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国家公社。2018; 9: 2582.
2018年7月3日在线发布。 数字对象标识：10.1038/s41467-018-05006-w
预防性维修识别码：PMC6030133型
PMID：29968713

聚合物诱导碳酸钙液体前体的微观结构

徐一飞,1,2 科恩·C·H·蒂杰森,三 保罗·波曼斯,1,2 阿纳特·阿基瓦,1,2 海纳·弗里德里希,1,2 阿诺·P·M·肯金斯,通讯作者三和尼科·A·J·M·索末迪克通讯作者1,2
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摘要

许多生物矿物晶体通常通过瞬态非晶前驱体形成复杂的非平衡形状。体外晶体也可以以非平衡形态生长，例如薄膜或纳米棒。在许多情况下，这涉及到形成聚合物诱导液体前体（PILP）的带电聚合物添加剂。这里，我们调查CaCO三采用多种技术，包括低温TEM和NMR，基于PILP工艺。最初的产物是30–50 nm的无定形碳酸钙（ACC）纳米粒子，具有约2 nm的纳米颗粒结构。我们发现聚合物在早期与ACC强烈相互作用，并在结晶过程中被排除在外，在此过程中未检测到液-液相分离。我们的结果表明，“PILP”实际上是由聚合物驱动的ACC簇合物的组装，其宏观上的类液行为是由于组装物的小尺寸和表面性质所致。我们认为类似的生物聚合物稳定纳米颗粒相可能在生物矿化中起作用。

关于前驱体和矿物晶体形成的复杂过程，该领域存在很多争议。在这里，作者报告了对聚合物诱导的CaCO液体前体中形成的结构的研究三并对该过程提出新的解释。

介绍

在骨或贝壳珍珠层等生物矿物中，矿物晶体的形成通常是由高电荷的生物聚合物引导的1–4尽管它们具有固有的晶体对称性，但它们经常被塑造成复杂的非平衡形状5，通常通过非晶前体相的沉积和转化6–10在体外也可以通过与无机带电（生物）聚合物的相互作用实现对晶体形态的类似控制11–15以及有机物16材料，这在CaCO中得到了最广泛的证明三17–23在后一种情况下，存在带电聚合物，如聚天冬氨酸（pAsp）18，聚丙烯酸（pAA）17,24，聚烯丙胺盐酸盐（pAH）19和双链DNA（ds-DNA）23可以稳定无定形碳酸钙（ACC）25，并在特定条件下导致类液体前体的形成，这已在形成具有非平衡形态的晶体中进行了探索18–22据报道，这种所谓的聚合物诱导液体前体（PILP）的液滴（Ø100 nm–5μm）26可以在固体基底上聚合并形成薄膜18–20或渗入纳米孔20,21转化为固体ACC，随后结晶为方解石或球霰石18保留了它们的形态。这些非平衡形态的形成归因于PILP的类液体性质，能够润湿固体基底，或被毛细吸收到纳米孔中18,21.

首次报告CaCO的PILP三基于原位光学显微镜（OM）18然而，在后来的论文中，PILP的存在（及其液体性质）主要是通过使用原子力（AFM）对干燥样品的静态观察推断出来的27，扫描电子（SEM）21,28或透射电子显微镜（TEM）22PILP流动性的直接证据只能通过在水合状态下的表征获得，例如低温TEM或液相核磁共振（NMR）光谱。在低温TEM下，PILP液滴有望成为边缘光滑的连续物体19,29,30此外，液-液相分离应通过液相核磁共振测量中的额外峰来反映31直到2012年，Cantaert等人。19使用低温TEM显示液滴的可变形性，以及Bewernitz等人。32习惯于13证明CaCO存在的C核磁共振波谱三带有T的组件2弛豫时间和自扩散系数与液相一致。

然而，目前的PILP液滴模型无法解释一些实验观察结果。例如，发现PILP液滴具有凝胶状弹性33与通常显示中间接触角的传统液体相比，PILP在不同基底上显示完全润湿（接触角=0°）或非润湿（接触角>150°）行为34此外，CaCO三PILP工艺产生的薄膜似乎由聚集的~100 nm大小的ACC纳米粒子（NP）组成27,35如果PILP确实由液滴组成，则应生成具有光滑表面和均匀内部的产品。

也有人建议在生物矿化过程中采用PILP工艺26，其中带电聚合物参与控制结晶过程1–4，并生成类似的非平衡形态5事实上，在许多CaCO中也观察到非常相似的~100nm纳米颗粒结构三贝壳珍珠层等生物矿物36或者海胆脊椎37,38电荷密度接近生物矿化蛋白的多肽能够产生PILP相20使用带电多肽形成胶体稳定的纳米颗粒磷酸钙球也有助于用磷灰石纳米晶体外渗透胶原纤维39在生物学中，类似的过程可能是活跃的。因此，除了实现晶体材料形态控制的重要性外，了解PILP过程可能会导致对生物矿物形成过程的机械洞察。

在这里，我们使用多种表征技术（包括低温TEM和NMR）研究了PILP的形成和转化过程。通过在不同生长阶段收集的玻璃化液体样品，低温透射电镜独特地使我们能够以纳米分辨率监测产品在天然水合状态下的演变40。我们专注于几种CaCO三包括使用pAsp的原型系统和最常见的系统。通过将实验结果与其他已知系统（如ds-DNA、pAA和pAH）的实验结果进行比较，我们证明了该过程的通用性。ds-DNA的使用尤其有利于这项研究，因为ds-DNA（2.4 nm）的直径允许低温TEM显示矿化过程中的生物聚合物41和DNA主干中的磷酸基团允许在核磁共振中检测磷信号42,43.

二维（2D）和三维（3D）高分辨率低温TEM与傅里叶变换红外（FTIR）、pH和[Ca的结合2+]测量、动态光散射（DLS）/ζ电位测量、电感耦合等离子体光学发射光谱法（ICP-OES）以及液体和固体NMR光谱法为PILP的微观结构提供了独特的见解，表明它们实际上是30–50 nm的ACC NP，具有约2纳米颗粒结构。结果表明，PILP实际上是ACC簇合物的聚合物驱动组装，其宏观上的类液行为是由于组装物的小尺寸和表面性质所致。

结果

PILP过程的SEM和OM可视化

CaCO公司三/聚-（α，β）-DL-天冬氨酸（pAsp，mw=2000–11000 g mol−1)使用文献程序制备分散液（设置如补充图所示第1页)，并显示出PILP系统典型的结晶行为18.在亲水性玻璃载玻片上，这种薄膜如预期的那样形成（图第1页)延伸超过毫米，随着时间的推移转化为方解石或球霰石的结晶板（图1b，c，另请参见补充图2对于拉曼光谱），有时也会转换成3D对应物（图。1b，c)18在相同的实验条件下，在不存在pAsp的情况下，在30分钟内形成了约20μm大小的方解石晶体（补充图三)显示了pAsp抑制结晶和稳定ACC相的能力。当径迹蚀刻聚碳酸酯膜暴露在这种分散液中时，棒状CaCO三在pAsp存在的情况下，在50或200 nm孔内形成具有凹面尖端的晶体（图1天和插图，另请参见补充图4和补充表1)与之前关于PILP增长系统的报告一致20,21然而，在没有pAsp的情况下，只有少量的短CaCO三在轨道蚀刻膜内形成纳米棒（补充图4a和d），显示其尖端的晶面（补充图5).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为41467_2018_5006_Fig1_HTML.jpg

