INAUGURAL ARTICLE by a Recently Elected Academy Member:Oxygen radicals, nitric oxide, and peroxynitrite: Redox pathways in molecular medicine

Rafael Radi

doi:10.1073/pnas.1804932115

美国国家科学院院刊。2018年6月5日；115(23): 5839–5848.

2018年5月25日在线发布。数字对象标识：10.1073/pnas.1804932115

PMCID公司：PMC6003358型

PMID：29802228

就职文章

氧自由基、一氧化氮和过氧亚硝酸盐：分子医学中的氧化还原途径

拉斐尔·拉迪^a、，^b、，¹

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重要性

人类的有氧生活会对细胞和组织成分造成过度氧化的危险，这可能会损害细胞功能和生存能力。在各种病理学和正常老化过程中，可以观察到蛋白质和脂质等生物分子中氧化产物的形成和积累。这篇综述文章旨在整合该领域的一些早期和显著发现，以及有助于确定氧自由基、一氧化氮和过氧亚硝酸盐在人体生理和病理中的致病作用的最新进展。人类氧化还原生物化学的这些方面有助于理解疾病和衰老的分子基础，并为发展分子医学的预防和治疗策略开辟了道路。

关键词：自由基、一氧化氮、过氧亚硝酸盐、氧化、蛋白质酪氨酸硝化

摘要

氧衍生自由基和相关氧化剂是有氧生物体一生中普遍存在的短寿命中间产物。这些活性物种参与氧化还原反应，导致生物分子发生氧化修饰，其中蛋白质和脂质是优先靶点。尽管哺乳动物细胞和微生物中存在大量酶和非酶抗氧化系统，但过量氧化剂的形成会导致新产品的积累，从而可能损害细胞功能和结构，导致细胞退化和死亡。氧化事件与病理状况和正常衰老过程有关。值得注意的是，生理水平的氧化剂也通过稳态氧化还原敏感细胞信号级联调节细胞功能。另一方面，一氧化氮(^•NO）是一种自由基和弱氧化剂，通过与血红素蛋白的可逆相互作用而成为主要的生理调节因子。生物利用度和作用^•NO受其与超氧自由基的快速反应调节( ${O（运行）}_{2}^{• -}$ )产生一种不寻常的活性过氧化物，过氧亚硝酸盐，代表氧自由基和^•无路径。在这篇创刊文章中，我总结了自由基生物化学的早期和显著发展以及该领域后来向分子医学的演变；这一转变包括我们的贡献，揭示了^•NO与氧化还原中间体和代谢。过氧亚硝酸盐的生化特性、鉴定和定量及其在疾病过程中的作用已引起我们的广泛关注。过氧亚硝酸盐是蛋白质氧化和硝化、脂质过氧化、线粒体功能障碍和细胞死亡的介体，它既是一种病理生理相关的内源性细胞毒素，又是一种对抗入侵病原体的细胞毒效应剂。

生物系统中内源性氧自由基的毒性最初在“氧中毒”研究中得到证实，与辐射损伤机制的发现平行(1). （自由基是指在其外部分子轨道上含有不成对电子的分子；通常，自由基是反应性和短命的中间体。）事实上，由水的辐解产生的氧自由基，如羟基自由基(^•OH）和超氧自由基( ${O（运行）}_{2}^{• -}$ )以及后来的过氧自由基（ROO^•)被确定为电离辐射作用的关键介质(2). 20世纪50年代，越来越多的证据表明，与细胞氧化还原代谢相关的氧自由基的生物形成始于电子转移蛋白或内源性还原剂对分子氧的单价还原，从而产生 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ :

{O（运行）}_{2} + {e（电子）}^{-} \to {O（运行）}_{2}^{• -} .

[1]

氧自由基：从辐射化学到代谢

参考文献等精髓著作。1和2打开了假设 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 组织中的形成会随着氧浓度的增加而增加，如下所示：

d日 [{O（运行）}_{2}^{• -}] / d日 t吨 = k个 [{R（右）}^{•}] [{O（运行）}_{2}],

[2]

其中R^•表示存在于不同细胞和细胞外隔室中的电子供体。

尽管这些早期的建议似乎是合理的，但氧自由基生物形成的实际证明，尤其是 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 正如Irwin Fridovich所指出的那样，“是逐渐到达的，是曲折道路的结果”(三). 事实上，最初很难接受由氧化代谢产生的不稳定和潜在有毒中间产物的持续内源性形成的想法。许多早期的生物化学机制研究 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 黄嘌呤氧化酶（XO）是一种酶，参与哺乳动物嘌呤分解代谢的最后一步；XO利用分子氧作为共底物催化次黄嘌呤和黄嘌呤氧化为尿酸(图1,上部部分）。

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图1。

黄嘌呤氧化酶催化嘌呤氧化、氧自由基形成和鲁米诺化学发光。

事实上 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ XO好氧氧化黄嘌呤期间的生成是在添加亚硫酸盐的实验中获得的( ${所以}_{三}^{2 -}$ )被氧化了(4). 亚硫酸盐氧化通过XO-衍生物引发的自由基过程进行 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 生成硫三氧自由基，然后与分子氧反应生成过氧单硫酸根阴离子(5,6):

{所以}_{三}^{2 -} + {O（运行）}_{2}^{• -} + 2 {H（H）}^{+} \to {所以}_{三}^{• -} + {H（H）}_{2} {O（运行）}_{2},

[3]

{所以}_{三}^{• -} + {O（运行）}_{2} \to {所以}_{5}^{• -} .

[4]

${所以}_{5}^{• -}$ 是一种强单电子氧化剂，用于传播自由基链式反应(5). 利用XO催化反应中亚硫酸盐氧化产生的额外氧气消耗，开发了一种超灵敏的酶分析方法(4)并揭示其他酶反应中自由基的形成(7).

几年后，还证明XO能够还原铁细胞色素c（c）（cyt公司）c（c）³⁺)由 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ -依赖过程（参考文献。三):

细胞周期 {c（c）}^{三 +} + {O（运行）}_{2}^{• -} \to 细胞周期 {c（c）}^{2 +} + {O（运行）}_{2} .

