国际分子科学杂志。2018年6月；19(6): 1599.
蝉蜕对IgA肾病大鼠模型细胞因子和凋亡调控蛋白的影响
,1,2 ,1,2 ,三 ,1,2 ,三，4 ,三和1,*
2国家林业局（乌鲁木齐）经济林产品质量检测中心，乌鲁木奇830052
4哈尔滨医科大学，哈尔滨150081，中国
2018年3月26日收到；2018年5月22日接受。
摘要
蝉壳，蝉的蜕壳脓疱隐球菌Fabricius在中药中具有发汗、抗惊厥、镇静、解热和抗过敏作用。然而，免疫球蛋白A肾病（IgAN）的确切发病机制尚不清楚，因此阻碍了新的治疗药物的研究。通过注射牛血清白蛋白、脂多糖和四氯化碳建立大鼠IgAN模型，同时建立血瘀证和热证模型。处死动物以检测尿液和血液中蛋白质水平的变化。采用免疫荧光法评估肾小球中的IgA沉积。采用酶联免疫吸附法测定支气管肺泡灌洗液（BALF）中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的水平。采用血液学和伊红染色、周期性酸-Schiff、TUNEL（TdT-介导的dUTP Nick-End标记）和免疫组织化学染色来评估肾组织的组织病理学变化。此外，通过蛋白质印迹法测量靶点相关蛋白。蝉周介导致血液和尿液蛋白质水平下降。与IgAN组相比，蝉周处理组的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著降低。此外，MCP-1（单核细胞趋化蛋白-1）、TLR4的减少((类Toll受体4))观察到IgA表达水平和caspase 3表达的剂量依赖性增加，以响应蝉周处理。蝉周处理组肾组织中TGF-β1（转化生长因子-β）水平降低，而Fas水平升高。本研究结果表明，蝉蜕在IgA肾病大鼠模型中诱导细胞凋亡，改善肾脏炎症和纤维化。
关键词：蝉周，IgA肾病，炎症，纤维化，凋亡
1.简介
免疫球蛋白A肾病（IgAN）是世界上最常见的肾小球肾炎类型[1]. IgA肾病的特征是肾小球系膜中主要由聚合IgA组成的免疫沉积物[2,三,4,5]. 肾范围蛋白尿、镜下血尿和肾功能损害是不良临床结局的有力预测因素[6,7,8]. 成人IgAN患者进展为慢性肾病的风险明显高于儿童。蛋白尿IgAN患者进展为慢性肾病（CKD）和肾功能衰竭的风险增加[9]. 肾脏受累是最严重的长期并发症；其症状包括无症状的微量血尿和/或轻度蛋白尿至显性IgAV肾炎（IgAVN）[10]. IgAVN，约30%的儿科患者在初次出现后4-6周内出现[11]和严重的IgAVN都与肾功能下降、高血压、低蛋白血症和长期肾后遗症有关。目前对IgAVN的治疗，包括类固醇和免疫抑制剂，主要基于对IgAN的研究结果[12]. 最近，牛津大学提出了国际IgA肾病网络和肾脏病理学会工作组提出的IgA肾脏病新分类[13]这一点已被众多研究所证实[14,15,16,17,18]. 该组确定了与肾脏疾病进展相关的四种组织病理学特征：系膜高细胞评分（M；M0≤0.5，M1≥0.5）、毛细血管内增生（E；E0：无，E1：存在）、节段性肾小球硬化/粘连（S；S0：无；S1：存在，以及肾小管萎缩/间质纤维化的严重程度（T；T0≤25%，T1:26–50%，T2≥50%）。然而，IgAN的确切发病机制尚不清楚，因此阻碍了研究调查以确定治疗这种特殊疾病的新型治疗药物。
中药蝉蜕是脓疱隐球菌Fabricius，俗称黑蝉。蝉蜕有甜味和咸味，产生“冷却”效果。蝉蜕在中医中被称为蝉蜕，历史上用于治疗喉咙痛、声音嘶哑、瘙痒、痉挛等症状。蝉蜕的粗提取物可以用作镇静、降温、抗惊厥药[19]、抗氧化、抗炎[19,20]解热、抗过敏药[21]以及交感神经节阻滞剂[22]当通过各种途径进行管理时。据我们所知，这是首次使用IgAN模型研究蝉周在炎症和纤维化中的分子机制。
2.结果
2.1. 蝉蜕对蛋白尿及其他生化指标的影响
我们检查了大鼠的外观和生化参数。IgAN大鼠呈灰色头发，生长缓慢，活动量减少。成型后24小时收集大鼠尿液，观察到IgAN大鼠出现肉眼血尿，但正常组和治疗组均无表达。IgAN大鼠模型的尿蛋白、血尿素氮（BUN）和血清肌酐（Src）水平显著高于正常健康对照组，而治疗组的尿蛋白、血尿素氮（BUN）和血清肌酐（Src）水平显著低于对照组(). 这些发现表明，在IgAN大鼠模型中，蝉周虫治疗降低了蛋白质、BUN和肌酐（CREA）水平。
