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分子生物学细胞。2001年11月；12(11): 3502–3514.
数字对象标识：10.1091桶/12.11.3502桶
预防性维修识别码：PMC60271型
PMID：11694584

应激诱导的核体是前mRNA加工因子的聚集位点

马可·德内格里,伊利亚·恰迪,玛格丽塔·科里奥尼,法比奥·科比安奇,西尔瓦诺·里瓦、和朱塞佩·比亚蒙蒂*
约瑟夫·加尔，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

异质核核糖核蛋白（hnRNP）HAP（hnRNP A1相互作用蛋白）是一种多功能蛋白，在RNA代谢、转录和核结构中发挥作用。应激处理后，HAP被招募到少数核体中，通常靠近核仁，核仁由成簇的染色质周围颗粒组成，是应激前合成的转录物仓库。在本文中，我们表明HAP小体是RNA加工因子子集的聚集位点，与在非应激细胞中检测到的Sam68核体（SNB）有关。事实上，HAP和Sam68都存在于SNB和HAP体内，因此我们将其命名为“应激诱导SNB”。HAP再分配所需的决定因素位于580和788残基之间。该区域的不同部分将绿色荧光蛋白的补充导向应激诱导的SNB，这表明HAP与机体不同成分的相互作用。利用580-725区域作为双杂交筛选的诱饵，我们选择了SRp30c和9G8，这两个剪接因子SR家族的成员。热冲击对拼接因子有不同的影响：SRp30c和SF2/ASF被有效地招募到应激诱导的SNB中，而SC35的分布没有受到干扰。我们认为剪接因子的差异隔离可能影响特定转录物的处理。因此，应激诱导SNB的形成伴随着腺病毒E1A转录物剪接模式的改变。

引言

在过去几年中，利用与分子生物学方法相关的光学和电子显微镜成像技术，可以识别组成后生动物细胞核的各种亚结构域。染色体占据着占核体积大部分的离散区域，而在染色体间空间可以识别出许多结构，其中包括染色体间颗粒或斑点、Cajal小体、宝石和早幼粒小体。然而，尽管有广泛的特征描述，这些隔间的功能仍有待研究(拉蒙德和恩肖，1998年;马特拉，1999年).

除了这些结构外，还描述了其他几个定义尚不明确的核小体，它们可能与前mRNA成熟、DNA复制（复制工厂）和DNA修复（修复焦点）等不同的重要过程有关(马特拉，1999年). 这些结构的一个子集，即核周隔室（PNC）和Sam68核体（SNB）优先位于靠近核仁的位置，并由特定的RNA结合蛋白标记(黄，2000).

SNB是Sam68（有丝分裂期间激活的Src）、SLM-1和SLM-2的聚集位点，是以GSG（GRP33、Sam68、GLD-1）结构域为特征的RNA结合蛋白家族的三个成员，也称为RNA结构域的信号转导和激活(陈等。, 1997;Vernet和Artzt，1997年;陈等。, 1999;维纳布尔斯等。, 1999). Sam68在细胞周期进展中的作用表明了SNB的重要性(巴拉特等。, 1997)，RNA导出(雷迪等。, 2000)、和拼接(斯托斯等。, 2001). 电子显微镜分析表明，SNBs由富含磷的纤维和颗粒组成，表明存在丰富的核糖核蛋白复合物(陈等。, 1999). 根据这一解释，Sam68与许多RNA结合蛋白相互作用，包括异质核核糖核蛋白（hnRNP）G、hnRNP K(维纳布尔斯等。, 1999)，脚手架附着系数-B（SAF-B）/HAP(斯托斯等。, 2001)，和拼接因子YT521(哈特曼等。, 1999). SNB的形成和维持依赖于正在进行的RNA聚合酶II转录，即使这些核体似乎并不集中新合成的RNA(陈等。, 1999). 尽管对SNB的功能仍知之甚少，但Sam68在RNA转运中的作用(雷迪等。, 2000)表明这些尸体可能与通过细胞核贩运mRNA有关(陈等。, 1999).

除了PNC和SNB外，还描述了其他可被针对特定hnRNP（包括hnRNP L）的抗体识别的核周体(罗马皮诺等。, 1989)，hnRNP多嘧啶通道结合蛋白(贫民窟等。, 1992)，hnRNP M(数据器等。, 1993)和SAF-B/hnRNP A1相互作用蛋白(地磅等。, 1999). 然而，尚未调查这些机构之间的关系。hnRNP A1相互作用蛋白（HAP）是一种含有917个氨基酸的新型hnRNP蛋白(地磅等。, 1999)在转录、RNA成熟和核结构中发挥作用。事实上，HAP最初被描述为SAF-B，核基质的组成部分(Renz和Fackelmayer，1996年). 此外，据报道，该蛋白作为热休克蛋白27基因HET的转录调节器(奥斯特雷奇等。, 1997). 此后，为了简单起见，我们将只使用缩写HAP。一些观察结果支持HAP参与RNA代谢的概念。首先，HAP包含一个典型的RNA结合域，是hnRNP复合物的一部分(地磅等。, 1999). 其次，在双杂交试验中，HAP与hnRNP A1结合(地磅等。, 1999)和RNA聚合酶II的C末端结构域(奈勒等。, 1998). 此外，HAP在体外和体内与许多剪接因子相互作用，其中包括SRp30c、SF2/ASF和htra2-beta(奈勒等。, 1998)，以及Sam68和SLM-2(斯托斯等。, 2001). 最后，通过观察HAP的过度表达影响腺病毒E1A报告基因的剪接，表明HAP直接参与剪接(奈勒等。, 1998).