[5]

（从中扣除等式。三和5, ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 可以同时作为单电子氧化剂和还原剂。）细胞色素XO依赖性还原的生化特性c（c）构成了发现 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 分解代谢酶，含铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD），与细胞色素竞争c（c）还原过程(8)通过以下反应：

{O（运行）}_{2}^{• -} + {O（运行）}_{2}^{• -} + 2 {H（H）}^{+} \overset{草地}{\to} {H（H）}_{2} {O（运行）}_{2} + {O（运行）}_{2} .

[6]

发现了一种能够通过酶消除 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 以接近扩散控制极限的速率(k个= 2 × 10⁹米⁻¹●秒⁻¹)代表了进一步确立内生形成观念的根本步骤 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 并需要保持其稳定水平较低，以最大限度地减少由于生物目标上的不受控制的氧化反应而产生的毒性。【SOD的作用必须辅以一系列酶H₂O（运行）₂-解毒系统（过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物、过氧化氢酶）；否则，H₂O（运行）₂也可以促进氧化，特别是在过渡金属中心的存在下^•OH通过芬顿反应。]

通过对XO酶学的广泛分析，确定了分子氧可以单价或二价还原，同时生成 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 和H₂O（运行）₂(图1). 反应性物种的XO依赖性形成多年后与缺血再灌注综合征和其他疾病有关（参考文献。9). 值得注意的是 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 既不是强氧化剂也不是强还原剂，因此与其他生物相关的氧化剂和自由基相比，它与生物分子具有中等的选择性反应(10). 总的来说，其毒性主要取决于直接反应与少量关键生物靶点的结合(11)二级反应物种的形成，如过氧亚硝酸盐（见下文；参考文献。12 –14).

黄嘌呤氧化酶与化学发光：自由基的早期研究

大约在同一时期，杜克大学的Fridovich和Handler研究了XO有氧氧化黄嘌呤过程中产生的自由基的形成(4,15)，在美国生物化学家约翰·托特（1914-2001）的领导下，在乌拉圭蒙得维的亚共和国大学医学院进行了相关实验，1958年至1960年间，在洛克菲勒基金会的赞助下，以访问教授的身份来到生物化学系；托特教授是一位经验丰富的化学发光和XO酶学研究人员，此前曾是田纳西州橡树岭国家实验室（Oak Ridge National Laboratory）和华盛顿特区原子能委员会（Atomic Energy Commission）的科学家。（有关John R.Totter的历史信息，请访问ethw.org/John_Totter公司和https://ehss.energy.gov/ohre/loadm/historys/0481/0481toc.html#0481_part托特博士来到蒙得维的亚后，我们的部门大力整合了仪器和现代生物化学研究，并开始了自由基和氧化还原生物化学领域的研究。事实上，托特和一组年轻的合作者专注于生化研究，以通过使用化学发光探针，即鲁米诺（5-氨基-2,3-二氢酞菁-1,4-二酮）和荧光素[10-甲基-9-（10-甲基吖啶-10-碘-9-基），表征XO催化作用期间生成的活性氧物种的形成吖啶-10-硝酸铵]。在里程碑式的论文中(16,17)结果表明，鲁米诺和荧光素化学激发与XO衍生物种的形成有关(图1); 虽然反应物种的确切化学性质尚未被精确揭示，但研究表明氧衍生自由基参与其中，包括^•OH和 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 随着时间的推移，化学发光探针已被广泛用于体外和体内，以揭示生物系统中氧化剂的形成，尽管必须密切考虑其特异性和选择性。氧自由基对鲁米诺的化学激发涉及到瞬态电子激发物种（即激发的氨基甲酸盐）的形成，该物种随着光的发射衰减到基态(图1,下部部分）(18).

重要的是，生物系统中的自由基过程也会产生部分电子激发态，如单线态分子氧和三线态羰基(19); 激发态促进目标分子的化学修饰，也产生低水平化学发光(20,21); 这最后一个现象被用来揭示体内自由基的活性。

托特教授返回美国后，他的一位前同事尤金尼奥·普罗达诺夫（Eugenio Prodanov）继续对XO酶学和化学激发过程进行表征，这些研究最初发表于医学院分析(22,23); 这一繁荣的研究时期大约在新出版的时候结束(24)由于该国的社会和政治不稳定，也导致普罗达诺夫教授流亡到法国，流亡一直持续到20世纪80年代中期。1985年末，最近回到大学的普罗达诺夫邀请我（当时是生物化学系的讲师，也是一名医学博士和未来的博士生）加入他，重新启动“蒙得维的亚自由基集团”，我做到了；经过几年的实验室重建和实验设置，我们完成了“新时期”的第一份国际出版物(25)具有SOD和细胞色素调节作用的特征c（c）XO诱导化学发光，这对我们来说是一个非常重要的里程碑(25)是最早发现细胞色素c（c）在H的存在下可能引发过氧化物酶样活性₂O（运行）₂这一过程后来被揭示对线粒体和细胞氧化还原生物学有深远影响(26). 发光探针的化学激发机制一直是该小组多年来关注的焦点，后来被整合到过氧亚硝酸盐诱导化学发光的研究中(27).

超氧化物和氧化应激的细胞内来源

20世纪70年代的研讨会工作导致了对 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 即线粒体电子传递链(28,29)和膜结合NADPH氧化酶（参考文献。30)分别是。线粒体形成 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ [因此H₂O（运行）₂由于线粒体含锰SOD的酶解作用(11)]是一个连续的过程，由于电子传递链复合物I和III以及一系列脱氢酶对分子氧的“电子泄漏”（在参考文献中综述）。31和32). 事实上，线粒体中的大多数分子氧（在我看来，>99.5%）在呼吸链末端氧化酶细胞色素aa处被四个电子还原为水_三保守估计是，在生理条件下，线粒体消耗的总氧的0.2%以下单价减少到 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 然而，由于线粒体耗氧量很大， ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 流量可能很大[例如，血管内皮细胞中的流量约为0.5μM/s(33)]. 此外 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 在病理相关条件下、高氧和衰老过程中增强几次褶皱(33 –35). 线粒体水平适度增加 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 由于H的线粒体排放，可能有一些信号作用₂O（运行）₂(36); 然而，大流量 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 和H₂O（运行）₂导致线粒体成分氧化，导致线粒体功能障碍，甚至发出凋亡细胞死亡信号(37). 线粒体增加引发的两个重要氧化事件 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 是(我)线粒体顺乌头酸酶是克雷布斯循环中的氧化敏感性酶，通过破坏其铁硫簇使其失活(15,38); 以及(ii（ii）)H反应诱导线粒体脂质过氧化₂O（运行）₂具有细胞色素c（c）(26,39)从而导致促凋亡因子的细胞溶质释放。有趣的是，线粒体的反应 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 含有乌头糖的4Fe–4S(等式。7)不仅影响克雷布斯循环的代谢通量，还导致铁释放，随后通过芬顿样反应放大氧化事件(等式。8) (40):

{O（运行）}_{2}^{• -} + {[4 铁 - 4 S公司]}^{2 +} + 2 {H（H）}^{+} \to {H（H）}_{2} {O（运行）}_{2} + {[三 铁 - 4 S公司]}^{1 +} + 铁^{2 +},

[7]

铁^{2 +} + {H（H）}_{2} {O（运行）}_{2} \to 铁^{三 +} + {}^{•}{O（运行）} H（H） + 哦^{-} .