24小时尿蛋白、血尿素氮（BUN）和血清肌酐（Scr）水平的变化*第页< 0.05, **第页与免疫球蛋白A肾病（IgAN）模型组相比<0.01。A： 正常、健康对照；B： IgAN大鼠模型；C： 醋酸泼尼松组（PAG）；D： 雷公藤多苷片组；E–G：治疗组，分别服用0.5、1和2 G/kg蝉蜕。
结果表明，与正常健康对照组相比，IgAN大鼠模型中的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、球蛋白（GLOB）、尿素氮（BUN）、总胆固醇（TCHO1）、CREA和TG水平显著升高，而血清ALT、AST、TP、ALB、GLOB、BUN、TCHO1、CREA、，与IgAN模型组相比，蝉蜕周处理组的TG水平显著降低。
血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶、总蛋白（TP）、总胆固醇（TCHO）、三酰甘油酯（TAG）、血尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）水平的变化*第页< 0.05, **第页与IgAN模型组相比<0.01。A： 正常、健康对照；B： IgAN模型组；C： 醋酸泼尼松组；D： 雷公藤多苷片组；E–G：治疗组，分别服用0.5、1和2 G/kg蝉蜕。
2.2. 蝉蜕对IgA的影响
为了评估蝉蜕对IgA水平的影响，我们通过ELISA（酶联免疫吸附法）测量了血清IgA水平(a） ●●●●。模型组的IgA水平显著高于未治疗对照组，而治疗组的Ig A水平显著低于模型组。
蝉蜕对IgA沉积的影响。(一)蝉蜕对IgAN大鼠血清IgA水平的影响(*第页< 0.05, **第页< 0.01). (b条)肾小球IgA的免疫荧光染色。A： 正常、健康对照；B： IgAN模型组；C： 醋酸泼尼松组；D： 雷公藤多苷片组；E–G：接受0.5、1和2 G/kg蝉蜕皮的治疗组。
免疫荧光染色观察肾小球中的IgA沉积(b） ●●●●。对照组大鼠肾小球中的IgA沉积最小，平均荧光强度为“−”(). 相反，IgAN大鼠表现出显著的团状或粒状红色荧光，评分为“+”到“++++”；然而，这些图像并没有提供厚环区沉积增加的证据。大多数荧光在肾小球中观察到。这些发现表明IgAN动物模型已成功建立。
表1
| 集团 | 控制 | IgAN模型组 | 醋酸泼尼松组 | 雷公藤糖苷片组 | 蝉群 |
|---|
|
| 0.5克/千克 | 1克/千克 | 2克/千克 |
| IgA存款 | − | ++++ | + | ++ | +++ | ++ | + |
2.3. 蝉周对IgAN大鼠炎症的缓解作用
为了研究蝉蜕对大鼠肾脏炎症反应的影响，我们检测了大鼠血清中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。与未经治疗的对照组相比，IgAN模型组的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著升高，而治疗组的这些水平显著低于IgAN模式组(). 这些数据表明，蝉蜕治疗可降低血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平，表明蝉蜕具有抗炎特性，可缓解IgAN诱导的大鼠肾纤维化。
蝉蜕对IgAN大鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）水平的影响(*第页< 0.05, **第页< 0.01). A： 健康、正常对照组；B： IgAN模型组；C： 醋酸泼尼松组；D： 雷公藤多苷片组；E–G：治疗组，分别服用0.5、1和2 G/kg蝉蜕。
2.4. 介壳虫对炎症细胞浸润的影响