CaCO的SEM和OM观察三25mg/L的薄膜形成过程−1pAsp和10 mM CaCl2.一–d日干燥产品的SEM图像。一5小时后在玻璃载玻片上形成的薄膜。插图是一张放大图像，显示了薄膜中约60纳米大小的NP。b条,c（c）方解石和球霰石血小板在24小时形成，插图中也分别显示了3D晶体。d日棒状碳酸钙三在具有200 nm大小孔的径迹蚀刻膜内形成的晶体。插图显示了纳米棒的凹面尖端。e（电子）–小时微分干涉对比光学显微镜（DICOM）分别在反应开始后151、248、266、335分钟对薄膜形成过程进行原位观察。形成于e（电子）。黄色圆圈突出显示了一个约2μm的运动粒子，其放大图像显示在插图中。晶体血小板在薄膜内成核（f），并逐渐成长克和小时结晶血小板生长前沿附近的薄膜开始溶解克溶解延伸至薄膜边缘，薄膜完全溶解于小时。薄膜的边界由中的黄色虚线突出显示e（电子）–克。方解石薄血小板以黄色箭头突出显示（f）–小时。胶片的溶解正面由中的紫红色阴影线突出显示克。比例尺：d日和插入e（电子）：2微米。插入（共页）一和d日：100纳米。其他图像：10μm

原位差分干涉对比光学显微镜（DICOM，设置如补充图所示6)显示了无定形膜的形成及其在结晶血小板成核和生长时的溶解（图1e–h). 与Gower等人的原始观察结果一致。18在薄膜形成过程中，在玻璃/溶液界面附近观察到约2μm大小的移动颗粒（插图第1页，另请参见补充图7和补充电影1). 然而，从未观察到Gower等人提出的结果。18这些颗粒沉积并随后与薄膜结合。

PILP过程的2D和3D CryoTEM可视化

为了进一步研究薄膜形成的机理，从不同生长阶段的结晶溶液中采集样品，并通过低温TEM进行可视化。生长约150分钟后观察到最早的产物，即直径约50 nm的NP（图2a个，参见补充图8,9用于早期的低温TEM图像）。高倍率图像显示，NP似乎由~2nm亚基的组装体组成（图的插图。​图2a），2a个)与使用传统（干）TEM在pAA/ACC水凝胶中观察到的结果类似44NP随后增大并聚集形成更大的结构，但没有像液滴所预期的那样结合形成边缘光滑的连续物体（图2亿，另请参见补充图10通过低温TEM观察液滴的预期形态）。在约250分钟时，通过NP的进一步聚集观察到薄膜形成的开始（图2厘米)，如选区电子衍射（SAED，插图2厘米). 同样在冷冻干燥后（参见补充图11)，聚集体的形态保留了它们的粒状外观，类似于之前用传统TEM观察到的35，表明它们是由NP聚集而非聚合形成的。该结果与我们之前使用类似反应条件但不存在聚合物的低温TEM研究形成了鲜明对比45其中形成了无精细结构的ACC NP，并在5分钟内发生结晶。

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CaCO的CryoTEM观察三使用10mM CaCl的薄膜形成过程2.一–c（c）显示25 mg L产品形态演变的图像−1不同生长阶段的pAsp。一~60 nm大小的NP（150–200分钟）。插图是显示~2纳米大小亚单位的放大图像。b条聚合NP（200–250分钟）。c（c）由NP聚集的薄膜（250–300分钟），插图中的SAED图案显示其为非晶态。d日–（f）2.5 g L生长的产品图像−1ds-DNA。d日大约30 nm大小的NP（30-60分钟）。插图是显示~2纳米大小亚单位的放大图像。e（电子）聚合NP（60–120分钟）。（f）NP聚集的薄膜（约120分钟），插图中的SAED图案显示其为非晶态。克–k个2.5 g L生长NP的层析成像−1ds-DNA（30分钟）。克Tomo将序列图像倾斜0°。小时–j个从NP中心偏移0、4.6或21.6 nm的计算机生成横截面切片Z轴-轴。k个四个NP连接在一起的横截面切片（60分钟），表明它们是空心的。小时–k个采用中值滤波（滤波器尺寸为3×3×3像素），以消除噪音，提高能见度。断层扫描的金色标记用黄色圆圈高亮显示d日,e（电子）、和克中的黄色箭头突出显示了一些ds-DNA分子d日,e（电子）和小时–k个。比例尺：c（c）和（f）：500纳米。插入（共页）c（c）和（f）：5纳米−1.其他图像：20 nm

除pAsp外，还有其他带电荷官能团的聚合物，如pAA17,24，pAH19，多肽20和ds-DNA23已经证明可以诱导CaCO三矿化行为具有PILP过程的所有特征（薄膜形成、多孔基质渗透）。相比之下，CaCO薄膜三使用ds-DNA作为结晶控制剂，按照公布的程序，即从10 mM CaCl中生长2含有2.5 g L的溶液−1ds-DNA（300 bps，mw≈225000 g mol−1)23.所使用的ds-DNA（来自鲑鱼精子，与我们最初的工作相同）含有少量Mg（15.25 Mg g−1，见补充表中的ICP-OES结果2)，导致镁2+结晶溶液中约1.6 mM的浓度。预计这不会显著影响结果，因为Mg2+仅显著影响CaCO矿化三Mg:Ca浓度比≥1时46.

在与pAsp相同的实验条件下，ds-DNA还促进了纳米孔内圆柱形晶体的生长（参见补充图4和补充表1)，尽管它不如pAsp有效。30–60分钟后，低温TEM观察到直径约为30 nm的NP，这些NP与在pAsp存在下形成的NP几乎相同，并且似乎也由约2 nm亚基组装而成（图第2天和插图）。然而，在这种情况下，大分子（ds-DNA，图中用黄色箭头突出显示）第2天)可以观察到，与~2nm亚基相互缠绕并突出到溶液中。就像在pAsp存在下形成的NP一样，ds-DNA基NP聚集形成非晶薄膜（图2e、f，另请参见补充图12)转化为PILP系统典型的板状晶体。在这种情况下，也没有观察到液相聚结的迹象。在pAA或pAH（25 mg L−1)-诱导PILP过程（补充图13)强调了我们观察结果的普遍性。值得注意的是，不同聚合物诱导的组装尺寸不同（约200pAH可以观察到纳米大小的组装体）和形状（pAH或ds-DNA诱导的粒子似乎比pAsp或pAA形成的粒子更球形），这可能是由于聚合物的不同性质（例如摩尔重量、电荷密度、长度等）造成的。同时，当pAH在较高浓度（1000 mg L）下使用时−1)事实上，正如Cantaert等人最初报道的那样，观察到了液滴状物体。19（补充图14).

使用低温电子断层扫描（Cryo-electronictomography，3D cryoTEM）对NP的3D结构进行可视化，显示它们几乎是球形的，表面不规则粗糙（图2克–j，另请参阅补充影片2). 观察到Ds-DNA分子突出颗粒表面（图2小时，j，黄色箭头），但由于缺乏对比，无法在其内部观察到。详细的形态学分析（见方法：形态学处理和层析结果分析4). 令人惊讶的是，断层扫描也显示出一些NP是中空的（图2公里，另请参阅补充影片三)这进一步表明它们不是液滴，因为它们应该具有均匀和连续的结构。

监测矿物相的演变

为了深入了解矿物相的成分演变，使用了不同技术的组合，使用衰减全反射FTIR（ATR-FTIR）光谱、pH和Ca2+浓度测量、DLS/zeta电位测量以及液体和固体核磁共振。为了获得这些测量的均匀溶液条件，缓慢搅拌（100转/分，设置如补充图所示1亿)已应用。CryoTEM显示，在这些条件下，形成了与静态实验中相同的复合NP（图3a年)确认缓慢搅拌并没有显著影响PILP的形成过程，尽管薄膜的形成被阻止，而是形成了沉淀物（图3b–d日).

