用错配PCR-RFLP检测EGLN2启动子中的4-bp插入/缺失多态性及其与乳腺癌易感性的关系

摘要

引言

乳腺癌（BC）是女性中最常见的癌症，被确定为全球女性癌症死亡的第二大原因（Bray等人，2013年）。BC是伊朗女性中最常见的癌症，占所有癌症的21.4%（Babu等人，2011年）。尽管BC的确切病因尚未揭示，但有人认为遗传因素在BC的发展和进展中起着关键作用（Omrani等人，2014；Eskandari-Nasab等人，2015；Rezaei等人，2016）。

缺氧是实体瘤的一个主要特征，它会导致肿瘤细胞基因表达的改变，以适应缺氧环境（Brahimi-Horn等人，2007年）。缺氧诱导因子1（HIF-1）是缺氧诱导的基因的主要转录激活物（Semenza，1999）。HIF-1在实体肿瘤的发生和协调细胞对缺氧和氧稳态的反应中起着关键作用（Maxwell和Ratcliffe，2002；Semenza，2007；Kaelin和Ratcliff，2008）。HIF-1的表达水平由三种脯氨酰羟化酶域酶（PHDs）、PHD1、PHD2和PHD3牢牢调节（Appelhoff等人，2004；Willam等人，2004）。脯氨酸羟化酶（PHD）通过特定残基的脯氨酸羟基化参与HIF-1的催化降解（Appelhoff等人，2004年；Stolze等人，2006年）。

PHD1由EGLN2（Egl九同源物2）基因编码，该基因定位于染色体19q13.2（Ryan等人，2014）。EGLN2的4-bp ins/del多态性（rs10680577）已被揭示与包括肝细胞癌（HCC）（Zhu等人，2012）、非小细胞肺癌（Che等人，2014）和结直肠癌（Li等人，2017）在内的癌症风险相关。据我们所知，没有关于rs10680577变异对BC风险影响的报告。因此，我们进行了一项病例对照研究，以调查伊朗东南部人群样本中rs10680577多态性与BC风险之间的可能关联。

材料和方法

这项病例对照研究对134名组织学确诊的BC患者和154名年龄匹配的健康女性进行了研究。招生过程和研究设计此前曾在其他地方报道过（Sanaei等人，2016年；Hashemi等人，2017年；Sanaei等，2017年）。招聘的伦理批准来自扎赫丹医学科学大学当地伦理委员会，并获得所有参与者的知情同意。血样采集于EDTA管中，用盐析法提取基因组DNA。

基因分型

我们设计了错配聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCR-RFLP），用于EGLN2基因启动子内rs10680577（4-bp ins/del）多态性的基因分型。在多态位点-4 bp处将错配的C引入正向引物中，以创建AleI限制位点。正向和反向引物分别为5`-CCGTATAAAAAGATACTTAAAATACAC-3`和5`-TTGGAATCAAGTGGTCGTCG-3`。

每个0.20 ml PCR反应管由1μl基因组DNA（~100 ng/ml）、1μl每个引物（10μM）、10μl 2X Prime Taq Premix（Genet Bio，韩国）和7μl ddH2O组成。PCR条件为95°C持续5分钟，然后在95°C、57°C和72°C分别进行30个周期的30 s、30 s和30 s，最后在72°C延长5分钟。PCR产物（10μl）用AleI限制酶消化（马萨诸塞州贝弗利新英格兰生物实验室）。消化产物在含有0.5μg/mL溴化乙锭的2.5%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外透射仪上观察并拍照图1del等位基因消化并产生224和31 bp片段，而ins等位蛋白未消化（259 bp）。对于基因分型的质量控制，大约20%的随机样本被重新分型，再现性为100%。

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图1

使用错配聚合酶链反应-限制片段长度多态性（PCR-RFLP）的EGLN2 rs10680577（4-bp ins/del）多态性照片。M： DNA标记；lane1：ins/ins基因型；车道2：ins/del；车道3：del/del。

结果

研究组包括134名BC患者，平均年龄49.0±11.2岁，154名健康女性，平均年龄47.4±11.6岁。两组之间在年龄方面没有统计学上的显著差异（p=0.218），显示出令人满意的频率匹配。

病例和对照组中EGLN2 ins/del多态性的基因型和等位基因频率分布如所示表1在BC患者和对照组之间，我们没有观察到基因型和等位基因频率的显著差异（P>0.05）。

测定EGLN2 4-bp ins/del多态性与临床病理特征（包括年龄、TNM分期、肿瘤分级、雌激素和孕激素受体状态以及人类生长因子受体2（HER2）状态）之间的关系。研究结果表明，EGLN2 4-bp ins/del多态性与HER2状态之间只有显著相关性表2.

讨论

据我们所知，这是首次研究EGLN2 4-bp ins/del多态性与BC风险的相关性。我们的发现不支持EGLN2多态性与BC风险之间的关联。Zhu等人（2012）观察到4-p-del等位基因与肝细胞癌（HCC）和PHD1表达的风险显著相关。

Li等人（2017年）发现ins/del和del/del基因型显著增加了结直肠癌（CRC）的风险。Wang等人（2014年）报告称，纯合子4-bp del/del在中国人群中显著增加胃癌（GC）风险。Che等人（2014）发现杂合子ins/del基因型与非小细胞肺癌（NSLC）风险增加显著相关。

研究结果表明，PHD1的表达水平与肿瘤发生或预后不良有关（Zhang等人，2009年；Gossage等人，2010年；Andersen等人，2011年；Chen等人，2011；Peurala等人，2012年；Kaufmann等人，2013年）。4-bp ins/del（rs10680577）位于EGLN2基因转录起始位点上游-1641 bp处。因此，基因型-表型关系可能由差异启动子多态性相关调控机制介导。由于该变体位于RERT-lncRNA的内含子区域内，因此rs10680577可能通过影响其折叠结构影响RERT-lncRNA的表达，进而影响EGLN2的表达，这是合理的（Zhu等人，2012）。

PHD1的表达也与BC的高增殖有关（Peurala等人，2012）。Zhang等人（2009）已经表明，在乳腺癌中雌激素诱导的PHD1活性通过调节细胞周期蛋白D1来增加细胞增殖。PHD1活性的丧失降低了Cyclin D1的表达，从而减少了BC的发生（Zhang等人，2009年）。

总之，我们的研究结果表明，在伊朗东南部人群样本中，EGLN2 4-bp ins/del多态性与BC风险无关。为了了解EGLN2 4-bp ins/del多态性对BC风险的影响，需要在样本量较大的不同人群中进行复制。

致谢

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