[8]

While期间等式。8表明羟基自由基的形成(^•OH）是生物系统中报告的最强大的氧化中间体，近端氧化剂的实际性质取决于低分子量铁螯合剂的性质（例如，有机酸、ATP）；的确，Fe⁴⁺=O复合物以可变比例与“真实”形成(^•职业健康）(41).

另一个关键来源 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 20世纪70年代在免疫系统细胞中发现，主要存在于中性粒细胞和巨噬细胞，即NADPH氧化酶。这是一种在吞噬细胞质膜中组装和激活的多组分酶复合物（参考文献。30). 当通常处于静息状态时，在适当的刺激下，如吞噬入侵的病原体（细菌、细胞内寄生虫），信号传导过程允许酶的胞质成分向膜转移，并组装酶的活性形式，从而触发 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 在最初被描述为“氧化爆发”的过程中向细胞外环境的生成(等式。9):

NADPH公司 + 2 {O（运行）}_{2} \to {NADP公司}^{+} + 2 {O（运行）}_{2}^{• -} + {H（H）}^{+} .

[9]

在这个过程中， ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 在分子氧的单价还原过程中形成，以NADPH的还原当量为代价；大量 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 时间相对较短（中性粒细胞为15-30分钟，巨噬细胞为60-90分钟），主要用于氧化杀死入侵病原体。最近，有证据表明，许多其他类型的细胞都含有类似的酶活性，现在称为NOX酶家族(42)，但在这种情况下 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 形成的细胞数量很少，并且参与生理过程中的信号传递活动（例如，在血管内皮细胞中，NOX活性参与血压的调节）。

作为新的来源 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 逐渐确定，很明显，在广泛的病理生理相关条件下， ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 二次氧化剂参与破坏氧化还原平衡，促进氧化反应，可能导致细胞毒性。弗里曼和克拉波于1982年发表的前沿评论(43)阐述了自由基和氧化剂的可能细胞内和细胞外来源及其对蛋白质、脂质、糖和DNA的修饰作用，强调了氧化损伤与疾病生物学之间的联系。1986年，Helmut Sies提出了“氧化应激”的概念，即氧化剂和抗氧化剂系统之间的不平衡，支持后者，这是该领域的一个核心概念，最近得到了进一步完善（参考文献。31). 更新的定义考虑到了20世纪80年代末和90年代初发现的其他氧化中间产物的出现，如一氧化氮(^•NO）和过氧亚硝酸盐，以及对氧化还原中间体在细胞信号传递中所起作用的认识，扩大了氧化剂从病理学到生理学的作用范围。虽然氧化还原信号涉及可逆的氧化修饰（例如，过氧化物酶类中的硫醇氧化），但氧化损伤通常与不可逆或不可逆的氧化损伤有关（例如，蛋白质酪氨酸硝化）。

内皮衍生血管舒张因子是一氧化氮：与超氧化物自由基相互作用的早期数据

20世纪80年代中期，内皮衍生血管松弛因子（Furchgott最初称为EDRF）的化学特性在参考文献中进行了综述。44)被披露为^•NO，一种自由基，Moncada及其同事(45)和Ignarro等人(46). 一氧化氮是一种小的、中性的、疏水性分子，能够渗透细胞膜，并通过细胞室在血管壁中发挥旁分泌功能。扩散^•跨组织的NO受到其与氧合血红蛋白快速反应的限制，因此^•NO主要在组织内局部存在；估计的生物半衰期和扩散距离分别约为1～10s和50～1000μm。在确定了^•血管系统中NO，证据表明^•NO在其他组织和器官中可能是一种生理介质，其在神经传递和细胞免疫反应中的作用得到了重视。大多数的生物形成^•NO依赖于一氧化氮合酶（NOS）催化的严格控制的酶反应，一氧化氮合酶存在于三种亚型中[内皮型NOS（eNOS）、诱导型NOS和神经元型NOS](47).

在表征EDRF身份的不同证据中，据报道其稳定性缩短了 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 相反，SOD增加了其生物半衰期(48 –50). 这些从生理学角度进行的早期观察，毫无疑问是氧化还原和自由基生物学和医学领域新概念产生的基础。事实上^•乍一看，NO对生理群落来说意义不大。在20世纪80年代末和90年代初^•NO和氧化还原生理生化发生，为观察提供了生物学背景^•否和 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 可以以扩散控制的速率相互反应(51). 这种反应^•否，带 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 最初被生理学界认为是“调节”其生物半衰期的一种方式：被视为^•NO，反应只会导致未反应产物，主要是硝酸盐， $不_{三}^{-}$ .

过氧亚硝酸盐：一种“隐形”生物氧化剂

过氧亚硝酸盐作为生物氧化剂的发现是根据生理学的综合数据进行的(48 –50)和化学（参考文献。52)文学。

第一， ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 可以与发生反应^•水溶液中的NO生成过氧亚硝酸盐阴离子(51):

{O（运行）}_{2}^{• -} + {}^{•}{N个} O（运行） \to {ONOO公司}^{-} .

[10]

过氧亚硝酸盐阴离子与过氧亚硝酸（ONOOH）平衡：pK（K）_一37°C时为6.8(13). 因此，在生理相关的pH条件下，这两种物种共存，这是一个相关的考虑因素，因为ONOO⁻和ONOOH的反应不同(52). 此外，ONOOH在水溶液中不稳定，在没有分子目标的情况下会异构化为硝酸盐( $不_{三}^{-}$ ); 重要的是，早期的一份报告提出ONOOH的异构化涉及到^•OH和二氧化氮(^•不₂)部首(53)符合酚类化合物的ONOOH依赖硝化(54).