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2.5 g L矿物相的形态演变−1ds-DNA，10 mM氯化钙2和缓慢搅拌（100转/分）。一NP在反应溶液中2小时的低温TEM图像。b条–d日离心分离2、3和5 h样品的SEM图像。比例尺：一，20纳米，b条–d日500纳米

双标记DNA可以根据碱基序列、电解质组成和浓度、pH值、温度等采用不同的构象42,47.虽然对于较长的核酸片段（>100 bps）31单个残基的P NMR信号无法解析42，光谱仍然可以洞察不同ds-DNA构象的发生。在水溶液中，ds-DNA一般采用B构象，而干燥的ds-DNA通常采用A构象48. The31P液相核磁共振（图4a、b)纯2.5 g L−1ds-DNA溶液确实在δ = −3.87 p.p.m（峰宽0.60 p.p.m），对应于B-DNA42与10mM Ca混合后2+，峰值向高场移动-0.13 p.p.m.，并变宽（至0.88 p.p.m），这归因于钙之间的相互作用2+ds-DNA的磷酸基团。纯2.5 g L的zeta电位−1ds-DNA溶液为~-50.2 mV，而添加Ca2+让该值增加到~−12.6 mV（图4c类，另见补充表5)确认Ca之间的络合作用2+和ds-DNA。混合溶液（10mM Ca2+，2.5克升−1ds-DNA）显示pH值为5.3且游离[Ca2+]7.25 mM（图第4天，另见补充表6)，表示约2.75 mM的Ca2+与ds DNA结合。

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2.5 g L反应溶液的物理化学演变−1ds-DNA，10 mM氯化钙2和缓慢搅拌（100转/分）。一液体状态31纯2.5 g L的P NMR谱−1ds-DNA溶液和不同生长阶段的反应溶液。b条中光谱的化学位移和峰宽一，分别由由线条连接的黑色正方形和橙色圆圈标记。c（c）根据DLS测量得出的不同生长阶段反应溶液的体积平均粒径和计数率，以及相应的zeta电位，这些电位分别由线连接的洋红色圆圈、蓝色三角形和黑色正方形标记。通过平均每个样品的10次测量值获得数据，误差条代表标准偏差。d日pH/[钙2+]反应溶液曲线和相应的d（pH）/dt导数曲线。pH和[Ca斜率的两个变化2+]117分钟和157分钟的曲线分别用橙色灰线突出显示

NH扩散后三/CO公司2蒸汽中，pH值在1小时内增加到~10.0的稳定值（图第4天). 在2小时的反应时间内，游离[Ca2+]持续减少，反映出钙的持续结合2+带CO三2‒同时，液体31P NMR信号略微移回低场（0.03 P.P.m），并锐化至0.72 P.P.m的宽度（图4a、b)，表明Ca2+由于CaCO的形成，与ds-DNA的结合被释放三在这个过程中，由于ds-DNA的部分释放和/或Ca之间的结合，zeta电位降至-24.2 mV2+和CO三2−（图4c类). pH值的增加对游离[Ca没有显著影响2+]和液体31P NMR测量，同时由于脱质子作用检测到zeta电位略有下降（参见补充图15a、15b，补充表5和6). 这表明ds-DNA和Ca之间的相互作用2+相对较强，不受ds-DNA脱质子的影响。

在pH和[Ca中观察到斜率的变化2+]120 min时的曲线，反映了可溶性[Ca的变化2+]从而指示成核事件（图第4天). DLS证实了成核事件的存在，此时显示计数率和平均尺寸都增加了（图4c类)而低温TEM显示出直径约为40nm的不规则形状NP的外观（图3a年). FTIR（图5a级)表明这些NP由ACC和ds-DNA组成。ACC相由不对称CO分裂来识别三 ν三1409和1479厘米波段−1以及缺少对称ν4712厘米处的振动−1 49.对称PO2−ds-DNA主干1083 cm处的拉伸峰−1与ds-DNA粉末相比，在2 h样品中的强度更高，反映了ds-DNA的磷酸基团与ACC之间的相互作用50值得注意的是，SEM显示，这些NP在从溶液中离心分离时并没有像液滴预期的那样聚结（图3亿).

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2.5 g L矿物相的成分演变−1ds-DNA，10 mM氯化钙2缓慢搅拌（100转/分）。一ds-DNA和2、3、5h样品的ATR-FTIR光谱。对应于ds-DNA、ACC或方解石的峰分别用黑色、橙色和蓝色的线条和数字标记。ACC和方解石共有的峰用品红灰线和数字标记。b条 31钙的P CP-MAS SS-NMR谱2+/ds-DNA复合物、2、3、5 h样品和ds-DNA。信号（黑线）在~−2 p.p.m（峰值1）和~−5 p.p.m.（峰值2）被反褶积成两个峰值，分别用蓝色和橙色灰线表示。c（c）中光谱的峰1和2的化学位移以及峰2/峰1的比率b条，分别由由直线连接的黑色正方形、橙色圆圈和蓝色三角形标记

ds-DNA的构象也反映在31固态核磁共振中的P化学位移（SS-NMR，图5b、 c）48,51. The31干纯ds-DNA的P交叉极化魔角自旋（CP-MAS）SS-NMR谱呈不对称线型52在~−2和−5 p.p.m.（峰值1和峰值2）可将其反褶积为两个分量。下午−2点的主要成分（约80%）对应于之前报告的鲑鱼ds-DNA的各向同性化学位移43由于脱水，这条线被分配给A构象的ds-DNA，而下午−5点左右的共振被分配给B-DNA，我们将其归因于Mg的存在2+抑制B-到-A形式转变的离子53.与钙的离子交换2+（参见方法：钙的制备2+/ds-DNA复合物）增加了峰2（−5 p.p.m.）的相对强度，表明钙的相互作用类似2+ds-DNA离子。2小时样品获得了非常相似的光谱，与ds-DNA与Ca的相互作用一致2+在反应的这个阶段，B型DNA随之稳定。

还比较了13ds-DNA和2h样品的C CP-MAS SS-NMR光谱（补充图16)显示了CaCO的密切相互作用三使用ds-DNA。在ds-DNA光谱中，在~166ppm下观察到碱对羰基的共振54而对于2h样品，这种碳酸盐共振在约168p.p.m.时有一个清晰的肩部。55重要的是，通过执行13C CP-MAS在较低温度（−100°C）下，碳酸盐峰的相对强度增加了一倍，表明在室温下，ds-DNA/ACC NP显示（各向异性）动力学，即使在固态中也是如此。

在~150分钟时，pH和[Ca斜率的另一个变化2+]观察到曲线（图第4天)之后溶液变得不透明。此时，DLS显示计数率和平均粒径进一步增加（图4c类)最大值为180 min，共同指向第二次成核事件。事实上，在3小时后，观察到了微米级的颗粒（图3立方厘米)5小时后，显示出菱形晶面（图三维)FTIR鉴定为方解石（图5a级). ICP-OES测量表明，矿物的磷质量分数从18.57 mg g降低−1对于2 h样品，分别为4.52和3.77 mg g−1分别在3 h和5 h样品中（补充表2)，表明ACC中截留的大多数ds-DNA在转变为结晶状态期间释放56剩下的ds-DNA被方解石晶体堵塞。通过能量色散光谱仪（EDS）测量也检测到磷比的类似变化（补充表三).

结晶期间，观察到zeta电位持续下降至-34.3 mV，这与ds-DNA/CaCO形成的释放一致三过程中（图4c类). 液相核磁共振证实了这一点，它显示出进一步向下的场移0.08 p.p.m.，并且在160分钟后从0.70 p.p.m显著锐化到0.60 p.p.m..（图4a、b)这归因于结晶过程中大多数ds-DNA的释放。200分钟后，峰的宽度与纯ds-DNA溶液相似，但由于NH的引入增加了离子强度，因此化学位移较低4+和CO三2−溶液中的离子（补充图15摄氏度，天). 在313小时和5小时样品的P CP-MAS SS-NMR光谱（图5b、c)，ds-DNA与Ca相互作用的分数2+（峰2）显著降低，证实生物聚合物在结晶过程中至少部分释放56值得注意的是，与SS-NMR测量相比，只有一个31在所有的液相核磁共振实验中都鉴定出了P族。显然，在这些条件下，ds-DNA保持在B构象，并且结构随着条件的变化而变化，只有通过共振的移动和变化的线宽才能看到。与之前相比，我们在该系统中没有发现液-液相分离的证据13pAsp/CaCO的C液-NMR研究三系统32.

