通过恢复线粒体功能逆转小鼠皱纹皮肤和脱发

减少mtDNA-缺失小鼠的mtDNA、OXPHOS超复合物和酶活性

为了进一步描述mtDNA缺乏小鼠的特征，不同组织（如皮肤）中的mtDNA含量（图2a个)心脏、肺、脑和肝脏（补充图S1（第一阶段）)对mtDNA缺乏小鼠进行了检测。这些组织中线粒体DNA含量的显著下降证实了线粒体DNA缺失小鼠中线粒体DNA的含量普遍下降。mtDNA编码基因的mRNA表达（图2亿)，OXPHOS蛋白的表达（图2厘米)和OXPHOS超复合体的稳定性（图二维)与野生型同窝小鼠相比，mtDNA缺乏小鼠的皮肤中的含量严重降低。我们分析了线粒体DNA缺失小鼠皮肤线粒体OXPHOS复合物的酶活性。OXPHOS复合物I至V的酶活性显著降低进一步证实了线粒体DNA耗竭小鼠的线粒体功能障碍（图2e–i型). 这些观察结果强烈表明，D1135A-POLG1的普遍表达导致mtDNA含量降低，OXPHOS超复合物的稳定性降低，并且在mtDNA-缺失小鼠中OXPHOS复合物的酶活性降低。

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图2

mtDNA缺失小鼠mtDNA含量、基因表达和OXPHOS活性分析

一mtDNA含量的定量（平均值±s.e.m*P（P）<0.05，学生的t吨试验）在野生型对照（WT）的皮肤样品中；n个 = 3） 和mtDNA-dreamer（耗尽器；n个 = 3） 连续dox诱导2个月后的小鼠。b条–d日mtDNA编码基因的RT-PCR分析(b条)OXPHOS亚基的Western blot分析(c（c）)和OXPHOS超复合体的BN-PAGE分析(d日)在连续2个月的dox诱导后，在野生型对照小鼠和mtDNA缺乏小鼠的皮肤中进行。e–iOXPHOS复合物I的酶活性(e（电子）)，二(（f）)，三(克)，四(小时)、和V(我)在连续2个月的dox诱导后，在野生型对照小鼠和mtDNA缺乏小鼠的皮肤中进行。耗尽=mtDNA-耗尽小鼠

mtDNA-deparater小鼠表现为皮肤发炎起皱，表皮增生过度角化，脱发缺陷继发脱发

在8周龄给予dox之前，mtDNA缺失小鼠表现出正常的外观。在dox诱导2周后，头屑的变化是第一个表型症状。用dox诱导头发灰白两周后，头发密度降低，脱发（脱发），驼背，进行性头部畸形（图三a和​和4a），4a类)运动减慢和嗜睡是下一系列表型变化，本质上是衰老过程中自然发生的表型变化的回忆^37,38在这个阶段，mtDNA消耗小鼠的大小和重量的减少是明显的（图3b、c和​和4b）。4b个). 野生型和mtDNA-缺失型小鼠之间的瘦体重/长度比没有显著变化（图三维). 持续诱导POLG1-DN转基因导致其中一些小鼠因严重线粒体功能障碍而死亡。本实验中检测的mtDNA耗竭小鼠总数的50%(n个 = 30）在dox诱导的40天左右死亡，而剩余的mtDNA耗竭小鼠在启动dox诱导后的150天内死亡。

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图3

mtDNA缺乏小鼠的皮肤皱纹和脱发

一连续4-8周的dox-介导诱导后，mtDNA-deparater小鼠出现皮肤皱纹（ii）、脱发（ii）和后凸（iii）。b条–d日体重的定量评估(b条)，车身长度(c（c）)，和瘦质量/长度比(d日)mtDNA-dreaker的(n个 = 30）和野生型对照小鼠(n个 = 30). 数据表示为平均值±s.e.m*P（P）<0.05，学生的t吨测试。e（电子）,（f）脱发的定量评估(e（电子）)和皱纹皮肤(（f）)mtDNA-dreamer的表型变化(n个 = 30）和野生型对照小鼠(n个 = 30）连续诱导60天后

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图4

mtDNA缺乏小鼠的其他表型变化

一mtDNA-deparater小鼠在用dox诱导后表现出强烈的脱发和皮肤皱纹（i）、驼背（ii）、前卵球形头部（iii）和耳廓色素沉着（iv）表型变化。b条mtDNA缺失小鼠的代表性图像显示了与年龄匹配的野生型对照同窝出生的小鼠相比，其大小和外观的总体表型变化。c（c）,d日男性脱发的不同模式(c（c）)和女性(d日)mtDNA消耗小鼠。e（电子）显示连续dox诱导后雌性mtDNA-缺失小鼠皮肤皱纹和脱发逐渐随时间变化的典型图像（i–iv）