HAP在整个核质中呈间断分布，不包括核仁。此外，它也存在于少数核体中，其中一些位于核仁附近(地磅等。, 1999). 有趣的是，在压力治疗后，HAP被招募到新的核隔间，称为HAP体(基奥迪等。, 2000)或应力体(乔利等。, 1997)，也是热休克因子1和hnRNP M的积累位点(基奥迪等。, 2000;乔利等。, 1997;地磅等。, 1999). HAP小体是相对较大的结构，直径为1-3μm，由染色质周围颗粒簇组成，代表在应激之前或之后但不是应激期间合成的RNA分子库(基奥迪等。, 2000). 仔细的体内分析表明，这些小体在潜在的核结构上聚集，很可能对应于特定的染色体域。事实上，在有丝分裂的HeLa细胞中，热休克诱导热休克因子1募集到特定的染色体上，尽管尚未确定(乔利等。，1999年a).

在这篇文章中，我们表明HAP小体是RNA加工因子子集的聚集位点，包括Sam68、SRp30c、SF2/ASF，在较小程度上是9G8。有趣的是，调节与某些SR剪接因子相互作用的同一蛋白质区域也需要HAP向应激体募集。我们认为剪接因子向HAP小体的差异招募可能是热休克细胞基因表达转录后调控的一部分。

材料和方法

细胞培养、细胞治疗和转染

HeLa细胞在DMEM（Invitrogen，Carlsbad，CA）、10%胎牛血清（Invit罗gen）、50μg/ml庆大霉素和2 mM我-谷氨酰胺。对于热休克实验，细胞在42°C下在40 mM HEPES pH 7.0的完整培养基中培养1小时，并在分析前在37°C下恢复1小时。

通过磷酸钙沉淀技术将重组质粒转染HeLa细胞格雷厄姆和范德埃布（1973）共10个6细胞直接被镀在盖玻片上。24小时后，添加2μg质粒和2μg高分子量小牛胸腺载体DNA（印第安纳波利斯罗氏分子生物化学公司）。使用QUIGEN Plasmid Midi试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚）制备质粒。

间接免疫荧光

盖玻片上生长的HeLa细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗一次，在4%甲醛中固定7分钟，然后在0.5%Triton X-100中在冰上渗透7分钟。在含有5%脱脂牛奶（密歇根州底特律迪夫科）的PBS中以工作浓度稀释初级抗体，然后添加到盖玻片中。使用的主要抗体是亲和纯化的兔抗HAP多克隆抗体(地磅等。, 1999)、针对Sam68的7-1单克隆抗体（mAb）（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）、针对HA-epitope的12CA5 mAb（罗氏分子生物化学公司）和抗SC35 mAb。在37°C的湿度室中放置1 h后，用PBS清洗盖玻片三次。使用的二级抗体为罗丹明结合山羊抗兔IgG抗体、罗丹明连接山羊抗鼠IgG血清（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson Immunoresearch）和异硫氰酸荧光素（FITC）-偶联的兔抗鼠IgG抗体（DAKO，Carpintia，CA）。二级抗体按供应商建议的最终浓度稀释在PBS制备的5%脱脂牛奶中，并添加到盖玻片中。在37°C的湿度室中放置1小时后，用PBS将盖玻片清洗三次，冲洗并装入PBS中90%的甘油中莱卡牌手表配备63×/数值孔径=1.32油浸物镜的TCS-NT数字扫描共聚焦显微镜。我们使用488-nm激光线激发FITC（在500 nm<λ处检测菲特公司<540 nm）和543 nm激光线用于罗丹明荧光（在>590 nm处检测）。针孔直径保持在1μm。图像已导出到Adobe Photoshop（Adobe Systems，Mountain View，CA）。

质粒

HAP的不同区域在转染HeLa细胞中表达为绿色荧光蛋白（GFP）融合体。HAP开放阅读框的一部分是聚合酶链反应（PCR）-用Pwo聚合酶（Roche Molecular Biochemicals）和HAP cDNA扩增(地磅等。, 1999)作为模板和基于cDNA序列合成的合适引物（登录号NM-002967）。上游和下游引物以生态RI和a萨尔分别用于克隆到pEGFP-C1载体的I位点(克隆技术公司加利福尼亚州帕洛阿尔托）。为了确保不同GFP融合子的核定位，将编码猴病毒40大T抗原（PPKKRKV）核定位信号（NLS）的双链寡核苷酸克隆到萨尔我-巴姆pEGFP-C1的HI位点。使用Seq4X4个人测序系统和“Thermo Sequenase Cy5.5染料终止循环”测序试剂盒（伊利诺伊州阿灵顿高地Amersham Pharmacia Biotech）对每个质粒进行测序。HAP的开放阅读框，无论是野生型还是删除了580-788氨基酸编码区，都被克隆到Pst（磅/平方英尺）我-生态pMT2-HA质粒的RI位点，允许在哺乳动物细胞中表达与血凝素（HA）标记N末端融合的蛋白质。为了删除580–788区域（cDNA序列1846–2735），我们使用了先前描述的基于PCR的方法(蒙特库科等。, 1998)和合适的底漆。本研究中使用的所有引物均来自MWG-Biotech（德国埃伯斯堡）。

