会资助，作为NALMIN（挪威先进光学显微镜成像网络）的一部分。这项工作得到了挪威研究委员会通过其卓越中心资助计划（项目编号262652）的部分支持。