所有在dox诱导后存活至少30天的mtDNA缺失小鼠均出现脱发（图第三版). 进一步延长dox诱导的持续时间会导致mtDNA缺乏小鼠脱发模式的逐渐改变（图第四版). 有趣的是，雄性和雌性mtDNA缺失小鼠的脱发模式不同。而雄性小鼠则表现出分散的脱发（图4c类)，雌性小鼠表现出与时间相关的脱发模式，与雄性小鼠相比，总体上脱发更严重（图第4天，第5天). 性激素调节线粒体功能，可能是mtDNA缺乏小鼠脱发模式中观察到的性别差异的潜在机制⁴⁷.

除脱发外，所有mtDNA缺乏小鼠的皮肤皱纹也很明显（图3a–f段). 雌性小鼠表现出更严重的皮肤皱纹（图第4天)与年龄匹配的雄性mtDNA缺乏小鼠相比（图4c类). 在喂食dox饮食的野生型对照组中，我们没有发现任何表型变化（图3a年)在不含dox饮食（正常饮食）的mtDNA-消耗小鼠中也没有。我们对mtDNA缺失小鼠的不同组织进行了组织病理学评估。有趣的是，在dox诱导2个月后，在mtDNA缺乏小鼠的脑、肝、心肌和肺切片中，除了细胞大小减少外，没有观察到显著的组织学变化（图5). 保持细胞大小需要最佳的线粒体功能⁴⁸因此，细胞尺寸减小可能是这些器官线粒体功能障碍的迹象。在表型和组织学水平上，皮肤是第一个也是受影响最大的器官。

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图5

mtDNA缺失小鼠不同组织的组织学分析

野生型对照组大脑（大脑）、肝脏、心脏（心肌）和肺的代表性苏木精和伊红染色横截面(n个 = 3） 和mtDNA缺乏小鼠(n个 = 3） dox诱导2个月后

对野生型和mtDNA缺乏小鼠皮肤苏木精和伊红染色切片的检查显示，所有皮肤分区的组织学存在显著差异（图6). 野生型动物皮肤呈现典型的休止期皮肤形态，表皮薄，由1-2层角质形成细胞组成，真皮无炎症浸润，绝大多数毛囊处于休止期（图第6页，面板i和ii）^49,50与之形成鲜明对比的是，mtDNA缺乏小鼠的皮肤具有增生和过度角化的表皮，4-6层角质形成细胞使人联想到由基底层、棘突层和颗粒层组成的病理性人类表皮，其上覆盖着角化不全（主要）和致密的正角化鳞片（图第6页，面板iii–vi）。通过mtDNA缺乏小鼠皮肤中增殖标记PCNA（增殖细胞核抗原）的增加表达进一步证实了这种表皮增生（图6e、f). 表皮增生是外源性衰老的常见特征之一，与皱纹的形成有关^51–53表皮厚度增加主要是由于棘皮病，棘层和颗粒层厚度增加，通常在小鼠中不存在（图6b条). 明显的过度角化，包括角化不全和角化过度（图第6页，面板iii–vi）。角质细胞增生伴过度角化延伸至毛囊漏斗部，其中漏斗部被角化塞堵塞。这也与漏斗状（表皮样）滤泡囊肿的形成有关，其中一些囊肿破裂，继发肉芽肿和化脓性炎症（图第6页，面板iii和v）。大多数毛囊出现病理改变（图6a–d日). 尽管有证据表明两种休止期的卵泡循环和卵泡数量增加（图第6页c)和anagen（图6天)与野生型小鼠相比，在mtDNA-deparater小鼠中，这些卵泡是异常的，并且没有在mtDNA deparated小鼠中产生正常的毛干。相反，毛囊中主要含有角质碎屑，只有少数发育中的发干碎片和畸形。因此，脱发不是由于毛囊消失或停止骑行所致；相反，毛囊功能失调，不能产生正常的毛干或完全丧失这种能力。此外，注意到肥大皮脂腺的异常形成（图第6页第三和第六组），一些区域让人想起人类皮肤中的皮脂腺痣。