在酵母双杂交筛选过程中，选择SRp30c和9G8的全长cDNA，以筛选与胁迫诱导HAP重新分布所需区域相互作用的蛋白质。SF2/ASF cDNA由J.Caceres博士（苏格兰爱丁堡爱丁堡大学）善意提供。用合适的引物对所有cDNA进行PCR扩增，并克隆到pEGFP-C1载体中。通过使用针对不同标记使用的GFP或HA的抗体对总细胞提取物进行Western blot分析，验证转染HeLa细胞中所有融合蛋白的表达。在所有情况下，转染蛋白的大小与基于cDNA序列的预期大小一致。

酵母双杂交筛选

人类HeLa cDNA文库、酵母菌株和克隆载体来自克隆技术公司.所有文库筛选和酵母操作均按照制造商的要求进行。用合适的引物对HAP cDNA编码残基580-725的片段进行PCR扩增，并克隆到生态RI公司-萨尔pAS2.1的I位点，指导融合到GAL4 DNA结合域的蛋白质的表达。这个酿酒酵母Y190菌株用pAS2.1-（580–725）转化，并用作受体筛选HeLa cDNA文库（目录号HL4000AA；克隆技术公司). 总计2×107转化子被镀在15厘米的leu板上负极，他的负极和trp负极含有25 mM 3-氨基-1,2,4-三唑（Sigma）的合成培养基。他31岁+分离菌落，并通过在放置在leu上的过滤器上划出阳性条带进行β-半乳糖苷酶过滤试验负极和trp负极合成中板。从这些菌落中分离出质粒并进行逆转录以确认相互作用。使用“Thermo Sequencease Cy5.5 Dye Terminator Cycle”测序试剂盒（Amersham Pharmacia Biotech）对质粒插入物进行测序。

E1A替代拼接

含有E1A小基因的pCMVE1A质粒由Chabot博士（魁北克谢布鲁克谢布鲁克大学）提供(杨等。, 1994). 使用2微克质粒转染5×105磷酸钙沉淀法培养HeLa细胞(格雷厄姆和范德埃布，1973年). 转染后24小时，从对照转染细胞或应激细胞中提取RNA，无论是在热休克后还是在37°C下延长恢复期后。根据要求，在指定的时间段内，用30μM硫酸镉处理转染细胞。根据供应商推荐的提取方案，使用RNeasy Kit（QUIGEN）提取总RNA。为避免质粒污染，在室温下，在50 U RNasin（PerkinElmer Life Science Products）存在下，用100 U无RNase DNase I（Roche Molecular Biochemicals）消化RNA样品30分钟。如所述进行逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）(吉纳等。, 1998). 按照供应商的建议，用50 U MuLV逆转录酶（PerkinElmer Life Science Products）在20μl反应中逆转录总RNA（1μg），并用H稀释至最终体积100μl2O.扩增反应（50μl）包含5μl逆转录反应、20 pmol引物、2 mM MgCl2，每个dNTP 200μM，2.5 U塔克聚合酶（PerkinElmer Life Science Products，马萨诸塞州波士顿），由供应商提供标准缓冲液。为了量化扩增产物，[α]的1μCi-32P] 向反应中添加dCTP，3000 Ci/mmol（Amersham Pharmacia Biotech）。所用引物为E1A-569（5′-ATTATCTGCCACGAGGT-3′）和E1A-1315（5′-GGATAGCCATTTTA-3′）。底漆从MWG-Biotech购买。扩增进行了30个周期，曲线如下：94°C下1 min，56°C下1min，72°C下1min和30s。如果省略逆转录，则无法检测到扩增。将每种反应的等分（10μl）加载到Tris硼酸盐-EDTA缓冲液中5%的丙烯酰胺凝胶上。使用ImageQuant 1.0版程序（分子动力学），使用PhosphorImager 445 SI仪器（分子动力学，加利福尼亚州森尼维尔）显示和量化条带。

结果

HAP和Sam68在热休克前后核体内的Colocalize

我们之前已经表明，在指数生长的HeLa细胞中，HAP在整个核质中表现出点状分布，排除了核仁(地磅等。, 1999). 此外，在大多数细胞中可以清楚地检测到较亮的点，它们优先位于靠近核仁的位置(基奥迪等。, 2000). 这种模式与Sam68的分布非常相似，Sam68是一种最近被证明与HAP相互作用的蛋白质(斯托斯等。, 2001).

为了研究这两种蛋白（与针对Sam68的7-1单克隆抗体共染的HeLa细胞和抗HAP多克隆抗体）的分布之间的关系(地磅等。, 1999)共聚焦激光显微镜分析。如图所示​图1，1在未经处理的细胞中，这两种蛋白在核质中均呈点状分布，在核周区域有一些优先聚集的位点。合并图像证明HAP在SNB中与Sam68共定位，在其他核区室中重叠较差。

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HAP和Sam68在无应力和热休克细胞的核体中共存。HeLa细胞在42℃下无应力（37℃）或热休克1h，并在37℃（42℃）下恢复1h，与抗HAP多克隆抗体和针对Sam68的7-1 mAb共染色。HAP的分布是用FITC-结合的山羊抗兔抗体显示的，而Sam68是用罗丹明结合的山羊抗体显示的。通过共焦激光扫描显微镜观察抗原-抗体复合物。合并图像中的黄色显示了两种抗原的颜色化。