使用苏木精和伊红（H&E）对接受蝉蜕皮的哮喘小鼠进行组织病理学评估(a） 和周期性酸盐（PAS）(b） 染色。未治疗对照组(a） ，肾脏宽大，豆形，有光泽，呈红棕色。未观察到肾小球和肾小管组织的变化。肾组织结构完整且组织良好，肾小球大小正常，肾小管无任何肿胀或变性迹象，间质区无炎症细胞浸润或纤维化。肾小管上皮细胞大小正常，远端小管未显示任何可检测到的扩张迹象。肾小管内可见少量透明小管，间质内未见明显炎性细胞浸润。在模型组中，研究了肾小球肥大、肾间质水肿以及间质区大量炎性细胞浸润和纤维化。醋酸泼尼松和雷公藤多苷片治疗组显示肾小球体积稍大，有少量炎性细胞浸润。蝉周组的肾脏明显增大，呈深红色，有少量炎性细胞浸润。
蝉蜕可改善肾脏炎症和纤维化，并诱导细胞凋亡。(一)苏木精和伊红（H&E）染色。(b条)定期酸-雪夫（PAS）染色。(c（c）)TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色。
在未经治疗的对照组中(b） 未见增生性肾小球基底膜、系膜或肾小球硬化。模型组可见肾小球系膜和基底膜小管增生，肿胀伴节段性肾小球硬化，肾小球血管环塌陷，血管周围炎性细胞浸润。醋酸泼尼松和雷公藤多苷片治疗组肾小球系膜增生，基底膜不明显，炎症细胞浸润最小。蝉蜕周治疗组表现为系膜增厚，但优于模型组，并有少量炎性细胞浸润。
2.5. 蝉周在IgAN大鼠模型中诱导细胞凋亡
为了了解蝉周是否在体内诱导细胞凋亡，对Sprague-Dawley（SD）大鼠的石蜡切片进行H&E染色(a） ●●●●。TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）阳性细胞数量的增加清楚地表明检测到了细胞凋亡(c） ●●●●。细胞凋亡的微观迹象显示，由于染色质凝集，细胞收缩，细胞质凝缩，呈明亮的嗜酸性，细胞核小而致密，呈黑色。a、 未经处理的对照组c细胞无染色质凝集，细胞大小正常。模型组检测肾小球上皮细胞染色质凝集和凋亡。醋酸泼尼松和雷公藤多苷片治疗组的炎症细胞凋亡罕见。蝉周治疗组的染色选择TUNEL结果清楚地表明蝉周在体内诱导炎症细胞凋亡。
2.6. 蝉蜕对TGF-β1-和Fas-阳性细胞的影响
a显示肾小球的一个区域TGF-β1免疫染色阳性，而盐处理组未观察到这一点；模型组TGF-β1免疫染色面积较大(a） 在使用0.5、1.0和2.0g/kg/天剂量的蝉周处理组中检测到较小的面积。醋酸泼尼松和雷公藤多苷片治疗组肾小球内TGF-β1阳性区域显著增加。肾脏切片免疫组织化学染色显示，醋酸泼尼松显著降低IgAN大鼠TGF-β1的分泌(第页< 0.05,第页与IgAN模型组相比<0.01；b） ●●●●。与免疫组织化学染色结果一致，ELISA还揭示了知了介对TGF-β1表达的抑制作用(c） ●●●●。
蝉蜕对肾脏TGF-β1水平的影响。(一)代表性免疫组织化学图像。A： 正常、健康对照组；B： IgAN模型组；C： 醋酸泼尼松组；D： 雷公藤多苷片组；E–G：给予0.5、1和2 G/kg蝉蜕皮的治疗组；(b条)肾组织中TGF-β1蛋白的定量分析。数据表示平均值±标准偏差(**第页与模型组相比<0.01）；(c（c）)蝉蜕对IgAN大鼠组织TGF-β1水平的影响(**第页< 0.01).
与盐处理组相比，IgAN大鼠体内Fas阳性细胞的数量更低(a） ●●●●。蝉周处理组Fas阳性细胞数量增加。b显示醋酸泼尼松诱导FAS表达显著增加(第页<0.01），而IgAN组的IgAN显著低于正常健康对照组，并且在给予蝉周后以剂量依赖性方式增加。与未治疗的对照组相比，模型组通过ELISA测定的FAS水平较低，而与模型组相比，治疗组的FAS水平显著诱导(c） ●●●●。
蝉蜕对肾脏中FAS水平的影响。(一)代表性免疫组化图像A：正常、健康对照组；B： IgAN模型组；C： 醋酸泼尼松组；D： 雷公藤多苷片组；E–G：给予0.5、1和2 G/kg蝉蜕皮的治疗组；(b条)肾组织Fas蛋白的定量分析。数据表示平均值±标准偏差(**第页与模型组相比<0.01）；(c（c）)蝉蜕对IgAN大鼠组织中FAS水平的影响(**第页< 0.01).