关于^•否，带 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 和ONOO的形成⁻20世纪90年代初，Beckman等人进行了开创性的观察，将其纳入了生物氧化损伤和氧化还原控制中断的新生化假说(12)Radi等人(13,55)和Ischiropoulos等人(56,57)均就读于伯明翰阿拉巴马大学。

Beckman等人最初提出过氧亚硝酸盐是一种生物相关的细胞毒性中间体(12). 这篇里程碑式的论文探讨了过氧亚硝酸盐在^•OH清除剂，因此将过氧亚硝酸盐的潜在毒性归因于^•OH或^•OH-“类似”物种。假设的形成^•OH产物是由过氧亚硝酸盐的质子催化均裂引起的；形成^•据估计，ONOOH产生的OH的产率≤30%(52)，其余直接异构化为硝酸盐(方案1).

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方案1。

过亚硝酸根的质子催化衰变。

ONOOH以1.13 s的表观速率常数衰减⁻¹在pH 7.4和37°C的磷酸盐缓冲液中(t吨_1/2=0.6秒）。Beckman等人报告后不久(12)Radi等人发现过亚硝酸根与硫醇的双分子反应(13)这一过程比过氧亚硝酸盐均溶快得多。事实上，使用停流分光光度法发现，过氧亚硝酸盐与半胱氨酸和BSA的单一硫醇基团（Cys-34）的反应具有明显的二级速率常数4500和2600 M⁻¹●秒⁻¹分别在pH 7.4和37°C下。例如，假设细胞内硫醇浓度为5 mMk个₂1350 M左右⁻¹●秒⁻¹[例如，谷胱甘肽（GSH）(58)]6.75s的伪一阶速率常数⁻¹计算结果表明，该值大于过亚硝酸根的质子催化衰变值。此外，参考文献中报告的反应。13比相同测试的硫醇与H的反应快三个数量级₂O（运行）₂过氧亚硝酸盐与硫醇直接反应的机理研究(52)表明硫醇通过双电子氧化氧化生成相应的亚硫酸：

ONOOH公司 + {RS系列}^{-} \to RSOH公司 + 不_{2}^{-} .

[11]

参考文献中报告的研究。13为广泛表征过亚硝酸根与多种生物分子和合成化合物的反应和速率常数铺平了道路，并有助于确定过亚硝酸盐在生物系统中的优先命运（参考文献综述）。52). 总的来说，过氧亚硝酸盐反应的动力学评估得出以下结论：^•生物系统中的OH是一个定量的边际过程。静止，过氧化亚硝酸盐衍生^•OH和^•不₂可能在生物膜和脂蛋白氧化、疏水性生物结构中发挥作用，其中过氧亚硝酸盐的直接反应物水平很少，单电子氧化通过涉及脂质衍生自由基的链式反应传播(59).

在过渡金属中心催化的过程中，过氧亚硝酸盐也能促进蛋白质中酪氨酸残基的硝化。的确，Ischiropoulos等人(57)发现过亚硝酸根导致SOD硝化；亲水性酪氨酸类似物[对-羟基苯乙酸(第页-HPA）]被用作“硝化探针”，以证明巨噬细胞由于热电联产而形成过氧亚硝酸盐^•否和 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ (56). 因此，过氧亚硝酸盐开始被视为一种细胞毒性效应分子，可对抗细菌和单细胞寄生虫等可被巨噬细胞或中性粒细胞吞噬的入侵生物(60 –64). 这些最初的工作促使人们探索过氧亚硝酸盐在多种炎症中的作用(65)，心血管疾病(66,67)和神经变性(68)条件，以及其他各种疾病（参考文献。52). 过去十年里，其他地方已经报道过过氧亚硝酸盐对病理学的贡献作用的彻底观点(14,52,69,70).

最近的工作也证实了血红素化合物与^•NO和O₂(71). 这种结构的一个显著的生物例子是^•否至 $不_{三}^{-}$ 根据以下反应通过氧血红蛋白(等式。12):

{血红蛋白}^{2 +} {O（运行）}_{2} + {}^{•}{N个} O（运行） \to [{血红蛋白}^{2 +} {O（运行）}_{2} 不] \to [{血红蛋白}^{三 +} {ONOO公司}^{-}] \to {血红蛋白}^{三 +} + 不_{三}^{-} .

[12]

中间体[Hb³⁺ONOO公司⁻]络合物容易异构化，大约定量到 $不_{三}^{-}$ 通过“笼内”重组^•不₂与氧代铁酰基（Fe⁴⁺=O）中间(72). 然而，异构化的效率似乎不是100%：极少量的^•不₂笼子泄漏(71,73)在存在的情况下，少量的氧-Hb被硝化（<1%产率）^•否。[Hb的这种边际但持续的“自由基泄漏”³⁺ONOO公司⁻]复合物（可能延伸至其他过渡金属中心的过程）可能有助于正常血细胞（α-Tyr24、α-Tyr 42、β-Tyr 130）中的血红蛋白酪氨酸硝化。过氧亚硝酸盐本身可以通过阴离子通道穿过红细胞膜(74)与氧血红蛋白反应，主要异构化为 $不_{三}^{-}$ ; 反应还产生～10%的氧代铁酰基中间体，^•不₂和蛋白质自由基(75)，这也有助于血红蛋白硝化。吸烟者和2型糖尿病患者体内血红蛋白的氧化修饰（包括酪氨酸硝化）大大增强(76,77)、破坏血管的条件^•NO和氧化还原代谢。

二氧化碳对氧化还原生物化学的调节：碳酸盐自由基

在我进行的表征过氧亚硝酸盐与鲁米诺反应性的实验中，对过氧亚硝酸盐的生物化学进行了重要观察(27). 这些实验背后的最初想法，基于我早期在化学发光方面的经验(25,78)目的是研究鲁米诺化学发光是否可以用于揭示生化和细胞系统中过氧亚硝酸盐的形成。事实上，过氧亚硝酸盐诱导了一种强有力的化学发光反应，尤其是在碳酸缓冲液中以某种方式增强了许多倍(27). 考虑到碳酸氢盐/二氧化碳( ${HCO公司}_{三}^{-} / {一氧化碳}_{2}$ )参与了 ${海洋石油总公司}_{2}^{-}$ 在化学激发过程中，可随后促进鲁米诺第一个单电子氧化步骤的中间体（亚硝基过氧羧酸盐）。

尽管过氧亚硝酸盐与 ${HCO公司}_{三}^{-} / {一氧化碳}_{2}$ 在第一次捐款中没有完全解决(27)，不同小组的一系列后续观察结果（参考文献。52)揭示了实际的反应物和产物(方案2).