讨论

我们的实验表明，在含有带电聚合物的溶液中，如pAsp、ds-DNA、pAA或pAH、CaCO三形成纳米颗粒相，具有广泛的PILP的所有凝固和沉积特性。尽管它的名字是“PILP”相，但它并不显示液体的微观特征，例如液滴的聚合或液体中的额外信号31核磁共振波谱。事实上，PILP由具有约2 nm纳米颗粒结构的ACC NP组成，在我们的实验中该相形成之前未检测到其他产品（补充图8,9). 在我们研究的所有四个PILP系统中都发现了相同的~2 nm纳米颗粒结构，这强烈表明PILP是由~2 nm团簇组装而成的。然而，在早期反应溶液中未检测到单个簇，这可能意味着它们在聚合物上组装之前不稳定。我们的研究结果可以更好地解释PILP的几个特征，包括凝胶状弹性，这些特征优于目前基于滴管的模型33以及PILP诱导CaCO的颗粒形态三薄膜（图第1页)27,35此外，由于PILP薄膜是通过NP的附着而非液滴的润湿沉积到生长基板上的，因此在该过程中只观察到极端的“接触角”也就不足为奇了：34当NP能够（或无法）附着到基板上形成薄膜时，它们的行为就像接触角=0°（或>150°）的液体。我们关于PILP由~2 nm大小的ACC团簇组装而成的建议也解释了为什么它们可以通过相对低浓度的聚电解质来稳定，例如25 mg L−1pAsp，其中仅含有约0.22 mM的COO−组。而不是与所有钙结合2+离子，聚电解质只需与表面钙结合2+PILP中约2 nm大小的ACC集群。每个ACC簇由约20 Ca组成2+/CO公司三2−根据最近的一项计算研究得出的离子对57因此，更多的Ca2+可以由一名首席运营官稳定下来−组。事实上，正如Dai等人之前对PILP的成分研究所示。58、加州2+/首席运营官−20 mg L诱导的PILP的比率为~10:1−1pAsp，表明每个ACC集群都与两个COO绑定−pAsp诱导的PILP组。因此，25 mg L−1pAsp可以稳定PILP，代表约2.2 mM的Ca2+允许形成更高浓度的PILP。有趣的是，类似的Ca2+/−采购订单4−通过ICP-OES测量检测到ds-DNA诱导的PILP的比率（10:1）（补充表2)目前尚不清楚为什么ds-DNA（2.5 g L−1)需要诱导PILP过程。

显然，我们的结果与Bewernitz等人的核磁共振工作形成了对比。32谁使用了13高CO富碳滴定系统三2−/HCO公司三−浓度、中等pH值（~8.5）和pAsp的存在（18 mg L−1). 一个额外的13本系统在Ca后检测到C液-NMR信号2+尽管没有显示PILP过程的典型产物（薄膜或纳米棒）可以在这样的系统中形成，但他们将其归因于PILP。信号显示T2（自旋-自旋）弛豫时间略短于溶液，但比固体中的常规弛豫次数高。尽管作者使用这些结果来支持PILP的流动性，但长T2也可以归因于我们实验中观察到的非常小的ACC团簇的快速动力学。事实上，Bewernitz等人的自扩散测量表明，PILP的有效尺寸约为1.6 nm，这与我们观察到的ACC簇的尺寸（约2 nm）非常吻合。因此，尽管实验条件不同，但我们的结果与之前的报告一致，所有数据都可以解释为，PILP是由带电聚合物交联的~2 nm大小的ACC团簇组成的动态组件的分散，而不一定存在液-液相分离。

尽管具有粒状特征，但PILP相在宏观/介观尺度上表现为液体，能够“湿润”许多固体表面并渗透孔隙，这与固体ACC截然不同。固体ACC NP具有连续结构，通常在几分钟内溶解于水溶液中45相反，聚合物-ACC NP具有由~2 nm大小的ACC簇组成的双连续内部结构，可以在溶液中存在长达数小时。观察到的结构表明，聚合物与ACC团簇相互缠绕并结合在一起，使其在NP内稳定，如图所示第6页（第2阶段）。这暂时抑制了ACC-钙矾石相变，而表面结合聚合物胶体稳定了NP，使其宏观上表现为液相。表面活性剂功能化胶体颗粒也有类似的液相行为59,60由于相邻官能团的空间排斥作用，这些胶体颗粒即使在干燥后也可以流动60结晶过程中聚合物被排除在外，以最小化大块晶体的自由能和应力56，以及聚合物-矿物相互作用的动力学，如13C CP-MAS（补充图16)-将在这一过程中发挥至关重要的作用。PILP NP将完全覆盖与其ACC/聚合物表面匹配的表面（或当表面与PILP表面不兼容时根本不覆盖）34这种增强的“润湿”行为有助于纳米孔内或平面衬底上具有非传统形态的形状的形核，而这些形状只有在之后才转变为晶体CaCO三纳米棒或薄膜。纳米孔中生长的纳米棒的凹面尖端（插图1天)也可以用聚合物改性簇合物对孔壁的亲和力来解释（图6b条（含聚合物），作为之前提出的通过类流体PILP相润湿的替代方案21在不存在这种聚合物的情况下（图6b条在这里使用的实验条件下（补充图三)这些晶体很难生长成纳米孔，或“湿润”固体表面，在那里它们必须使其形状适应具有高表面能的非平衡形态（补充图5)这将限制他们的增长。值得注意的是，我们描述的纳米棒与CaCO不同三体溶液中形成的纳米棒，如pAA和pAH诱导的PILP过程中所报告的19,61然而，即使使用pAA或pAH，在我们的实验中也没有观察到这些纳米棒，并且到目前为止，它们的详细形成机制仍未解决。

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CaCO方案三负电荷聚合物引起的薄膜或纳米棒形成过程。一CaCO公司三薄膜形成过程始于钙的形成2+/聚合物复合物（阶段1）。CO绑定后三2−，~2 nm大小的ACC团簇由聚合物结合的Ca形成2+通过聚合物分子进一步交联和稳定，形成30–50 nm大小的聚合物-ACC NP（第2阶段）。NP在本体溶液中聚集成μm大小的结构（阶段3）。在存在平坦基底的情况下，NP沉积形成薄膜（第4阶段）。CaCO的后续成核三晶体（第5阶段）在薄膜内生成血小板。结晶后（第6阶段），大多数聚合物分子被排除在外，而其中一些分子被晶体内部堵塞。b条CaCO公司三当径迹蚀刻膜暴露于反应溶液中时，就会形成纳米棒。短方解石纳米棒的尖端有晶面，在不存在聚合物的情况下形成。在负电荷聚合物存在下，被聚合物覆盖的~2 nm大小的ACC团簇沉积在纳米孔壁上，形成具有凹面尖端的纳米棒

根据我们的结果，聚合物诱导CaCO形成的机理三薄膜和纳米棒如图所示6以带负电荷的聚合物为例（图第6页)，反应开始于钙的形成2+/聚合物复合物（第1阶段，另见补充表5和6). CO反应后三2−聚合物结合钙2+离子，形成约2 nm大小的ACC簇，通过聚合物分子交联和稳定，形成30–50 nm大小的复合聚合物-ACC NP（第2阶段，另请参见图2a个). NP在本体溶液中聚集成微米级结构（第3阶段，另见图第1页). 在存在平坦基底的情况下，NP沉积形成薄膜（第4阶段，另请参见图第1页). 结晶CaCO的成核三随后，在薄膜中产生结晶板（第5阶段，另请参见图第1页). 由于ACC相水合（通常为~1:1 CaCO三：H2O）62，并且PILP中的聚合物在结晶后将被排除，消耗更大体积的PILP以形成相同摩尔量的脱水结晶多晶型物，如方解石或球霰石。然后，这会导致生长的结晶血小板周围的ACC薄膜溶解，这是由于溶液的过饱和度降低而促进的（图第4天)与方解石或球霰石相比，ACC的溶解度相对较高。完全结晶后（第6阶段，另见图1亿)大多数聚合物被从大块晶体中排除到晶体表面或返回到溶液中，而其中一些聚合物被堵塞。当轨道蚀刻膜暴露在反应溶液中时（图6b条)，在没有聚合物的情况下形成尖端有晶面的短方解石纳米棒（另见补充图5). 然而，在存在负电荷聚合物的情况下，会形成由聚合物覆盖的~2 nm大小的ACC簇，这些簇有效地沉积在纳米孔壁上，并形成具有凹面尖端的纳米棒（图1天).