2.7. TLR4、MCP-1、IgA和Caspase 3表达水平的评估
采用Western blotting检测单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、Toll样受体4（TLR4）、IgA和caspase 3的表达水平，并使用β-actin进行归一化。与模型组相比，蝉周处理组大鼠的TLR4、MCP-1和IgA表达受到显著抑制。蝉周处理组大鼠TLR4、MCP-1和IgA的表达显著低于模型组。显示正常健康对照组的TLR4、MCP-1和IgA表达水平较低，而IgAN组的水平明显较高。然而，蝉周处理后，TLR4、MCP-1和IgA的表达逐渐下降。这些发现表明，蝉蜕治疗减轻了IgAN大鼠MCP-1、TLR4和IgA的表达。未经处理的对照组表现出比IgAN组相对更高的胱天蛋白酶3表达水平。然而，蝉周处理后，caspase 3的表达逐渐增加。Caspase 3活性是大多数凋亡事件中不可或缺的一步。在本研究中，蝉蜕处理导致caspase 3上调。这些结果表明，蝉皮在诱导IgAN大鼠细胞凋亡中起着关键作用。
大鼠肾组织中TLR4、MCP-1、IgA和caspase-3的表达。(一)通过Western blotting分析TLR4、IgA、MCP-1和caspase-3的表达水平。(b条)TLR4、IgA、MCP-1和caspase-3蛋白水平的定量分析。A： 健康、正常对照；B： IgAN模型组；C： 醋酸泼尼松组；D： 雷公藤多苷片组；E–G：接受0.5、1和2 G/kg蝉蜕皮的治疗组。数据表示平均值±标准偏差(**第页与模型组相比<0.01）。
3.讨论
IgA肾病的特点是半乳糖缺乏型IgA1（Gd-IgA1）水平升高，并伴有肾炎，目前认为Gd-Ig A1在两种IgA肾脏病的发病机制中起着关键作用。此外，在IgA肾病和IgAN患者的肾小球中发现了含有IgA的复合物。IgA肾病会损害肝脏，M.Zaidi等人报道，到目前为止，与IgAN相关的肝炎与甲型、乙型和丙型肝炎继发的病毒感染有关[23]. 研究表明，IgAN模型组的ALT和AST水平显著升高。在本研究中，我们发现毛细血管内高细胞化、肾小管萎缩和间质纤维化对肾脏存活率有负面影响。此外，慢性病变，如肾小管间质纤维化，与IgAN患者预后不良有关[24,25]. 迄今为止，IgAN的发病机制尚不清楚，它常常导致肾小球硬化。以前的研究表明，促炎性细胞因子，如IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8和TNF-α，可能在IgAN炎症和肾小球损伤的发展中起到加重作用[26,27,28,29]。
类Toll受体（TLR）是哺乳动物先天免疫系统的关键组成部分。众所周知，TLR参与各种炎症疾病的发病机制，包括肾脏疾病，如缺血性急性肾损伤、器官移植排斥反应和免疫介导的肾小球肾炎[30]. 在肾脏中，TLR4主要在近端和远端小管以及鲍曼氏囊上皮中表达[31,32,33,34,35]而肾小球和内皮细胞中的表达极少[36]. 在应激或炎症条件下，肾单位不同区域TLR4的表达上调[31,37]. 先前的研究表明，TLR4介导的IL-6、IL-1β和MCP-1的上调与TLR4和MCP-2的表达显著相关。MCP-1在炎症中起着中心作用，并通过将目标细胞（包括巨噬细胞、单核细胞、T细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）聚集到小管间质中而导致小管间体损伤，而目标细胞本身会分泌细胞因子，如TGF-β1和TNF-α[38,39]. 这些研究还表明，肾脏TLR4的表达与MCP-1、TGF-β1和IL-6的表达密切相关，从而表明TLR4在慢性肾脏病理生理学中起着关键作用。严重蛋白尿患者的肾脏TLR4表达上调，因此提示炎症和纤维化进程加重。除了炎症反应外，氧化应激会导致活性氧的形成，从而导致肾损伤[40]. TGF-β1参与肾小管间质纤维化的发生[41,42]. 此外，本模型中系膜细胞和炎症细胞分泌的TGF-β1与炎症反应和细胞外基质的积聚密切相关[43,44]. TGF-β1基因表达增加与肾小球硬化相关[45]肾小管间质损伤加重。