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方案2。

过亚硝酸根与二氧化碳反应并形成二次自由基。

的确，ONOO的快速反应⁻带CO₂导致短暂的加合物( ${海洋石油总公司}_{2}^{-}$ )然后同分解为碳酸盐自由基( ${一氧化碳}_{三}^{• -}$ )和^•不₂以～35%的收益率(52). 与pH无关的速率常数(k个_二氧化碳)反应速率为5.8×10⁴米⁻¹●秒⁻¹pH 7.4和37°C。考虑到CO₂与…平衡 ${HCO公司}_{三}^{-}$ 生物系统中的CO₂通常以1-2 mM的浓度存在，很明显CO₂构成过氧亚硝酸盐的主要反应物(79). 这些工作强调了CO的作用₂之前被认为是氧化还原生物学中相对惰性的分子，可能在生物上调节过氧亚硝酸盐介导的反应。 ${一氧化碳}_{三}^{• -}$ 是一种很好的单电子氧化剂，在其他反应中，促进酪氨酸的单电子氧化为酪氨酸自由基，这是酪氨酸硝化的关键步骤（见下文）。最终证据表明 ${一氧化碳}_{三}^{• -}$ 通过与Ohara Augusto及其同事合作进行的实验中的直接电子顺磁共振研究，首次直接“可视化”了水溶液中的过亚硝酸根反应(80)巴西圣保罗大学。最近的工作支持CO的观点₂也可以调制H₂O（运行）₂生物化学(81,82).

蛋白质3-硝基酪氨酸：足迹和介体

直接来自分子氧还原的活性物种，例如 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ ，H₂O（运行）₂、和^•OH会导致生物分子发生各种氧化修饰。事实上，由于这些物种在生物系统中的短暂寿命和低稳态浓度，它们的形成可以从发现的更稳定的氧化产物中多次推断出来（例如，蛋白质羰基、F2-异前列腺素、8-氧鸟嘌呤，分别用于蛋白质、脂质和DNA氧化）。Ischiropoulos等人在发现过程中认识到过氧亚硝酸盐是一种生物相关氧化剂，发现蛋白质3-硝基酪氨酸是一种特征性的氧化修饰，可能成为“过氧亚硝基足迹”(56,57)[过亚硝酸根在细胞和组织中的生物半衰期估计为～10–20ms(79)]. 实际上，过氧亚硝酸盐促进硝化作用（即，氢被a–NO取代₂3硝基酪氨酸的酪氨酸残基(52). 通过添加过氧亚硝酸盐硝化的第一个测试蛋白质是SOD(57)X射线晶体学第一个表征硝化蛋白的是牛CuZn-SOD(83); 在蛋白质硝化过程中，由于3-硝基酪氨酸在420-nm区域在pH≥7.4时的特征吸收，溶液的可见颜色变为黄色。

我清楚地记得1991年的一天，乔·S·贝克曼（Joe S.Beckman）带着一根试管来到我所在的伯明翰阿拉巴马大学实验室，试管中含有一种经过氧亚硝酸盐处理过的CuZn-SOD黄色溶液，紧接着就蛋白质颜色变化的可能性质进行了热烈的讨论。酪氨酸残基的硝化导致pK（K）_一从～10.5到7–7.5，酪氨酸中的酚羟基的pH值≥3单位，这一变化意味着在生理pH值区域，有很大一部分3-硝基酪氨酸在–OH基脱质子化，因此带负电的硝基酚物种是黄色的原因。蛋白质酪氨酸硝化最初被认为是过氧亚硝酸盐的特定足迹，但后来发现，酪氨酸残基也可以通过过氧亚硝基离子诱导的依赖机制在体内硝化，包括血红素附酶的参与，如髓过氧化物酶（MPO）和嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）(84). 事实上，在急性炎症条件下，体内蛋白质酪氨酸硝化的一个关键替代途径依赖于活化中性粒细胞释放的MPO催化的反应，MPO作为底物H₂O（运行）₂和 $不_{2}^{-}$ (85). 不管硝化系统的性质如何，体内蛋白质酪氨酸硝化的整体机制依赖于自由基化学。过亚硝酸根不与酪氨酸直接反应(86)但过氧亚硝酸盐衍生自由基和其他单电子氧化剂（Ox）导致酪氨酸自由基（Tyr^•)，进而以接近扩散控制的速率与^•不₂生成稳定的最终产物3-硝基酪氨酸(87) (图2).

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图2。

自由基和酪氨酸硝化过程。

最近对酪氨酸硝化的生物学相关机制进行了综述(52). 总的来说，蛋白质3-硝基酪氨酸的存在揭示了^•可以通过实验揭示NO-衍生氧化剂以及过氧亚硝酸盐与其他硝化系统的相对相关性(87). 明智的是，探针的硝化作用第页-HPA和硝基的定量-第页-活化巨噬细胞细胞外环境中的HPA首次估算了过氧亚硝酸盐的可行生物通量(56). 识别蛋白质3-硝基酪氨酸抗体的研究进展(67,88)提示过氧亚硝酸盐在动脉粥样硬化、炎症、败血症和神经退行性变等病理相关条件下形成至关重要。随后，通过对人体血浆和组织中蛋白质3-硝基酪氨酸的生物分析测定，可以对3-硝基酪酸作为疾病生物标志物和预测因子的作用进行更定量的观察（参考文献。89). 此外，大量研究分析了临床前疾病模型中蛋白质3-硝基酪氨酸的形成以及人类组织和体液中积累的数据，证实了过氧亚硝酸盐在人类病理学中的作用(52,69,70,90).