我们的结果为这种广泛结晶策略的机理提供了新的见解，表明从PILP系统观察到的薄膜形成和纳米孔渗透可以通过聚电解质稳定的胶体颗粒附着到表面来解释63在生物系统中，类似的生物聚合物稳定的纳米颗粒组件也可能形成矿物形成的前体36–38事实上，NP相对较高的固体含量（约50体积%）可以形成有效的矿物来源，并可能构成在活性矿化系统中观察到的泡囊的矿物含量38,64这种以生物聚合物-矿物为基础的PILP系统作为生物矿化的前体，可以解释在许多系统中观察到的纳米颗粒结构36–38,64以及骨骼中胶原蛋白和贝壳中珍珠层有机基质等预制大分子模板的渗透。

总之，我们在这里展示了CaCO三PILP由凝胶状NP组成，由聚合物稳定的~2nm ACC团簇组装而成。尽管已经证明CaCO存在瞬态稠密液相三29,57,65,66，我们的结果表明CaCO三PILP不仅仅是这种液相的聚合物稳定版本。更具体地说，~2nm团簇的组装没有纳米级流动性的迹象，并且在溶液中不会聚合成连续结构。因此，我们建议使用缩写PILP来表示聚合物诱导液体-像前体一样，承认这些聚合物定向结晶系统的特殊宏观性质。所提出的PILP模型不仅有助于我们理解如何在具有技术相关性的材料中实现对晶体形态的控制，还可以提供对生物系统中矿物形成过程的机械见解。

方法

CaCO公司三矿化反应

分析级CaCl2，（NH4)2一氧化碳三，聚-（α，β）-DL-天冬氨酸钠盐（pAsp，mw=2000–11000 g mol−1)，聚丙烯酸（pAA，mw=5100 g mol−1)和聚烯丙胺盐酸盐（pAH，mw=15000 g mol−1)从奥尔德里奇购买。三文鱼精子双链DNA（300个基点，mW≈225000 g/mol−1)由日本丸丸日株式会社提供。CaCO矿化三由CO扩散引起2/NH公司三来自（NH）的混合气体4)2一氧化碳三粉末变成CaCl2解决：18,67一个80 mL烧杯，含有25 mL含有10 mM CaCl的溶液2和2.5克升−1抗体23，25毫克升−1p天冬氨酸18，25毫克升−1苯乙酸24、25 mg或1 g L−1pAH公司19放置在干燥器中（补充图第1页). 将亲水性玻片垂直插入溶液中作为CaCO的基质三增长。烧杯被多孔副膜覆盖，以降低扩散速度。一个装有1 g（NH）的小瓶4)2一氧化碳三粉末放在溶液附近。首席执行官2/NH公司三（NH）释放的混合气体4)2一氧化碳三分解缓慢扩散到溶液中以诱导CaCO三形成。允许生长在10分钟到24小时的时间段内进行，无需搅拌或100转/分搅拌。在溶液/空气界面附近收集反应溶液以进行低温TEM可视化。使用乙醇彻底清洗玻璃载玻片上生长的样品，并在室温下干燥24小时，然后进行表征。搅拌实验（补充图1亿)、pH电极和Ca2+-将连接到Metrohm-Tiamo系统的离子选择电极直接插入反应溶液中进行测量。将样品在反应溶液中离心一次，然后在乙醇中再离心两轮，然后在室温下干燥24小时，然后进行表征。平均相对离心场为4715×克对于我们实验中的所有离心操作。

CaCO公司三径迹刻蚀膜中纳米棒的形成

CaCO公司三纳米棒是在径迹蚀刻膜内形成的，具有纳米大小的孔，也使用（NH4)2一氧化碳三扩散法20,21VWR订购了10μm厚的50 nm（项目号515-2026，供应商号110603）或200 nm（项目编号515-2029，供应商号110 609）孔径的聚碳轨道蚀刻膜。在使用之前，对膜进行等离子体清洁1分钟，以提高其亲水性，然后将其浸入10 mM CaCl中22.5 g/L溶液−1ds-DNA或25 mg L−1pAsp或无添加剂。将溶液真空脱气过夜，以清除孔隙内残留的气体。之后，CaCO三由（NH）种植4)2一氧化碳三上述扩散法持续24小时。然后用乙醇彻底清洗膜，并用滤纸擦拭，以去除膜表面形成的晶体。然后，将膜溶解在二氯甲烷（CH）中2氯2)超声处理20分钟以分离CaCO三产品。然后将产品在CH中离心三次2氯2在乙醇中进行两次循环，并在室温下干燥24h，然后进行表征。

钙的制备2+/ds-DNA复合物

钙2+/通过混合60 mL含有10 g L的溶液制备ds-DNA复合物−1ds-DNA和300mM氯化钙2（使用预冷却至4°C的去离子水制备）和140 mL预冷却（−20°C）乙醇。使用预冷却（−20°C）70%乙醇离心清洗沉淀五轮，以去除剩余的CaCl2盐。在表征之前，在室温下干燥所制备的复合物。EDS显示络合物中的Ca:P:Cl比率为~1:2.28:0.14（补充表三)，表示Ca2+与ds-DNA结合，而大部分CaCl2盐被去除了。

SEM/EDS和OM观察

使用配备EDAX EDS检测器的FEI Quanta 3D场发射SEM进行SEM和EDS研究。CaCO的原位光学显微镜观察三薄膜形成过程在专门设计的生长室中进行（补充图6). 在生长室中，0.12 g（NH4)2一氧化碳三装载在较低的电池B中。CO2/NH公司三（NH）释放的混合气体4)2一氧化碳三将分解物缓慢扩散到含有39 mL反应溶液和10 mM CaCl的较高细胞a中2和25毫克升−1pAsp的。产品在盖玻片上形成，并使用蔡司AxionVision2光学显微镜进行观察。采用×32物镜和DIC滤光片，在传输模式下以每3 s 1帧的速率记录原位观察视频。

低温透射电子显微镜

将三微升反应溶液样品涂敷在定量或花边TEM网格上，用自动玻璃化机器人（FEI Vitrobot™Mark III，FEI Company）对其进行5 s的吸液和玻璃化。在层析实验中，液体样品在吸墨剂之前与5 nm大小的金标记混合。为了研究早期样品，将3μL反应溶液样品应用于GOx涂层的TEM格栅上41加湿器中使用超纯水中20%（v/v）IPA。经过60秒的等待，格栅被吸干了3秒并被玻璃化。在配备场发射枪并在300 kV下运行的FEI-Titan TEM上，在约3μm离焦下进行CryoTEM成像。对于GOx涂层网格上的样品，使用照明面积为670 nm的平行光束（纳米探针）进行成像，离焦值为−1.5μm。使用配备柱后Gatan能量过滤器（GIF）的2k×2k Gatan CCD相机记录图像，电子剂量为15.8 e Au−2每个图像。层析倾斜序列从−65°到65°，每步3°，电子剂量为3.0 e Au−2每帧。有关低温透射电镜局限性的讨论，请参阅参考文献。 30,40.

断层图像结果的形态学处理和分析

在IMOD Etomo中对断层倾斜序列进行校准和重建。最终对齐的堆栈被2装箱，并使用SIRT算法进行10次迭代重建。通过将倾斜序列中的金珠强度设置为平均背景强度，从最终重建中筛选出金标记。对于图中所示的层析结果2克–克和补充电影三，重建堆栈经过中值滤波（滤波器尺寸为3×3×3像素），以去除噪声以获得更好的可见性。原始堆栈和过滤堆栈的比较如补充图所示17.