本研究的结果表明，在大鼠模型中，高剂量和低剂量的知了可以显著降低血液和尿液中的蛋白质表达。此外，高剂量蝉被确定比低剂量更有效。在这些动物的肾小球中也观察到显著的IgA沉积。这些发现表明成功建立了IgAN大鼠模型。本研究结果显示，血清IgA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著降低，进而抑制肾小球系膜细胞及其细胞外基质的生长，改善IgAN症状，保护肾功能。免疫组织化学分析显示IgAN模型肾小球中TGF-β1免疫染色面积较大()在0.5、1.0和2.0 g/kg/天剂量下，蝉皮处理后，其含量显著降低。与IgAN动物模型相比，蝉周处理的大鼠TLR4、IgA和MCP-1下调。总之，本研究表明，施用蝉蜕可以改善肾组织炎症和纤维化过程。
众所周知，肾小球细胞凋亡有助于调节肾细胞增殖，并诱导受损肾组织的修复。肾小球细胞凋亡的程度与肾小球细胞数量减少、细胞外基质积聚、系膜细胞增殖和肾小球硬化进展中的蛋白尿相一致[46]. Fas也称为凋亡抗原-1或分化簇95，是死亡受体家族的成员，是肿瘤坏死因子受体超家族的一个亚家族[47]. Fas与其天然配体（Fas L）或激动性抗体的相互作用诱导反应性细胞凋亡[47]. 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）/IL-1β转化酶家族成员[48]caspase 8、9和10通过启动凋亡的内源性和外源性途径直接激活。先前的研究表明，caspase 3的表达与人类细胞中Fas和Fas L的表达呈正相关[49,50]. 本研究表明，caspase 3的表达与Fas的表达相关，与以前的报道类似[49,50,51]. 本研究还确定，如TUNEL染色所示，Fas和胱天蛋白酶3在肾组织中上调，并与肾小球损伤有关。此外，与盐水处理组相比，IgAN大鼠中Fas阳性细胞的数量和参与胱天蛋白酶3途径的蛋白质的表达减少。然而，蝉周处理组显示Fas阳性细胞数量和caspase 3表达水平增加。因此，Fas和caspase 3表达增加促进了IgAN大鼠细胞的凋亡。
总之，肾组织的病理学评估表明，与IgAN大鼠相比，大剂量蝉蜕处理的大鼠表现出较少的肾脏炎症和纤维化。我们还确定，施用蝉蜕皮可显著降低IgAN大鼠中TLR4、TGF-β1、MCP-1和IgA的表达。本研究的结果还表明，Fas及其下游信号分子（如caspase 3）表达的增加可能缓解患者的IgAN症状。
4.材料和方法
4.1. 试剂
根据制造商的说明，使用大鼠TNF-α（中国上海西塘）、IL-6（上海西塘。兔抗TLR4多克隆抗体（Boster Biological Technology，Pleasanton，CA，USA）、兔抗IgA多克隆抗体用于检测相应的靶蛋白。放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液（Solarbio Biological Technology，北京，中国）、双辛酸（BCA）蛋白检测试剂盒（Solarbia Technology）、辣根过氧化物酶（HRP）结合二级抗体（Boster Biological Tech）和增强化学发光（ECL）检测试剂盒也采购了。
4.2. 醋酸泼尼松提取物的制备
蝉蜕干是从中国新疆的一个中药市场购买的，由沈阳药科大学中药学院卢金才教授鉴定。凭证样本（编号20081001）保存在沈阳药科大学自然医学研究部。干燥的蝉蜕（5 kg）用70%乙醇（50 L）回流三次，以获得粗提取物。
4.3. 动物
雄性SD大鼠140只，平均体重140±20g，取自乌鲁木齐市动物中心（证书编号：SCXK（xin）2011-0003，中国乌鲁木奇）。SD大鼠在恒温（18°C）、恒湿（45%）、12小时光/暗循环的洁净室中饲养。在喂食前一周使用试纸条法进行常规尿液检测。选择无血尿或蛋白尿的大鼠，并随机分配到各组。所有动物实验均按照机构批准的方案进行，并符合《实验动物护理和使用指南》（石河子大学医学院附属第一医院动物实验伦理检查批准书，批准号A2017-154-012017年1月5日）。