我们已经描述过，在应激治疗（如热休克）后，HAP被招募到少数大核体中，其中一个子集位于核周区，称为SNB(地磅等。, 1999;基奥迪等。, 2000). 我们询问热休克是否也会导致Sam68的重新分布。因此，HeLa细胞在42°C下热休克1小时，在37°C下恢复1小时后，与抗Sam68和抗HAP抗体共染色。如图所示​图1，1最后，Sam68被大量招募到HAP机构。时间进程实验表明，这两种蛋白质以相同的动力学被招募（Denegri，未发表的结果）。

因此，该分析将Sam68添加到HAP体内的蛋白质列表中，其中已经包括热休克因子1(地磅等。, 1999)和hnRNP M(基奥迪等。, 2000). HAP小体和SNB的类似亚核分布表明这些核隔室之间存在紧密关系。这一可能性也得到了以下事实的支持：两者都对应于在其他核区域合成的RNA分子的聚集位点(陈等。, 1999;基奥迪等。, 2000). 基于这些相似性，我们建议将HAP体重命名为应力诱导SNB。

RE地区管理HAP的亚核分布

作为理解应激诱导SNB形成机制的第一步，我们搜索了指导HAP招募的蛋白质基序。

HAP是一种由917个氨基酸组成的大蛋白，由几个可识别的结构域组成（图​（图2）：2)：1）蛋白质的第一部分（残基1-319）的特征是酸性残基含量高。一个假定的DNA结合基序，称为SAF-A/B Acinus和PIAS域（残基31-65），位于该区域。SAF-A/B Acinus和PIAS结构域与其他核蛋白共享，被认为与染色体组织有关(Aravind和Koonin，2000年). 2） 典型的RNA结合域占据蛋白质的中心部分（残基398–482），其次是富含丝氨酸二肽和亲水残基的延伸区域（残基483–621）。4） 富含精氨酸-谷氨酸（RE）二肽的区域从622位延伸至788位。序列分析表明，该区域的一部分（残基638–699）极有可能（0.96）以卷曲-卷曲构象存在。5） 最后，蛋白质的C末端部分（残基789–917）富含甘氨酸（24%）和精氨酸（16.3%），并且与hnRNP U和A1中描述的RGG基序有一些相似之处(基勒简和德雷福斯，1992年;地磅等。, 1996).

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能够将GFP报告蛋白引导至应激诱导的SNBs的HAP区域的鉴定。如文中所述，HAP结构的示意图如图顶部所示。还显示了转染的HeLa细胞中作为GFP融合物表达的区域。数字是指每个区域的第一个和最后一个残数。根据图中显示的结果，不同GFP融合与应激诱导SNB相关的能力被评分为+（靶向熟练）或-（靶向不足）通过在共焦激光显微镜下观察GFP蛋白的自荧光信号来测定HeLa细胞。还用抗HAP多克隆抗体对受热细胞进行染色，并用罗丹明结合羊抗兔抗体（c）间接免疫荧光法显示抗原-抗体复合物的分布。将相同细胞的图像合并（m），以显示内源性和转染蛋白的共定位，从而产生黄色。GFP报告蛋白融合到猴病毒40大T-Ag的NLS中，在非应激和热休克细胞中的分布也显示出来。（e和f）内源性HAP蛋白在未转染的非应激细胞和热休克细胞中的分布。

我们最初研究了共同覆盖整个HAP蛋白的四个GFP融合体的亚核分布，即GFP-[1–407]、GFP-[306–509]、GFP-[474–788]和GFP-[773–917]。在融合蛋白的C末端克隆了一个核定位信号（NLS），以确保其核聚积。在四次融合中，只有GFP-[474-788]在37°C时在核质中显示出点状分布，核仁除外，类似于内源性蛋白（图​（图2）。2). 相同的融合是唯一一个在热休克后被招募到在大小、数量和分布上与应力诱导的SNB没有区别的核体的融合。用抗HAP抗体对转染细胞进行免疫染色证明GFP-[474-788]确实存在于应激诱导的SNB中（图​（图22).

为了缩小热休克后HAP重新分布的介导区域，我们生成了另外两个结构，GFP-[474-652]和GFP-[580-788]，分别包含SK和RE区域。图中的结果​图22证明只有GFP-[580-788]被招募到应激诱导的SNB中。值得注意的是，GFP-[580-788]在非应激细胞中的分布与内源性蛋白的分布没有区别（图​（图2），2)表明RE区域在确定HAP的亚核定位中起着重要作用。关于GFP-[474–652]，这种融合与GFP-NLS报告蛋白类似，主要局限于非应激细胞的核仁（图​（图2）。2). 热休克后，GFP-[474-652]也出现在少数核部位，与应激诱导的SNB不同（图​（图2）2)并被抗SC35单克隆抗体识别（Denegri，未发表结果）。

为了了解580–788区域对于招募是否不仅足够而且必要，我们研究了热休克HeLa细胞中缺失突变HAP-Δ[580–78 8]的亚核分布。野生型和突变蛋白均以HA表位标记为N末端，与GFP-[580-788]一起在瞬时转染的HeLa细胞中表达，根据图中的分析​图2，2，被选为应激诱导SNB的标记物。免疫荧光分析显示，正如预期的那样，野生型蛋白与GFP-[580-788]在应激诱导的SNB中共定位。相反，HAP-Δ[580-788]在整个核质中保持均匀分布（图​（图3）。三). 总之，这些结果表明，580-788区域对于HAP向应激诱导体的募集是必要的，也是充分的。