补充电影2由图中所示NP的层析结果生成2克–j，通过进一步的过滤过程：使用内部Matlab脚本对NP和重建的剩余体积应用不同的过滤级别，以分割NP的矿化部分，增强ds-DNA的对比度，然后将两者显示在一起：

1.重建（堆栈0）采用3D中值滤波（滤波器尺寸3×3×3像素）生成堆栈1，以消除噪声以获得更好的可见性。

2.使用Otsu方法（−384）获得的强度阈值分割堆栈1中的所有对象，生成堆栈2。

3.分割的对象被2个像素的直径侵蚀，以消除噪声伪影并拾取a区域，生成堆栈3。

4.堆栈3中的A区域扩大了10个像素的直径，以创建一个连续的遮罩（B区域）。B区域用作堆栈1的掩码。

5.使用Otsu方法推导的强度阈值分割堆栈1中的B区域，以获得NP（C区域）的低像素强度部分，该部分对应于密度较高且像素强度较低的NP矿化部分。

6.对堆栈0进行3D中值滤波（滤波器尺寸为7×7×7像素），以增加ds-DNA的对比度，生成堆栈4。

7.C区域作为遮罩应用于堆栈4并设置为黑色，即将精确分割的ACC粒子显示为黑色，生成最终堆栈（堆栈5），用于生成补充电影2补充图中显示了过滤后的烟囱和原始烟囱之间的比较18个和b，这表明ds-DNA的对比度显著提高，而NP的形态保持不变。

C区（NP矿化部分）用于测量矿化部分的体积比及其连通性。结果发现，NP对象区域的>99%是相互关联的。B区被10个像素的直径侵蚀，形成一个紧密包围NP（B′区）的区域，从B′区减去C区，生成D区，对应于密度较低、像素强度较高的ds-DNA/充水区域。这个D区域也相互连接在一起，表明NP具有双连续结构。矿化部分（C区：B′区）的体积比例为~51%。通过使用不同的像素强度阈值并与未经滤波的叠加结果进行比较，确认了该值的可靠性（补充表4).

核磁共振测量

液体状态31在配备5 mm Bruker PABBI宽带反向探针的Bruker Avance 500 MHz光谱仪上获得了反应不同阶段反应溶液的P NMR谱。将反应溶液与10%D混合2测量前为O，以提供锁定信号。在25°处记录光谱，累积256次扫描，循环延迟5 s，并参考磷酸三甲酯（TMP）。

固态31P和13使用Varian 3.2 mm T3-HXY MAS探针，在9.4 T固态Varian NMR系统（VNMRS）上记录C NMR光谱，该探针配置为双共振模式，用于1H（H）-31P和1H（H）-13C、 分别是。样品（ds-DNA粉末除外，按原样测量）通过离心分离，在室温下干燥，直接装入转子中，无需进一步处理。这个31在16 kHz的旋转速度、100 kHz的光谱宽度和20 ms的采集时间下记录P光谱。1使用SPINAL序列在所有情况下应用H解耦68射频场强度为70 kHz。光谱参考的是85%磷酸。对于直接励磁测量，使用了500 s的循环延迟。使用10 s的循环延迟和0.8 ms的CP接触时间记录交叉极化实验31由于ds-DNA的大量质子化作用，所有样品的P光谱与CP光谱无法区分。13C CP-MAS光谱是在16 kHz的旋转速度、100 kHz的谱宽和40 ms的采集时间下记录的1H去耦采用100 kHz的射频场强度。CP接触时间为4ms，循环延迟为3s。光谱是以金刚烷为二级参考物的TMS参考光谱。

FTIR/Raman和zeta电位/DLS测量

使用带有Golden Gate ATR附件的Varian FT-IR 3100光谱仪直接在样品上获得ds-DNA粉末或离心分离和室温干燥沉淀物的ATR-FTIR光谱，并以4cm的分辨率对50次扫描进行信号平均−1使用Jobin Yvon LABRAM共焦拉曼光谱仪（Horiba）对生长在玻璃基板上的样品进行拉曼测量。使用带有×100物镜的Olymbus BX40光学显微镜来寻找感兴趣的产物，并使用孔径为200μm的D3滤光片将波长为633nm的激光聚焦在样品上。采集时间为一分钟，以获得分辨率为4厘米的光谱−1100–2000 cm范围内−1使用马尔文仪器Zetasizer（Nano-ZS）和633nm激光，在不同实验阶段收集的1mL反应溶液上进行zeta电位/DLS测量。

ICP-OES测量

使用SPECTROBLUE EOP光谱仪（德国阿梅特克）进行端对等离子体（轴向等离子体）的ICP-OES，测量波长范围为165-770nm。光谱仪的发生器以27.12 MHz、1.4 kW的频率运行。根据之前的报告，在测量之前，将样品溶解在5%质量百分比的HCl中，并在120°C的厚壁聚四氟乙烯瓶中加热16小时69，以便充分消化样品中的ds-DNA分子，以便进行更准确的磷测量。在加热前后对瓶子进行称重，以测量蒸发造成的质量损失（<0.2%）。不同的溶解浓度（从4到80 mg L−1)用于样品，以确保不同元素的信号均在检测限内。溶液通过横流雾化器和斯科特喷雾室引入光谱仪，样品摄取率为2 mL min−1和氩气流量。Ca、P、Mg和Na的校准尖峰溶液分别由标准ICP溶液（VWR）制备。测试了不同ds-DNA浓度的溶液中ds-DNA对血浆的可能干扰，在高达1 g L的溶液中未检测到任何影响−1ds-DNA的。

代码可用性

用于形态处理和层析结果分析的所有Matlab脚本可在线获取，网址：Raw Data for“用于碳酸钙的聚合物诱导液体前体的微观结构”，Figshare，10.6084/m9。图6340547。

数据可用性

支持本研究结果的所有数据可在线获取：“碳酸钙聚合物诱导液体前体微观结构的原始数据”，Figshare，10.6084/m9。图6340547。

电子辅助材料

补充信息（440万，pdf）

同行评审文件（794K，pdf）

附加补充文件说明（250K，pdf格式）

补充电影1（27M，移动）

补充电影2（2800万，移动）

补充电影3（2800万，移动）

致谢

Y.X.的工作得到了中国学术委员会（CSC）和荷兰科学研究组织（NWO）的TOPPUNT的资助。N.a.J.M.S.NWO也因其对先进材料研究固态核磁共振设施的支持而受到认可。A.A.是魏茨曼科学研究所国家博士后科学进步奖项目的获奖者。我们感谢Jan F.Schoonbrood和Ruud Aspers（荷兰奈梅亨拉德布大学）对NMR测量的帮助，感谢Adelheid Elemans Mehring和Emiel J.M.Hensen（荷兰埃因霍温理工大学）对ICP-OES测量的帮助，感谢Pauline Schmit（荷兰埃因霍温理工大学）为了获得OM测量方面的帮助，吴汉龙（Hanglong Wu）和Arthur D.A.Keizer（荷兰埃因霍温理工大学）讨论了形态学分析，Jozua Laven（荷兰埃因霍温理工大）、Anna B.Spoelstra（荷兰艾因霍温工大学）和Wouter J.E.M。Habraken（德国马克斯·普朗克胶体与界面研究所）和日本丸丸日株式会社善意提供ds-DNA分子。

作者贡献

Y.X进行了大部分实验，并共同撰写了手稿。K.C.H.T.进行了SS核磁共振实验。P.H.H.B.提供了低温TEM的支持。A.A.为核磁共振结果分析提供了支持。H.F.提供了断层重建和形态学分析的支持。A.P.M.K.监督核磁共振实验和数据分析。N.A.J.M.S.监督了该项目并共同撰写了手稿。所有作者讨论了结果并修改了手稿。

笔记

竞争性利益

作者声明没有相互竞争的利益。

脚注

电子辅助材料

补充信息本文随附于10.1038/s41467-018-05006-w。

出版商备注：施普林格自然公司在公布的地图和机构隶属关系中的管辖权主张保持中立。

参与者信息

阿诺·P·M·肯金斯，ln.ur.rmn@snegtneK.A中.