4.4. IgAN模型的建立
根据IgA肾病模型和热药灌胃建立IgAN动物模型，用于建立血瘀热证。将大鼠随机分为以下七组：未经治疗的对照组、IgAN模型组（IgAN组）、醋酸泼尼松对照组（PAG组，6.3 mg/kg）、雷公藤苷片对照组（9.4 mg/kg），三组分别口服蝉蜕皮（0.5、1和2 g/kg）。通过注射牛血清白蛋白（BSA）、脂多糖（LPS）和四氯化碳（CCl）建立大鼠IgAN模型4)如前所述() [52,53,54]，稍作修改。简言之，免疫原BSA连续8周每两天灌胃一次，剂量为4 mL/kg，以及0.1 mL CCl4每周给药一次，连续给药九周。在治疗的第六周，每隔两周通过尾静脉注射0.05 mg LPS（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA），再持续六周，以建立血瘀和热综合征，这些症状是IgAN模型的特征。第九周，以10 mL/kg的剂量每两天灌胃一次25%姜汁汽水（表2），连续四周。对于未经处理的对照组，用4 mL/kg蒸馏水代替BSA，用0.4 mL蓖麻油代替蓖麻油和CCl4第6周用生理盐水代替LPS。给药方法与模型组相同。
表2
| 控制 | BSA被蒸馏水取代；PBS用作喷射控制 |
|---|
| IgAN公司 | 牛血清白蛋白，4 mL/kg | 每2天腹腔注射一次，持续8周 |
| CCL公司4/蓖麻油（25%，v（v）/v（v）) | 皮下注射（S.C.），0.4 mL，每周一次，持续9周 |
| 脂多糖，0.05毫克 | 尾静脉注射，每两周一次，持续6周，第6周 |
| 25%姜汁汽水，10 mL/kg | 第9周连续四周每两天一次 |
4.5。样品采集和制备
在16周治疗结束时，使用代谢笼收集24小时尿样，并根据24小时尿蛋白、BUN和血清肌酐（Scr）的水平确定模型。牺牲后从腹主动脉采集血样，并使用自动生化分析仪测量ALT、AST、TP、TCHO、TAG、BUN和CREA。
此外，在不同时间点处死各组大鼠，并收集其肾脏进行组织学检查。每个肾脏分为三部分。将第一部分固定在40 g/L甲醛中，包埋在石蜡中，切成切片，然后用曙红（H&E）和周期性酸雪花（PAS）染色以进行光学显微镜检查。将第二部分包埋在最佳切割温度化合物（OCT）中，并保存在−70°C下，然后冷冻切片进行免疫荧光染色。第三部分保存在−70°C下进行Western blotting。
4.6. 血清样本的生化分析
血液样本在4°C下以1500 rpm离心10分钟，以分离血清，并立即将其储存在−80°C下。根据制造商的说明，使用商用ELISA试剂盒测定血清IgA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平。使用微孔板阅读器（Thermo Varioskan Flash 3001，Waltham，MA，USA）测定光密度值，并在曲线的线性部分进行计算。实验在相同条件下重复了三次。
4.7. 组织病理学检查
采血后，肾脏固定了10%(v（v）/v（v）)中性福尔马林24小时。为了加强固定，将肾脏放在一个橡胶盖的壶腹瓶中，瓶内装2/3的10%(v（v）/v（v）)中性福尔马林，然后抽真空，使组织完全浸没。肾组织石蜡包埋，切片（莱卡，Nussloch，德国），厚度为5μm，并用H&E染色，用于随后的细胞浸润观察。或者，用PAS染色切片以检查粘液生成。使用Image-Pro Plus 6.0（美国马里兰州贝塞斯达的媒体控制论）对粘液生成进行定量分析。
4.8. 免疫荧光
将5μm厚的冷冻肾切片安装在玻璃载玻片上并风干。用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的多克隆兔抗IgA抗体（稀释为1:10）对组织切片进行染色。使用五阶段半定量方法对IgA沉积进行分级，如下所示：（−），低倍镜下无染色，高倍镜下可能染色；（+），低倍镜下可能染色，高倍镜下染色；（++），低倍镜下染色，高倍镜下明显染色；（+++）低倍镜下明显染色，高倍镜下染色更强烈；（++++），高倍镜下染色非常强烈。在本研究中，IgAN模式组的大多数染色范围为++到++。