蛋白质中酪氨酸残基的硝化作用早在其体内相关性已知之前就已经研究过了。事实上，20世纪60年代的开创性研究利用四硝基甲烷（TNM）等合成硝化剂来探索酪氨酸残基的化学修饰如何影响蛋白质功能(91). 尽管在比较硝化剂如TNM和过氧亚硝酸盐时，硝化的近端机制和硝化酪氨酸残基的选择性通常不同(52)大量早期信息证明有助于揭示酪氨酸硝化在蛋白质结构和功能中的作用。此外，最近的证据表明，在胃的酸性pH条件下（例如胃蛋白酶），亚硝酸盐的作用可以在胃腔中发生蛋白质酪氨酸硝化(92)]表明酪氨酸硝化的一些早期化学可能适用于某些生物相关条件。根据酪氨酸残基的作用和位置，在酪氨酸中加入硝基可引起蛋白质结构和功能的相关变化。酪氨酸硝化通常会给蛋白质产生额外的负电荷，并向蛋白质添加相对笨重的取代基，这可能会影响局部电荷分布和/或构象(52). 已经建立了几个硝化作用导致蛋白质功能丧失和获得的例子。此外，蛋白质酪氨酸硝化可引发自身免疫反应，并影响酪氨酸磷酸化级联和蛋白质周转(52).

一氧化氮终止酪氨酸硝化中脂质过氧化和脂质衍生自由基

的反应^•否，带 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 通常通过过氧亚硝酸盐的中介作用导致促氧化事件(55)包括生物膜和脂蛋白中多不饱和脂肪酸的脂质过氧化(93). 然而，^•NO还可以终止自由基过程并阻止自由基链传播反应。这种过程的第一个例子是观察到过量可以抑制脂质过氧化^•NO并产生多种亚硝基和硝基脂肪酸衍生物(94). 事实上，生物膜和脂蛋白中的不饱和脂肪酸的氧化是由一个单电子氧化引发的，导致脂肪烷基自由基（L^•)与分子氧迅速反应生成相应的脂质过氧自由基（LOO^•)是脂质过氧化过程中繁殖的关键物种。通常，LOO^•会导致相邻的不饱和脂肪酸部分氧化，尽管这是一个缓慢的反应；然而，^•NO容易与LOO反应^•以产生氧化和亚硝化的脂肪酸中间体（例如LOONO），然后最终可以进化成一系列硝化的（例如LONO2）脂肪酸物种。此外，硝化脂肪酸，尤其是硝基烯烃，是良好的亲电试剂，可引发广泛的有效生物（和药理）作用(95)包括抗炎特性。

另一方面，LOO^•可以促进氨基酸氧化，“连接”生物膜和脂蛋白中的脂质过氧化和蛋白质氧化过程。这种反应性的一个具体例子是通过LOO将酪氨酸单电子氧化为酪氨酸自由基^•促进酪氨酸氧化和硝化(96). 在这种情况下，分子氧成为酪氨酸氧化生成的关键调节剂，当LOO^•是酪氨酸的近端氧化剂(59). 此外，这种化学促进了LOO结合反应产生的交织产物的形成^•和Tyr^•，Diels-Alder加合物(97).

超氧化物歧化酶、一氧化氮和过氧亚硝酸盐

与体内过氧亚硝酸盐形成有关的最有趣的动力学方面之一依赖于这样一个事实，即细胞内和细胞外舱室中普遍存在的SOD应在很大程度上限制 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 具有^•否。事实上，SOD通常在哺乳动物线粒体中大量存在[例如，～10–20μM的MnSOD(33)]和反应速率常数 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 歧化(等式。6) (k个_草地,方案3)接近扩散控制极限（～1–2×10⁹米⁻¹●秒⁻¹). 因此，乍一看，很难想象 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 通过^•NO，通常在大多数生理相关条件下以亚摩尔浓度存在[例如，eNOS激活期间100 nM(98)].

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方案3。

SOD和一氧化氮对超氧自由基的竞争。

然而，即使在生理条件下，这种竞争也存在，导致过亚硝酸盐和过亚硝酸钠衍生产品（如酪氨酸硝化蛋白）的基本水平的形成。需要考虑的一个至关重要的方面是 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 具有^•否(等式。10) (k个_不,方案3)生成过亚硝酸根的速率比SOD催化的速率高一个数量级 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 肢解。极快的反应是以下几个例子之一 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 反应性超过SOD的反应性[例如 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 含铁硫的脱水酶如乌头糖为10⁶到10⁷米⁻¹●秒⁻¹(99)]. 在低水平^•NO（10–100 nM），大多数 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ “通量”将通过SOD反应传导；仍占 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 将与其他目标发生反应，尤其是^•NO，因此在基本生理条件下会产生持续的过氧亚硝酸盐通量。当组成型一氧化氮合酶（eNOS或nNOS）持续过度激活或诱导iNOS时，^•NO将接近或超过微摩尔水平，并将更有效地与SOD竞争，从而产生更显著的过氧亚硝酸盐通量。一个微妙的问题是，SOD活性的增加（例如诱导或过度表达）只能部分缓解过氧亚硝酸盐的形成率，因为伴随而来的瞬时增加^•NO水平（其次是稳态浓度的降低 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ !). 换句话说，在动力学上不可能完全阻止SOD在^•NO-产生细胞。

之间相互作用的一个显著例子 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ ,^•NO和SOD是哺乳动物MnSOD的情况。事实上，在体外和体内，MnSOD被临界Tyr34硝化后产生的过氧亚硝酸盐反应和灭活(52,100). 解决了导致Tyr34定点硝化的速率常数和机理(101). 重要的是，由于活性部位硝化的金属催化机制，过氧亚硝酸盐是唯一已知的硝化剂，通过硝化导致MnSOD失活。因此，体内对Tyr34硝化MnSOD的检测反映了过氧亚硝酸盐在线粒体内的形成或作用。

我们已经将过氧亚硝酸盐介导的MnSOD硝化和失活的观察扩展到进化相关的含铁SOD（哺乳动物中不存在），包括原生动物寄生虫的那些克氏锥虫恰加斯病的病原体(102). 过氧亚硝酸盐是一种关键的巨噬细胞衍生的细胞毒性物质，在激活的巨噬细胞吞噬体T.cruzi公司入侵寄生虫并促进蛋白质酪氨酸硝化(64). 细胞溶质和线粒体亚型的反应T.cruzi公司已披露含过氧亚硝酸盐的Fe-SOD(102)但这些发现在寄生虫感染性和毒力方面的生物学相关性需要进一步研究。