Nico A.J.M.Sommerdijk，ln.eut@kjidremmos.n.

工具书类

1George A，Veis A.磷酸化蛋白质和对磷灰石成核、晶体生长和抑制的控制。化学。版次。2008;108:4670–4693. doi:10.1021/cr0782729。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
2Falini G，Albeck S，Weiner S，Addadi L.软体动物壳大分子对文石或方解石多态性的控制。科学。1996;271:67–69. doi:10.126/science.271.5245.67。[交叉参考][谷歌学者]
三。Marsh M，Chang D，King G.单细胞球虫藻类矿化鳞片中含有酒石酸和乙醛酸残基的新型酸性多糖的分离和表征颗石藻.生物学杂志。化学。1992;267:20507–20512.[公共医学][谷歌学者]
4Gotliv BA等人。天冬氨酸：来自双壳类棱柱壳基质的一个新的富含天冬氨酸类蛋白质家族刚毛Atrina rigida.化学生物化学。2005;6:304–314. doi:10.1002/cbic.20400221。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
5Lowenstam HA、Weiner S。生物矿化。纽约：牛津大学出版社；1989[谷歌学者]
6龚瑜，等。生物成因无定形碳酸钙的相变。程序。美国国家科学院。科学。美国。2012;109:6088–6093. doi:10.1073/pnas.1118085109。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
7Beniash E、Metzler RA、Lam RSK、Gilbert PUPA。牙釉质形成过程中的瞬间无定形磷酸钙。J.结构。生物。2009;166:133–143. doi:10.1016/j.jsb.2009.02.001。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
8Mahamid J，Sharir A，Addadi L，Weiner S.非晶磷酸钙是斑马鱼鳍骨形成的主要成分：非晶前体相的迹象。程序。美国国家科学院。科学。美国。2008;105:12748–12753. doi:10.1073/pnas.0803354105。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
9.Weiss IM、Tuross N、Addadi L、Weiner S.软体动物幼虫壳形成：无定形碳酸钙是文石的前体相。J.实验动物园。2002;293:478–491. doi:10.1002/jez.90004。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
10Weber E、Verch A、Levy D、Fitch AN、Pokroy B.非晶生物成因草酸钙。化学选择。2016;1:132–135. doi:10.1002/slct.201600039。[交叉参考][谷歌学者]
11Xu Y，Ma G，Wang X，Wang M.解决方案-类牙釉质羟基磷灰石/硫酸软骨素膜的空气界面合成和生长机制。克里斯特。增长设计。2012;12:3362–3368. doi:10.1021/cg3001653。[交叉参考][谷歌学者]
12Nudelman F等。胶原蛋白在羟基磷灰石成核抑制剂存在下骨磷灰石形成中的作用。自然材料。2010;9:1004–1009. doi:10.1038/nmat2875。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
13Øner M，DoÕan Ouml，ࡷner G.聚电解质结构对二水硫酸钙生长迟缓的影响。J.克里斯特。增长。1998;186:427–437. doi:10.1016/S0022-0248（97）00518-6。[交叉参考][谷歌学者]
14Jung T等。用原位原子力显微镜探测一水草酸钙的结晶和大分子添加剂的作用。朗缪尔。2004;20:8587–8596. doi:10.1021/la0488755。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
15Ihli J等，《非晶态草酸钙在水溶液中的沉淀》。化学。马特。2015;27:3999–4007. doi:10.1021/acs.chemmater.5b01642。[交叉参考][谷歌学者]
16Wohlrab S，Cölfen H，Antonietti M.结晶多孔微球，由氨基酸通过使用聚合物诱导的液体前体相制成。安圭。化学。国际教育英语。2005;44:4087–4092. doi:10.1002/anie.200462467。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
17Kato T.聚合物/碳酸钙层状薄膜复合材料。高级主管。2000;12:1543–1546. doi:10.1002/1521-4095（200010）12:20<1543:：AID-ADMA1543>3.0.CO；2页。[交叉参考][谷歌学者]
18Gower LB，Odom DJ。通过聚合物诱导液体前体（PILP）工艺沉积碳酸钙膜。J.克里斯特。增长。2000;210:719–734. doi:10.1016/S0022-0248（99）00749-6。[交叉参考][谷歌学者]
19Cantaert B等人。积极思考：相分离使带正电荷的添加剂能够引起碳酸钙形态的剧烈变化。高级功能。马特。2012;22:907–915. doi:10.1002/adfm.201102385。[交叉参考][谷歌学者]
20Schenk AS等。在合成酸性多肽存在下形成的碳酸钙的聚合物诱导液体前体（PILP）相，与生物矿化有关。法拉第讨论。2012;159:327–344. doi:10.1039/c2fd20063e。[交叉参考][谷歌学者]
21Kim YY等。毛细管从无定形碳酸钙中产生单晶方解石纳米线。安圭。化学。国际教育英语。2011;50:12572–12577. doi:10.1002/anie.201104407。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
22Wolf SE等。卵清蛋白对无定形碳酸钙乳液的强稳定作用：深入了解“聚合物诱导的液体前体”过程的机理。美国化学杂志。Soc公司。2011;133:12642–12649. doi:10.1021/ja202622g。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
23Sommerdijk NA、van Leeuwen EN、Vos MR、Jansen JA。以DNA为结晶抑制剂的碳酸钙薄膜作为生物材料涂层。水晶工程通信。2007;9:1209–1214. doi:10.1039/b710277a。[交叉参考][谷歌学者]
24Hosoda N，Kato T.碳酸钙晶体的薄膜形成：基质聚合物官能团的影响。化学。马特。2001;13:688–693. doi:10.1021/cm000817r。[交叉参考][谷歌学者]
25Sommerdijk NA，de With G.仿生CaCO三使用设计分子和界面进行矿化。化学。版次。2008;108:4499–4550. doi:10.1021/cr078259o。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
26Wolf，S.E.和Gower，L.B.in矿物成核与生长的新观点（eds Driessche，A.E.S.V.，Kellermier，M.，Benning，L.G.&Gebauer，D.）（施普林格国际出版公司，瑞士，2017年）。
27Kim YY，Douglas EP，Gower LB.无机图案（CaCO）三)通过聚合物诱导的液体-传送器工艺制备薄膜。朗缪尔。2007;23:4862–4870. doi:10.1021/la061975l。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
28Olszta MJ、Douglas EP、Gower LB。通过聚合物诱导液相传质（PILP）过程对I型胶原蛋白矿化进行扫描电镜分析。钙化。组织内部。2003;72:583–591. doi:10.1007/s00223-002-1032-7。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
29Smeets PJM等。非经典成核的经典观点。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2017;114：E7882–E7890。doi:10.1073/pnas.1700342114。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
30Dubochet J等人。玻璃化标本的冷冻电子显微镜。Q.生物物理学评论。1988;21:129–228. doi:10.1017/S0033583500004297。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
31曾凤，童姿，冯海宁。N.m.r.聚（N-异丙基丙烯酰胺）/水溶液相分离的研究。聚合物。1997;38:5539–5544. doi:10.1016/S0032-3861（97）00118-3。[交叉参考][谷歌学者]
32Bewernitz MA、Gebauer D、Long J、Cölfen H、Gower LB。碳酸钙的亚稳液体前体相及其与聚天冬氨酸的相互作用。法拉第讨论。2012;159:291–312. doi:10.1039/c2fd20080e。[交叉参考][谷歌学者]
33Wolf SLP、Caballero L、Melo F、Cölfen H。原位AFM观察到的凝胶状碳酸钙前体。朗缪尔。2017;33:158–163. doi:10.1021/acs.langmuir.6b03974。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
34Berg JK、Jordan T、Binder Y、Börner HG、Gebauer D.Mg2+调节CaCO液体前体的润湿性三：控制混合材料中的矿化位置。美国化学杂志。Soc公司。2013;135:12512–12515. doi:10.1021/ja404979z。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
35Zhong C，Chu CC。酸性多糖诱导的无定形碳酸钙（ACC）膜：胶体纳米粒子自组织过程。朗缪尔。2009;25:3045–3049. doi:10.1021/la803541m。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
36Oaki Y，Imai H。珍珠层及其模拟材料的等级结构。安圭。化学。国际教育英语。2005;44:6571–6575. doi:10.1002/anie.200500338。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