4.9. TUNEL分析
TUNEL染色试剂盒购自罗氏公司（瑞士巴塞尔）。染色程序如下。（1） 通过将载玻片浸泡在二甲苯中使组织切片脱蜡，并通过将载片依次浸泡在乙醇梯度上使其再水化。（2） 添加0.3%H可抑制内源过氧化物酶活性2哦2持续10分钟，然后在10 mmol/L PBS（pH 7.4）中洗涤三次，每次5分钟。（3） 切片在室温下用20μg/mL蛋白酶K消化25分钟，然后在10 mmol/L PBS（pH 7.4）中洗涤三次，每次5分钟。（4） 将TUNEL反应混合物添加到每个部分中，然后在37°C的潮湿室中培养60分钟。（5） 然后，将载玻片在10 mmol/L PBS（pH 7.4）中洗涤三次，每次5分钟，并在37°C的潮湿室中与过氧化物酶结合抗体孵育30分钟。然后将载玻片在10 mmol/L PBS（pH 7.4）中洗涤三次，每次5分钟。（6） 组织切片用DAB染色5分钟，用苏木精复染，脱水，用二甲苯清除，并用玻璃片覆盖。
4.10. 免疫组织化学染色
将石蜡包埋组织切片脱蜡、水合，用5mmol/L左旋咪唑处理以阻断内源性碱性磷酸酶，并在室温下与阻断血清孵育30分钟以减少非特异性背景染色。将切片在磷酸盐缓冲盐水/0.1%BSA中再水化15分钟，然后再添加适当的阻断血清15分钟。将切片与多克隆兔抗TGF-β1（1:1000稀释；美国加利福尼亚州特梅库拉Chemicon）和兔抗FAS 15 g/mL（美国加利福尼亚州圣克鲁斯Santa Cruz Biotechnology）孵育在4°C下过夜。第二天，冲洗载玻片，用生物素化山羊抗兔IgG（英国马萨诸塞州Abcam）孵育，然后使用碱性磷酸酶-链霉亲和素-生物素免疫过氧化物酶法（中国北京中山生物科技有限公司）进行处理。用苏木精对组织切片进行复染。通过用正常兔血清替换一级抗体，平行进行特异性标记的阴性对照。使用计算机辅助图像分析软件（CX41光学显微镜；日本东京奥林巴斯）对肾皮质切片进行数字成像和定量检测。为了定量肾小管间质室中糜蛋白酶阳性TGF-β1的数量和FAS阳性表达的面积，在400倍放大镜下对肾皮质区连续选择的50个区域进行了检查。排除了含有肾小球和大动脉的区域。为了量化TGF-β1和FAS在肾小管间质室的表达，通过图像分析计算阳性染色比例区域和整个区域的平均百分比。
4.11. 蛋白质印迹分析
根据制造商的说明，使用NE-PER试剂盒（皮尔斯生物技术公司，美国伊利诺伊州罗克福德）从肾组织中提取核蛋白和细胞质蛋白。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，并将其转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上（Millipore Corp.，Billerica，MA，USA），然后将其与抗TLR4抗体（Cell Signaling Technology，Lexington，KY，USA，抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抗体（细胞信号技术）、抗MCP-1抗体（细胞信息技术）和抗β-肌动蛋白抗体（细胞信令技术）在4°C下过夜。清洗后，将膜与辣根过氧化物酶偶联二级抗体孵育1h。用TBST清洗五次后，在室温下将膜与HRP偶联抗体孵养1h。使用ECL（Thermo，立陶宛，EU）制备蛋白质印迹，并在柯达射线胶片上曝光。
4.12. 统计分析
数据表示为至少三个独立实验的平均值±SD，并使用ANOVA进行评估，然后进行Bonferroni校正。第页<0.05被认为具有统计学意义。使用SPSS 17.0统计软件（IBM、芝加哥、伊利诺伊州、美国）程序进行分析。
致谢
新疆自治区林业科学基金（XLK，（2014）049号，命名为“挥发性成分检测的关键技术及其在林业资源开发中的应用”）支持了本研究。
作者贡献
L.Y.和J.-H.W.构思并设计了实验；A.N.和Y.W.进行了实验；L.Y.和P.C.分析了数据；R.K.和H.L.贡献了试剂和材料工具。
工具书类
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