硫醇、过氧还蛋白和过氧亚硝酸盐

过亚硝酸根与低分子硫醇相对较快的反应₂O（运行）₂最初的想法是，哺乳动物细胞中以毫摩尔浓度存在的谷胱甘肽等化合物可能是体内过氧亚硝酸盐的优先靶点。然而，后面描述的与CO反应更快₂（和其他生物分子）表明，典型的硫醇将被过氧亚硝酸盐的其他靶标竞争。在这种情况下，内森及其同事在21世纪初进行了一项引人注目的观察(103)这表明细菌中的一类含硫醇的抗氧化酶，即过氧化物酶类，与过氧亚硝酸盐发生大规模反应，并将其还原为 $不_{2}^{-}$ 由于出现“快速反应硫醇”；在这种情况下，微生物和哺乳动物过氧化物酶原已被确定为过氧亚硝酸盐的重要生物汇(52,104). 事实上，不同的过氧氧化还原蛋白与过氧亚硝酸盐反应k个范围为10⁶到10⁷米⁻¹●秒⁻¹，在生理pH下比谷胱甘肽快三到四个数量级。过氧化物酶类通过过氧亚硝酸盐的双电子还原作用作为过氧亚硝基氧化还原酶 $不_{2}^{-}$ (等式。11)并已证明能解毒和保护机体免受过氧亚硝酸盐的细胞毒性作用(52). 氧化还原伴侣，如硫氧还蛋白或相关蛋白或硫醇化合物，将硫醇氧化的过氧氧化还原素还原回天然状态。此外，微生物过氧化物酶原(64)和其他快速含硫过氧化物酶(105)由于其对活化的巨噬细胞和中性粒细胞释放的过氧亚硝酸盐具有中和作用，因此被认为是毒力因子。

H二阶速率常数的最新汇编₂O（运行）₂与快速反应蛋白巯基的过氧亚硝酸盐表明，虽然在许多情况下，两种过氧化物达到的值相似，但情况并非总是如此，一些蛋白质与过氧亚硝基反应的速度明显加快(106). 这些数据支持蛋白质巯基与过氧亚硝酸盐的细胞内反应的选择性（与H₂O（运行）₂)并指出在信号传递过程中可能存在“过氧亚硝酸盐传感器”或“过氧亚硝酸盐中继系统”。

另一方面，低分子量硫醇（如GSH）参与调节过氧亚硝酸盐依赖反应（例如，抑制蛋白质酪氨酸硝化）依赖于单电子氧化还原过程，包括快速还原^•不₂和自由基中间体（例如，酪氨酸自由基修复为酪氨酸）(52).

一氧化氮、过氧亚硝酸盐和线粒体

早期工作表明^•细胞产生NO导致细胞呼吸改变(107 –109). 的此属性^•NO导致的假设是，免疫刺激巨噬细胞对靶细胞的某些细胞毒性作用是由于线粒体电子传递链受到抑制。事实上，细胞的长潜伏期^•NO导致线粒体电子运输复合物I和II失活(110). 当时，我发现这些观察很有趣，因为^•对于生物分子来说，这是不明显的^•NO本身会永久干扰电子传递复合物的活性。因此，我们假设^•不依赖于进程不是由于^•NO本身，而是过氧亚硝酸盐，可能在线粒体内形成。事实上，利用完整的线粒体制剂，我们发现暴露于过氧亚硝酸盐会导致电子传递流抑制模式，这完全重现了在细胞中观察到的数据(111). 此外，过氧亚硝酸盐导致NADH脱氢酶和琥珀酸脱氢酶失活，而不影响细胞色素氧化酶。有趣的是，细胞色素氧化酶对过氧亚硝酸盐的抗性部分是由于其作为过氧亚硝基还原酶的能力(112). 另一方面，纯粹^•NO被发现通过与细胞色素氧化酶的血红素基团结合（与分子氧竞争），导致复合物IV的可逆抑制。20世纪90年代中期几个群体的贡献（参考文献中进行了回顾）。111和113)和更多最新数据支持的想法^•到达线粒体的NO水平通过一系列事件导致线粒体功能障碍：(我)复合体IV呼吸的可逆抑制(ii（ii）)电子泄漏增强与线粒体形成 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ , (三)形成过氧亚硝酸盐(iv（四）)线粒体复合物I和II的氧化、硝化和S-亚硝化，以及(五)复合物I和II的失活。这一序列的事件有助于改变电化学梯度、线粒体氧化还原和生物能量稳态、通透性转换孔的开放以及随后的凋亡信号。需要注意的是，线粒体外位点产生的过氧亚硝酸盐也能到达线粒体并引起氧化损伤。由于线粒体是一氧化碳的主要来源₂，一些过氧亚硝酸盐将与之反应并通过二级自由基(方案2)触发泛喹啉单电子氧化制备泛半醌(114)进一步促进线粒体 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 形成。

总的来说，线粒体构成了^•NO由于持续形成 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 这一特征解释了为什么在基础条件下线粒体已经具有显著水平的硝化蛋白，以及关键的线粒体蛋白，包括MnSOD，在病理相关条件下显著硝化(115).

过亚硝酸根的生物定量

自由基和氧化还原生物学领域的一个主要问题涉及生物系统中生成的氧化剂的“数量”，以及如何在向细胞和组织施用氧化剂的实验中重述这一代氧化剂。关键的区别在于形成速率与稳态浓度的不同问题，这在大多数情况下都没有得到充分认识(116). 例如， ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 细菌不同细胞类型的形成率(117)对血管内皮细胞(33)在炎症细胞中氧化还原稳态破坏或NADPH氧化酶激活期间，其数量约为微摩尔/秒，并大幅增加。然而，由于SOD浓度高（5–20μM）和歧化速率常数， ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 稳态浓度估计在纳米摩尔水平。NOS激活或诱导后的一氧化氮生成速率也在微摩尔每秒范围内。在这种情况下，早期工作中的间接测量估计过氧亚硝酸盐的形成速率为~5μM·s⁻¹在活化巨噬细胞的吞噬体内，该值与添加的过氧亚硝酸盐对细胞内病原体的毒性作用完全一致[例如。，克氏锥虫,大肠杆菌(60,61)]. 过氧亚硝酸盐的浓度和细胞通量与添加纯过氧亚硝基盐（团注或滴注）的浓度和影响的转换不明显，但数学近似和实验证据证实，过氧亚硝酸盐生成速率的初始估计及其与细胞效应的相关性是合理的(52). 最近的实验证实了过氧亚硝酸盐在细胞内病原体杀灭中的作用(64)，对过氧亚硝酸盐探针（如硼基化合物）的研究证实了对不同细胞类型形成速率的估计(118,119). 由于细胞内消耗或分解过氧亚硝酸盐的系统不同，因此可以在纳摩尔范围内估计得到稳态浓度(79).