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图6

mtDNA缺失小鼠皮肤的组织学和显微镜分析

一野生型对照组背部皮肤苏木精和伊红染色切片(n个 = 3） （i和ii）和mtDNA-消耗小鼠(n个 = 3） （iii–vi）在连续2个月的dox诱导后。野生型小鼠的皮肤显示出正常的皮肤组织学（i，×10），而mtDNA-dreamer小鼠的皮肤则显示出增生的表皮，伴有过度角化（黑色箭头），功能失调的毛囊中含有角质碎屑和/或畸形的毛发（黄色箭头），增加真皮（箭头）中炎性细胞的数量（iii，×10）。高倍镜下的皮肤切片显示，野生型对照小鼠中存在正常休止期毛囊（ii，×40），以及异常休止期（iv，×40。第五组显示mtDNA缺乏小鼠的滤泡囊肿破裂，周围有肉芽肿和混合炎性浸润。b条–d日表皮厚度定量(b条)，休止期毛囊(c（c）)，和管理(d日)毛发周期阶段（平均值±标准差*P（P）<0.05，学生的t吨试验）在野生型对照的皮肤样品中(n个 = 3） 和mtDNA-dreaker(n个 = 3） 连续dox诱导2个月后的小鼠。e（电子）野生型对照皮肤PCNA免疫染色横截面的代表性图像(n个 = 3） 和mtDNA缺乏小鼠(n个 = 3） dox诱导2个月后。这些图像中的基底膜位置用虚线标记。（f）表皮增殖定量（PCNA⁺)来自野生型对照的皮肤样本(n个 = 3） 和mtDNA-dreaker(n个 = 3） 连续dox诱导2个月后的小鼠。克野生对照皮肤样品的电子显微照片(n个 = 3） 和mtDNA缺乏小鼠(n个 = 3） dox诱导2个月后。mtDNA缺乏小鼠的皮肤显示线粒体结构严重紊乱，嵴丢失，线粒体内结构退化。耗尽=mtDNA-耗尽小鼠

为了建立皮肤变化与线粒体DNA应激之间的联系，我们用电子显微镜分析了皮肤样品。电子显微镜分析显示，mtDNA缺乏小鼠皮肤中存在严重退化的线粒体，线粒体嵴丢失（图6克). 总之，这些研究表明，整个动物体内线粒体DNA的缺失主要导致表皮增生和过度角化导致的皮肤皱纹，以及毛囊发育异常和丧失产生发干能力导致的脱发。

mtDNA缺乏小鼠的皮肤炎症

皮肤皱纹是皮肤内在和外在衰老的标志。线粒体基因组的改变与皮肤的外源性衰老有关⁵⁴mtDNA-缺失小鼠真皮中存在粗糙的皮肤皱纹，伴有明显的棘皮病和炎性细胞，呈现出类似于人类皮肤外源性老化的特征⁵⁵。我们检查了mtDNA缺失小鼠皮肤切片中是否存在炎症浸润（图第6页). 虽然对照组小鼠没有皮肤炎症反应，但mtDNA缺失组小鼠表现出明显的混合性皮肤炎症浸润，在表皮和附件结构中也有不同程度的浸润。浸润主要是淋巴组织细胞，含有中性粒细胞、肥大细胞和一定程度的嗜酸性粒细胞（图第6页). 在滤泡囊肿破裂的区域，以中性粒细胞浸润伴肉芽肿反应为主。为了更好地确定炎症细胞的性质，我们进行了免疫细胞化学和组织化学研究。这些证实了包括肥大细胞（Giemsa染色阳性细胞，图7a、b)，粒细胞（MPO阳性细胞，图第7页)巨噬细胞和组织细胞（CD163阳性细胞，图第7页)，B淋巴细胞（Pax-5阳性细胞，图第7页)和T淋巴细胞（CD3阳性细胞，数据未显示），以及mtDNA缺乏小鼠的毛囊周和表皮周位置。野生型小鼠的皮肤切片主要对MPO、CD3、CD163和Pax-5染色呈阴性，并且仅偶尔显示肥大细胞。花朵状皮肤炎症反应进一步支持线粒体功能障碍和炎症之间的因果关系^56,57。我们观察到炎症基因的表达增加，例如IFNB1公司,IL28a号、和CCL5号机组与野生型小鼠的皮肤样品相比，mtDNA缺乏小鼠的皮肤样本（图第7页c). 我们的研究显示核因子-κB和环氧合酶2，一种核因子-κB（NF-κB）调节的炎症介质，与野生型窝友皮肤相比，mtDNA缺乏小鼠皮肤中的炎症介质（图第7页c). 这些观察结果表明，炎症导致mtDNA缺乏小鼠的皮肤老化。