37Gal A等。颗粒增生机制是生物晶体从非晶前体相生长的基础。高级功能。马特。2014;24:5420–5426. doi:10.1002/adfm.201400676。[交叉参考][谷歌学者]
38Vidavsky N等人，海胆胚胎钙吸收和矿物质沉积的初始阶段。程序。美国国家科学院。科学。美国。2014;111:39–44. doi:10.1073/pnas.1312833110。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
39Olszta MJ等。骨结构和形成：一个新的视角。马特。科学。工程师代表。2007;58:77–116. doi:10.1016/j.mser.2007.05.001。[交叉参考][谷歌学者]
40Patterson JP、Xu Y、Moradi MA、Sommerdijk NA、Friedrich H.CryoTEM是材料化学家的高级分析工具。Acc.Chem.化学。物件。2017;50:1495–1501. doi:10.1021/acs.accounts.7b00107。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
41van de Put MW等。石墨烯氧化物单片作为高分辨率低温TEM的基底。软物质。2015;11:1265–1270. doi:10.1039/C4SM02587C。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
42Gorenstein总经理。通过P-31 NMR研究DNA和蛋白质-DNA复合物的构象和动力学。化学。版次。1994;94:1315–1338. doi:10.1021/cr00029a007。[交叉参考][谷歌学者]
43Terao T，Matsui S，Akasaka K.P-31固体核酸中的化学位移各向异性。美国化学杂志。Soc公司。1977;99:6136–6138. doi:10.1021/ja00460a067。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
44Sun S，Mao LB，Lei Z，Yu SH，Cölfen H.无定形碳酸钙和聚丙烯酸水凝胶：“矿物塑料”的生物启发材料安圭。化学。国际教育英语。2016;55:11765–11769. doi:10.1002/anie.201602849。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
45Pichon BP，Bomans PHH，Frederik PM，Sommerdijk N.langmuir单层膜下CaCO3成核的准时间重溶冷冻TEM研究。美国化学杂志。Soc公司。2008;130:4034–4040. doi:10.1021/ja710416h。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
46Cheng X，Varona PL，Olszta MJ，Gower LB.通过聚合物诱导液相传质（PILP）工艺仿生合成方解石薄膜：1。镁的影响和掺入。J.克里斯特。增长。2007;307:395–404. doi:10.1016/j.jcrysgro.2007.07.006。[交叉参考][谷歌学者]
47Lee JS，Latimer LJ，Reid RS。锌诱导的双链DNA的协同构象变化2+和其他二价金属离子。生物化学。细胞生物学。1993;71:162–168. doi:10.1139/o93-026。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
48Saenger W、Hunter WN、Kennard O。DNA构象是由磷酸盐水合作用的经济学决定的。自然。1986;324:385–388. doi:10.1038/324385a0。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
49罗德里格斯·布兰科（Rodriguez-Blanco），法学博士，肖·S（Shaw S），本宁·LG（Benning LG）。无定形碳酸钙（ACC）通过球霰石结晶为方解石的动力学和机制。纳米级。2011;三:265–271. doi:10.1039/C0NR00589D。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
50Banyay M，Sarkar M，Gräslund A.溶液中核酸IR带库。生物物理学。化学。2003;104:477–488. doi:10.1016/S0301-4622（03）00035-8。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
51Alam TM，Drobny GP。DNA结构和动力学的固态NMR研究。化学。版次。1991;91:1545–1590. doi:10.1021/cr00007a014。[交叉参考][谷歌学者]
52Wong A，Yan ZM，Huang YN，Wu G.低相对湿度下单价阳离子与双链DNA结合的固态Na-23核磁共振研究。Magn.公司。Reson公司。化学。2008;46:308–315. doi:10.1002/mrc.2136。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
53van Dam L，Levitt MH。天然序列聚合DNA B和C形式中的BII核苷酸：DNA C形式的新模型。分子生物学杂志。2000;304:541–560. doi:10.1006/jmbi.000.4194。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
54LaPlante SR等。三种DNA寡核苷酸双工体碱基的碳-13核磁共振：赋值方法和结构特征。生物化学。1988;27:7902–7909. doi:10.1021/bi00420a048。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
55Nebel H，Neumann M，Mayer C，Epple M。关于无定形碳酸钙的结构：固体核磁共振波谱的详细研究。无机化学2008;47:7874–7879. doi:10.1021/ic8007409。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
56.Aizenberg J，Muller DA，Grazul JL，Hamann D.大型微图案单晶的直接制造。科学。2003;299:1205–1208. doi:10.1126/science.1079204。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
57Wallace AF等人，过饱和CaCO中液-液分离的微观证据三解决。科学。2013;341:885–889. doi:10.1126/science.1230915。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
58Dai L，Douglas EP，Gower LB.聚合物诱导液相前体（PILP）非晶CaCO的成分分析三阶段。J.非晶体。固体。2008;354:1845–1854. doi:10.1016/j.jnoncrysol.2007.10.022。[交叉参考][谷歌学者]
59Altan CL，Gurten B，Sommerdijk NA，Bucak S.水性磁性纳米流体有效导热性的恶化。J.应用。物理学。2014;116：224904.doi:10.1063/1.4902441。[交叉参考][谷歌学者]
60Warren SC等。具有液体行为的金属纳米颗粒的广义路径。美国化学杂志。Soc公司。2006;128:12074–12075. doi:10.1021/ja064469r。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
61Olszta MJ、Gajjeraman S、Kaufman M、Gower LB。通过溶液-前体-固体机制合成的纳米纤维方解石。化学。马特。2004;16:2355–2362. doi:10.1021/cm035161r。[交叉参考][谷歌学者]
62Ihli J等人。无定形碳酸钙在溶液和空气中的脱水和结晶。国家公社。2014;5：3169.doi:10.1038/ncomms4169。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
63Böker A、He J、Emrick T、Russell TP。纳米颗粒在界面上的自组装。软物质。2007;三:1231–1248. doi:10.1039/b706609k。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
64Kerschnitzki M等人。鸡胚骨发育期间血管中膜结合矿物质颗粒的运输。骨头。2016;83:65–72. doi:10.1016/j.bone.2015.10.009。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
65Sebastiani F等人。THz光谱的水动力学揭示了CaCO水溶液中液-液双峰极限的轨迹三解决。安圭。化学。国际教育英语。2017;56:490–495. doi:10.1002/anie.201610554。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
66Gebauer D，Völkel A，Cölfen H.稳定的核前碳酸钙簇合物。科学。2008;322:1819–1822. doi:10.1126/science.1164271。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
67Addadi L，Moradian J，Shay E，Maroudas N，Weiner S.方解石晶体成核中硫酸盐和羧酸盐合作的化学模型：与生物矿化的相关性。程序。国家科学院。科学。美国。1987;84:2732–2736. doi:10.1073/pnas.84.9.2732。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
68.Fung BM，Khitrin AK，Ermolaev K。液晶和固体的改进宽带去耦序列。J.马格纳。Reson公司。2000;142:97–101. doi:10.1006/jmre.1999.1896。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
69Holden MJ、Rabb SA、Tewari YB、Winchester MR。通过ICP-OES和HPLC进行可追踪磷测量，以定量DNA。分析。化学。2007;79:1536–1541. doi:10.1021/ac061463b。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
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