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580-788区域对于HAP的应力诱导再分配是必要的。用质粒转染HeLa细胞，该质粒可直接表达野生型HAP或缺失580-788区域的缺失突变体（HAP-Δ[580-788]），两者均与HA表位融合。细胞与指导GFP-[580-788]表达的质粒共转染，GFP-是应激诱导SNB的标记。转染细胞在42°C下热休克1小时，然后在37°C下恢复1小时。然后用甲醛固定细胞，并用抗HA-epitope的12CA5单克隆抗体染色。GFP融合的分布是通过观察GFP的自身荧光信号来确定的，而HA标记的蛋白是通过罗丹明结合的山羊抗鼠IgG抗体来显示的。显示了相同细胞的共焦激光图像。

580-788地区的不同部门能够直接招聘压力诱导的SNB

为了更精确地映射靶向信号，我们生成了580–788区域的N端和C端删除版本，如图所示​图4。4这些蛋白质片段在瞬时转染的HeLa细胞中表达为GFP融合体，并通过共聚焦激光显微镜测定其分布，并与内源性HAP的分布进行比较，用抗HAP多克隆抗体染色。如下文所述，对所有这些突变体的分析揭示了一个复杂的亚核分布模式，这很可能反映了580-788区域与优先位于不同核区（如核仁、斑点和应激诱导SNB）的蛋白质相互作用的能力。

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通过N末端或C末端缺失突变体在580-788区域内映射靶向信号。图的顶部显示了580-788区域的示意图。灰色的椭圆形表示线圈域。转染HeLa细胞中表达GFP融合的区域也显示出来。数字是指每个区域的第一个和最后一个残差。根据图底部所示的结果，不同GFP融合与应激诱导SNB相关的能力被评分为+（靶向熟练）或-（靶向不足）。不同GFP结合在瞬时转染HeLa细胞中的分布，无论是非应激（a）还是热休克（b），通过共焦激光显微镜观察GFP的自荧光信号来确定。还用抗HAP多克隆抗体对热曲棍球细胞进行染色，并用罗丹明结合的山羊抗兔抗体（c）通过间接免疫荧光显示蛋白质定位。将相同细胞的图像合并（m），以显示内源性和转染蛋白的共定位，从而产生黄色。

四个C末端突变体明确指出了卷曲-卷曲结构域（残基638–699）在HAP亚核分布中的作用（图​（图4）。4). 事实上，所有包含整个线圈的结构体都有效地用于应激诱导的SNB。相比之下，GFP-[580-659]仅包含该结构域的前20个残基，在这些小体中无法检测到，并且主要存在于未受应力和热休克细胞的核仁中。值得注意的是，抗SC35单克隆抗体染色的核斑点中也始终存在以应激诱导SNB为靶点的三种融合（Denegri，未发表的结果），这表明与通常存在于这些隔间中的蛋白质（如SR因子）存在相互作用。线圈区在指导HAP亚核分布中的重要性得到了证实，缺乏该结构域的N末端突变体未能产生GFP报告蛋白的招募（图​（图4）。4). 然而，GFP-[688–788]仅含有线圈线圈的最后11个残基，可观察到良好的补充。总之，图中的结果​图44确定两个蛋白质区域，即580-703和688-788，能够将GFP靶向应激诱导的SNB。事实上，卷曲-卷曲结构域的最后11个残基存在于这两个区域，这表明该序列在热休克引发的HAP重分布中起作用。

为了更详细地研究这一方面，我们研究了在580-788区域含有内部缺失的三个额外结构的分布：1）GFP-[580-788Δ638-699]，它缺乏整个线圈；2） GFP-[580–788Δ699–725]，其中删除了线圈下游的短序列；和3）GFP-[580–788Δ638–725]，其中删除了两个序列（图​（图5）。5). 对非应力细胞的共焦激光显微镜分析表明，两个没有卷曲线圈的融合（结构体1和3）主要出现在核仁中。剩余的GFP融合在核质中显示出类似于内源性蛋白的点状分布（图​（图5）。5). 对热休克细胞中相同三种结构的分析出乎意料地证明，无论是线圈还是直接下游序列，单独而言，都不需要与应力诱导SNB关联（图​（图5），5)他反对这一事件可能由单个短基序介导的可能性，例如线圈的最后11个氨基酸。相反，这些结果和图中的结果​图44表明580-788区域的不同部分可以相互合作，指导应激处理后HAP的重新分布。为了支持这一假设，我们发现GFP-[580-788Δ638-725]中整个线圈和紧邻下游序列的同时缺失完全消除了招募（图​（图5）。5). 值得注意的是，GFP-的一部分[580–788Δ638–725]与SC35在斑点中共定位（Denegri，未发表的结果），表明与这些核隔室中通常存在的蛋白质相互作用。GFP-[638-725]结构证明，638-725区域不仅是必要的，而且足以指导GFP报告蛋白与应激诱导SNB的关联（图​（图5）。5). 事实上，如GFP-[638-703]和GFP-[653-725]，两端的短删除完全阻止了招募（图​（图5）5)确定638–725区域为目标信号。