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图7

mtDNA缺乏小鼠的皮肤炎症

一皮肤切片的免疫细胞化学和组织化学分析显示，真皮中存在数量增加的炎症细胞，包括肥大细胞（Giemsa染色阳性细胞）、粒细胞（MPO阳性细胞）、巨噬细胞和组织细胞（CD163阳性细胞）以及B淋巴细胞（Pax-5阳性细胞），以及mtDNA缺失小鼠的卵泡周和表皮周位置。野生型小鼠的皮肤切片MPO、CD163和Pax-5染色主要为阴性。箭头表示皮肤切片中存在炎症细胞。b条野生型对照小鼠和mtDNA-缺失小鼠皮肤切片中Giemsa阳性肥大细胞的定量分析（平均值±s.e.m*P（P）<0.05，学生的t吨测试）。c（c）野生型对照（WT）皮肤RNA样本中炎症基因的RT-PCR分析；n个 = 3） 和mtDNA耗竭小鼠（耗竭；n个 = 3） 连续诱导2个月后。d日野生型对照皮肤RNA样本中基因的RT-PCR分析(n个 = 3） 和mtDNA缺乏小鼠(n个 = 3） 连续诱导2个月后。耗尽=mtDNA-耗尽小鼠

mtDNA-缺失小鼠皮肤基质金属蛋白酶表达的改变

皮肤起皱与胶原蛋白纤维的丢失有关⁵⁸蛋白水解酶基质金属蛋白酶（MMPs）及其组织特异性抑制剂组织抑制剂金属蛋白酶-1之间的紧密平衡(TIMP1公司)对保持皮肤中胶原蛋白纤维的含量至关重要⁵⁹。我们的研究表明基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9和表达减少TIMP1公司在mtDNA缺乏小鼠中（图7天). 1型胶原α-1的表达(第1列)是皮肤胶原蛋白从头合成中的一个重要基因，保持不变（图7天). 这些研究表明，mtDNA缺失小鼠的皮肤皱纹相关标志物失调。

mtDNA缺乏小鼠衰老标志物表达的改变

为了在分子水平上表征皮肤皱纹与衰老的相关性，我们分析了与mtDNA缺乏小鼠皮肤固有衰老相关的标记物的表达。内源性衰老样分子标记的表达增加IGF1R型,血管内皮生长因子，MRPS5和表达减少纺神星提示mtDNA缺乏小鼠存在固有衰老（图8)^60–62这些观察结果表明线粒体功能障碍导致皮肤老化。

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图8

阿金相关标记物在mtDNA缺乏小鼠中的表达

显示mRNA表达分析的代表性图像IGF1R型,血管内皮生长因子,MRPS5型、和纺神星通过RT-PCR检测野生型对照皮肤样本中的基因（固有衰老标记基因）(n个 = 3） 和mtDNA缺乏小鼠(n个 = 3） dox诱导2个月后。耗尽=mtDNA-耗尽小鼠

组织学和免疫组织化学分析

背部皮肤和其他组织用缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，切片（5µM），苏木精和伊红染色。皮肤切片用Giemsa染色检测肥大细胞，而MPO、CD3、CD163和Pax-5抗体用于免疫组织化学分析检测其他类型的炎症细胞⁷³.

RT-PCR和mtDNA含量分析

为了通过RT-PCR测量相对基因表达，使用Trizol（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）从皮肤样品中分离出总细胞RNA。样本中约有1000–2000 ng RNA被归一化，cDNA是使用Iscript cDNA合成试剂盒（美国加利福尼亚州Hercules的Bio-Read实验室）生成的。然后使用Green Taq PCR混合物（Promega，Madison，WI，USA）和补充表中给出的基因特异性引物对cDNA进行RT-PCRS1（第一阶段）PCR产物在1.5-2%琼脂糖凝胶上运行，并使用凝胶记录系统拍照。每个PCR中至少使用三个生物复制品。β2-微球蛋白或RNU6B作为每个PCR的内部对照。如前所述，对皮肤和其他组织中的线粒体DNA含量进行了分析⁷⁴.

BN-PAGE和蛋白质印迹分析

如前所述进行线粒体分离⁷⁵为了分析线粒体OXPHOS超复合物，对从皮肤样品中制备的线粒体组分进行了蓝活性聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE），如前所述⁷⁶根据标准免疫印迹法对皮肤样本中线粒体OXPHOS亚基的蛋白表达进行检测。使用含有针对OXPHOS复合物亚单位的初级单克隆抗体（美国俄勒冈州尤金市Mitosciess）的预混合鸡尾酒，在BN-PAGE分析中检测OXPHOS超复合物，并在免疫印迹分析中检测其亚单位的蛋白表达。电压依赖性阴离子通道（VDAC）或β-肌动蛋白抗体用作负荷对照。

氧磷配合物的酶活性分析

如前所述，分离的线粒体用于测量OXPHOS复合物的酶活性⁷⁷.

透射电子显微镜

如前所述，对皮肤样品进行透射电子显微镜分析⁷⁸使用FEI-Tecnai电子显微镜拍摄图像。

这项工作得到了退伍军人管理局1I01BX001716和NIH R01 CA204430向K.K.S.提供的资助，以及NIH向A.S.提供的1R01AR071189-01A1和R01AR0.73004的部分资助。最初的POLG小鼠是由K.K.S.在罗斯维尔公园癌症研究所开发的。