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识别能够指导应激诱导SNB招募的最小序列。580–788区域的示意图如图顶部所示。灰色椭圆形表示线圈域。还指出了在转染的HeLa细胞中作为GFP融合物表达的区域。数字是指每个区域的第一个和最后一个残差。根据图底部所示的结果，不同GFP融合与应激诱导SNB相关的能力被评分为+（靶向熟练）或-（靶向不足）。不同GFP结合在瞬时转染HeLa细胞中的分布，无论是非应激（a）还是热休克（b），通过在共焦激光显微镜中观察GFP的自荧光信号来确定。还用抗HAP多克隆抗体对热曲棍球细胞进行染色，并用罗丹明结合的山羊抗兔抗体（c）通过间接免疫荧光显示蛋白质定位。将相同细胞的图像合并（m），以显示内源性和转染蛋白的共定位，从而产生黄色。

与HAP相互作用的剪接因子被引入应力诱导SNB

我们使用580-725的区域作为诱饵，通过酵母中的“双杂交”方法筛选人类cDNA文库（参见材料和方法）。来自2×10的筛选7转化子，我们获得了31个克隆，其中24个克隆与剪接因子SRp30c的完整开放阅读框（ORF）相对应。此外，我们选择了两个克隆，其中包含9G8的整个ORF，SR剪接因子家族的另一个成员，以及一些尚未表征的蛋白质的克隆。HAP和SR剪接因子，特别是SRp30c之间在体外和体内的相互作用并不新鲜(奈勒等。, 1998). 然而，有趣的是，这些剪接因子可以结合到HAP向应激诱导的SNB募集所需的区域，就好像与SRp30c的相互作用以及热休克后HAP与机体的关联是内在联系的一样。为了验证这个假设，我们研究了SRp30c和9G8是否被招募到应激诱导的SNB中以应对热休克。这两种剪接因子在瞬时转染的HeLa细胞中均以GFP融合表达，并通过共焦激光显微镜在用抗HAP抗体染色的细胞上验证了它们与应激诱导的SNB的关联。如图所示​图6，6，SRp30c和HAP一样有效地被招募到体内，这表明这两个因素不仅在物理上相互作用(奈勒等。, 1998)但也参与了一个共同的代谢途径，导致应激治疗后它们的重新分布。关于9G8，应激诱导的SNB的募集，尽管可以清楚地检测到，但仅在一小部分（～30%）转染细胞中发生。此外，即使在应激诱导的SNB中显示GFP-9G8的细胞中，与小体的联系也不完全，并且有相当一部分蛋白质以典型的斑点模式存在（图​（图6）。6). 我们询问SF2/ASF，另一种SR蛋白是否与HAP相互作用(Nayler公司等。, 1998)与SRp30c高度相似，也直接作用于应激诱导的SNB，以应对热休克。因此，SF2/ASF在HeLa细胞中表达为GFP融合，并通过激光共聚焦显微镜测定其在热休克细胞中的分布。如图所示​图6，6与SRp30c类似，SF2/ASF从斑点转移到应力体。然而，应激诱导SNB的招募似乎不是SR家族剪接因子的一般特征。事实上，与抗SC35和抗HAP抗体结合显示，在热休克细胞中，与先前的数据一致(乔利等。，1999年b;基奥迪等。, 2000)，SC35未与HAP共定位（图​（图6）6)以及SF2/ASF和SRp30c。总之，这些结果表明SR蛋白的一个子集被招募到应激诱导的SNB中，并表明这些核隔室可能在热休克细胞中转录物的命运中发挥作用。

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剪接因子SRp30c、9G8和SF2/ASF被纳入应激诱导SNB。转染HeLa细胞时，GFP与SRp30c、9G8或SF2/ASF的整个ORF融合。通过共焦激光显微镜观察GFP的自荧光信号，确定不同GFP融合体在热休克HeLa细胞中的分布。用抗HAP多克隆抗体对相同的细胞进行染色，用罗丹明结合的山羊抗兔抗体显示蛋白质分布。作为对照，对未转染细胞进行热休克，并与抗SC35单克隆抗体和抗HAP多克隆抗体共染色。用FITC-偶联山羊抗兔抗体和罗丹明偶联山羊抗鼠抗体揭示了蛋白质分布。彩色化导致合并图像中出现黄色。

应激处理对E1A转录本选择性剪接程序的影响

上一节的结果表明，热冲击对SR因子的亚核分布有不同的影响。事实上，尽管SF2/ASF和SRp30c被大量招募用于应激诱导的SNB，但这些结构中只存在9G8的一小部分，没有SC35。因此，仅仅通过改变SR因子的亚核分布，热休克似乎就彻底扰乱了核质中SR因子相对丰度。我们预计特定基因的选择性剪接程序可能是这种再分配的目标。我们选择腺病毒E1A基因作为模型来验证这个假设。E1A前体mRNA的选择性剪接产生三种主要亚型（13S、12S和9S）和两种次要亚型（11S和10S）（图​（图7A）7A）(卡萨雷斯等。, 1994). 一些蛋白质，其中包括hnRNP A1、SF2/ASF、9G8和SC35，已被证明通过改变5′剪接位点选择来调节这些亚型的产生(加托尼等。, 1991;卡萨雷斯等。, 1994). 我们已经证明，HAP和其他RNA加工因子在应激诱导的SNB中的补充在热休克恢复后3小时达到峰值，并且需要额外3小时才能使蛋白质的分布再次与在未应激细胞中观察到的分布相比较(地磅等。, 1999). 我们测试了主要E1A转录物亚型水平的改变是否伴随着应激诱导的SNB的形成和扩散。转染E1A小基因后，HeLa细胞在42°C下热休克1小时，然后在37°C下恢复更长的时间间隔（0-6小时）。从未处理和应激细胞中提取总RNA，并通过RT-PCR分析以检测不同的E1A转录亚型（图​（图7B）。7B） ●●●●。扩增带的定量（参见材料和方法；图​图7C）7C） 结果表明，热休克导致13S分子相对丰度增加，12S和9S转录物随之减少。在37°C下恢复1和2小时后，这种效果更加明显（图​（图7，7、B和C）。在较长时间（恢复6小时），E1A转录物的剪接模式与在非应激细胞中观察到的剪接相似。因此，这些结果与应激诱导的SNBs的形成伴随着E1A报告基因剪接程序的短暂改变的假设一致。为了证实这一结论，我们研究了用另一种应激体诱导剂硫酸镉处理的细胞中E1A转录物的选择性剪接。我们之前展示过(基奥迪等。, 2000)在存在30μM硫酸镉的情况下生长3小时的HeLa细胞中，约30%可检测到应激诱导的SNB，2小时后几乎所有细胞中均可检测到SNB。因此，我们测定了在硫酸镉存在下生长3和5小时的细胞中13S、12S和9S亚型的相对水平。如图所示​图7，7镉引起E1a转录本剪接模式的变化，与热休克引起的变化相当。

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热休克和硫酸镉改变了腺病毒E1A小基因的选择性剪接模式。（A） E1A前体mRNA选择性剪接亚型的示意图。主要亚型9S、12S和13S是通过选择性选择5′剪接位点生成的。次要亚型10S和11S涉及额外的内部3′剪接位点的使用。显示了使用E1A-569和E1A-1315引物获得的相应RT-PCR产物的碱基对大小。（B） E1A前体mRNA的体内选择性剪接受热休克和硫酸镉的影响。将含有E1A小基因的pCMVE1A质粒转染HeLa细胞。转染后24小时，从非应激细胞（37°C）或42°C下热休克1小时的细胞中提取总RNA。还从热休克后37°C下恢复1、2、4或6小时的细胞中制备RNA。还从用30μM硫酸镉处理3或5小时的细胞中提取RNA，硫酸镉是另一种由HAP小体诱导的细胞。RNA用E1A-569和E1A-1315引物进行RT-PCR分析。RT-PCR产物在5%聚丙烯酰胺凝胶上溶解并通过放射自显影术检测。（C） ImageQuant PhosphorImager对主要E1A亚型的量化：白色条、浅灰色条和深灰色条，分别代表13S、12S和9S分子。这三种亚型的百分比是至少三个独立实验的平均值。显示错误栏。

事实上，触发应激体形成的两种不同处理对E1A基因的选择性剪接具有相似的影响，这强烈表明RNA加工因子的招募与剪接程序的改变之间存在联系。

讨论

在这篇文章中，我们进一步详细研究了HAP作为应激治疗反应而被招募的核体的性质。我们已经报道了应激诱导的HAP小体与在转化细胞系子集中检测到的SNB之间存在密切关系(陈等。, 1999). 此外，我们已经证明，与之前的想法相反(乔利等。，1999年b;基奥迪等。, 2000)，HAP小体也是剪接因子子集的聚集位点，表明这些结构在RNA代谢中起作用。

SNB与HAP体的关系

在无应力细胞中，HAP和Sam68在整个细胞核内呈点状分布，不包括核仁。然而，尽管核分布广泛，这两个因素的共定位主要发生在少数相对较大的天体上（图​（图1），1)通常与核仁相关，核仁被称为SNB。有趣的是，在热休克后，Sam68和HAP都被大量招募到我们之前称为HAP体的应力诱导核结构中。我们发现，这两个因素与应力体的关联在时间上是一致的，表明存在共同的潜在机制。一些观察结果支持SNB和HAP身体之间存在密切关系的观点。首先，这些结构在细胞核中占据相似的位置，经常与核仁有关。第二，SNB和HAP体都含有RNA分子。我们已经报道了在热休克之前或之后但在热休克期间合成的转录物(基奥迪等。, 2000)存在于HAP体中，因此，HAP体很可能是RNA分子的仓库，RNA分子的合成不受应激处理的触发。与仓库性质一致，HAP体不包含RNA聚合酶II，也不代表转录位点(乔利等。, 1997,1999年b;基奥迪等。, 2000). 事实上，它们来源于高密度形式的核糖核蛋白复合物的持续补充，即染色质周围颗粒(基奥迪等。, 2000)来自周围的核质。类似地，SNB不是转录位点，并且含有最有可能在其他核区合成的RNA分子(陈等。, 1999). 根据RNA是SNB和HAP小体的重要组成部分的观点，这两种结构的形成和稳定性都需要RNA合成，并且受到放线菌素D和5,6-二氯苯并咪唑核苷（DRB）等抑制剂的强烈影响(陈等。, 1999;地磅等。, 1999). 基于这些考虑，我们建议HAP体起源于先前存在的SNB，因此，我们暂时将其重命名为应激诱导的SNB。

有人建议(陈等。, 1999)受Sam68约束的转录本将沿着SNB的路径到达核膜。这种可能性与Sam68的核质池与SNB中的蛋白质处于动态平衡的事实相一致(陈等。, 1999). 我们推测热休克可能会改变这种平衡，并且通过减缓甚至阻止核糖核蛋白复合物从SNB中退出，它会诱导应激诱导的SNB的出现。因此，这些大体的形成是由于细胞核中核糖核蛋白复合物运动中的一个对压力敏感的步骤造成的。

应力诱导SNB中累积的特定拼接因子：功能含义

作为研究应激诱导SNB组成的第一步，我们试图确定调节HAP向这些核结构募集的蛋白质区域。我们发现，从580残基到788残基的HAP部分既足以将GFP报告蛋白导向机体，又对蛋白质在应激时的正确再分配是必要的。该区域的特征是存在富含精氨酸-谷氨酸（RE）二肽的扩展序列（残基638–699），该二肽几乎定期与疏水性氨基酸（通常为亮氨酸或蛋氨酸）点缀，其具有较高的p（平均0.96），以线圈状构象存在。我们的分析表明，580-788区域的不同部分有助于应激诱导SNB的招募。事实上，两个部分重叠的序列，分别从残基638到725和从残基688到788，同样能够将GFP报告蛋白靶向机体（图​（图4）。4). 可以想象，这些区域通过调节HAP与组装在高阶多蛋白复合物中的应激诱导SNB的其他组分的相互作用发挥作用。与这种可能性相一致，我们先前通过详细的电子显微镜分析表明，热休克后，HAP与组成机体的高度堆积的核糖核蛋白复合物，即染色质周围颗粒相结合(基奥迪等。, 2000). 众所周知，许多蛋白质在体外和体内都与HAP相互作用。其中RNA聚合酶II的C末端结构域、CLK2、hnRNP A1、YT521蛋白、Sam68以及剪接因子SRp30c、htra2-beta1和SF2/ASF(奈勒等。, 1998;基奥迪等。, 2000). U2AF35和SRp55也检测到较弱的结合，而未观察到与SR蛋白家族其他成员的相互作用，包括SRp40和SRp75(奈勒等。, 1998). 我们发现，580-725序列（包含本文中确定的一个靶向信号）在双杂交分析中与SR蛋白家族的两个成员SRp30c和9G8介导相互作用。与SRp30c的互动似乎与HAP的招募密切相关。事实上，在热休克细胞中，SRp30c被隔离在应激诱导的SNBs中，这表明该因子可能充当将HAP引导到身体的募集因子。HAP与应激诱导的SNBs中存在的核糖核蛋白复合物的结合可能不是由RNA介导的，而是由与一些蛋白质因子的相互作用介导的，其中SRp30c就是其中之一。观察到HAP-Δ[580-788]突变体含有一个完整的RNA结合域，但未能被招募到应激诱导的SNB中，这一假设得到了支持。

我们分析的一个主要结果是证明了应力诱导体是SR剪接因子积累的场所，这一结论被以前的研究遗漏了(乔利等。，1999年b;基奥迪等。, 2000). 有趣的是，热休克对不同SR剪接因子的分布有不同程度的影响：虽然SRp30c和SF2/ASF在应激诱导体中有效积累，但9G8在应激诱导SNB和斑点中都可检测到，最后，SC35的分布不受热休克的影响。这一发现使得SR因子不仅可以根据其剪接活性进行分类，还可以根据其亚核分布以及参与不同生长条件下发生的高阶蛋白质–RNA组合进行分类。在这方面值得注意的是，最近有报道称SC35与应激条件下转录的基因相关，而不管内含子的存在与否(乔利等。，1999年b)增加了该剪接因子除内含子切除外在转录位点具有其他功能的可能性。

最后，本文报告的结果支持这样的观点，即应激处理可以通过控制特定RNA加工因子的亚细胞分布来影响基因表达的转录后控制。另一种应激处理，即渗透性休克，最近被证明通过激活p38有丝分裂原激活的蛋白激酶途径，触发hnRNP A1的细胞质积累，而对SF2/ASF的分布没有任何影响(范德胡文·范奥尔德等。, 2000). 以这种方式，渗透胁迫干扰了腺病毒E1A基因的选择性剪接。我们的结果确定了一种新的机制，通过这种机制，应力处理可以影响剪接。与渗透胁迫相反，事实上，热休克不会改变hnRNP A1的分布(地磅等。, 1999)但诱导SF2/ASF和其他剪接因子向应激诱导的SNB募集。虽然所涉及的信号转导途径尚不清楚，但事实上，应激诱导的SNB形成对p38 MAP激酶抑制剂SB203580的治疗不敏感，这表明该激酶并不参与其中（我们未发表的结果）。有趣的是，与在受到渗透胁迫的细胞中观察到的情况类似，E1A报告基因小基因的选择性剪接模式在热休克细胞中受到显著影响。

鸣谢

我们感谢帕维亚大学的Centro Grandi Strumenti共焦显微镜设备。这项工作得到了Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro（AIRC）（给G.B.）、MURTS-CNR Biomolecole per la smission umana L.95/95和Progetto Strategico Tecnologie di base della postgenomica（给F.C.）的资助。M.D.和M.C.得到了Consiglio Nazionale delle Richerche的奖学金支持。I.C.得到了意大利博士项目奖学金的支持。

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会