一氧化氮衍生氧化剂与疾病

形成过氧亚硝酸盐，通常^•一氧化氮衍生氧化剂与多种常见疾病过程相关，包括动脉粥样硬化、高血压、神经变性、癌症、炎症和脓毒症(52,69,70). 这个^•否/ ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 相互作用可以通过以下方式调节病理生理效应(我)削弱…的有益作用^•否(ii（ii）)过氧亚硝酸盐或二者的组合促进氧化和硝化反应。大量文献证明，蛋白质酪氨酸硝化是疾病进展的良好氧化生物标志物。此外，过氧亚硝酸盐和蛋白质酪氨酸硝化也参与正常老化过程(120,121). 除过氧亚硝酸盐外，其他^•NO-衍生氧化剂参与涉及炎症的疾病。事实上，中性粒细胞或嗜酸性粒细胞的激活和脱颗粒导致释放血红素过氧化物酶（MPO，EPO），促进氯化、溴化和硝化物种的形成(85,87). 揭示过氧亚硝酸盐依赖和独立途径对蛋白质酪氨酸硝化的相对贡献与开发适当的治疗方法有关，例如中和过氧亚硝基或MPO途径(87,122). 血红素过氧化物酶可进一步促进^•NO衍生氧化剂(我)催化过氧亚硝酸盐依赖的硝化反应(52)和(ii（ii）)消耗^•NO通过其化合物I和II转化为 $不_{2}^{-}$ (123); 总的来说，血红素过氧化物酶是^•炎症部位的NO，限制了其生物利用度，并将其化学性质转向硝化。

最近报道了蛋白质酪氨酸硝化及其与可能与疾病相关的功能变化的关联的一些示例(52). 作为一个相关的例子，早期研究表明，内源性过亚硝酸盐的形成和蛋白质酪氨酸硝化参与了培养中运动神经元的凋亡(124); 后来在ALS动物模型中的研究表明，在疾病进展过程中，脊髓运动神经元中蛋白质衍生自由基和3-硝基酪氨酸的形成(125). 有趣的是，过氧亚硝酸盐依赖性运动神经元凋亡可以通过细胞可渗透的酪氨酸肽来阻止，酪氨酸肽可以使关键蛋白质免于硝化(126)例如HSP90。事实上，硝基-HSP90被鉴定为运动神经元细胞死亡的诱导因子(127).

基于氧化还原的中和过亚硝酸根的治疗

随着有关过氧亚硝酸盐作为致病介质参与的证据增多，人们构思并制定了应对策略。一种明显的可能性是通过减少^•NO和/或 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 的确，NOS和NADPH氧化酶抑制剂已成功用于防止过氧亚硝酸盐的形成和减轻氧化损伤(64,128). 或者，在药理学上直接分解过氧亚硝酸根或清除过氧亚硝酸根衍生的自由基已被证明在体外和体内是成功的。我将评论一系列分子通过直接或间接反应干扰过亚硝酸根效应的例子。锰卟啉（MnP）型有机金属化合物被描述为过氧亚硝酸盐分解催化剂，以及其他可能的氧化还原功能(129 –131). MnP在Mn中施用³⁺状态，并在细胞内还原为Mn²⁺通过各种酶和非酶系统，包括线粒体电子传递链复合物(132). 百万分之一²⁺状态下，它们可以容易地与速率常数约为10的过氧亚硝酸盐阴离子反应⁶到10⁷米⁻¹●秒⁻¹，将其减少为 $不_{2}^{-}$ 使MnP处于化合物的4+状态；后者通过GSH、尿酸（UA）或抗坏血酸（Asc）等低分子量化合物回到3+状态(52)，然后重新启动过亚硝酸根分解的催化循环(图3).

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图3。

锰磷催化过亚硝酸根分解。

值得注意的是，MnTBAP是一种主要用于减轻疾病细胞和动物模型中氧化应激的MnP，通常被引用为“SOD模拟物”，在体内缺乏显著的SOD活性，其直接“抗氧化”作用可能是由于过氧亚硝酸盐分解(133). 研究表明，MnP可以中和许多疾病条件下的过氧亚硝酸盐依赖过程，减少细胞/组织成分的氧化和硝化，并改善生物结果。可到达细胞和细胞器[包括线粒体]的锰磷安全水平(134)]在微摩尔范围内，该值可以与其他流行的过氧亚硝酸盐反应（包括与CO的反应）很好地竞争₂(79). MnP是一类在临床前疾病模型中有用的化合物，有望应用于某些临床条件。就有效清除过氧亚硝酸盐衍生自由基的分子而言，尿酸就是一个显著的例子(52). 事实上，内源性尿酸或尿酸水平的提高降低了体内外过氧亚硝酸盐的毒性作用，并大大减少了蛋白质酪氨酸硝化(135). 类似地，线粒体泛醌醇库的扩张(114)或给予线粒体靶向泛喹啉（mitoQ）(136)结果通过在体内外拦截过氧亚硝酸盐产生的自由基中间体，对过氧亚硝基诱导的线粒体功能障碍具有保护作用。其他拦截过氧亚硝酸盐衍生自由基的方法包括使用细胞可渗透的酪氨酸肽(126). 最后，最近的研究表明，有机硒化合物可以激活氧化还原敏感的信号通路（如Nrf-2和FoxO3），并导致细胞溶质和线粒体抗氧化酶系统（包括MnSOD和过氧化物酶类）的上调降低细胞内过氧亚硝酸盐浓度并保护细胞免受过氧亚硝基依赖性毒性的影响(137).

最终反射

自从认识到自由基和氧化剂可以内源性形成以来，大约60年过去了。在这方面，我三十年的研究主要集中在导致这些物种酶和非酶形成的生化机制、它们与生物分子的反应以及它们在生理和病理过程中的影响。我们对 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ /^•NO的相互作用和过氧亚硝酸盐的氧化化学有助于了解线粒体功能障碍的条件和细胞氧化还原稳态的改变，这些在人类疾病中起作用。从这个意义上说，基于氧化还原的疗法代表了通过活性中间体的直接解毒和/或通过触发细胞保护和抗氧化信号通路来恢复细胞和组织稳态的有前途的工具。我的研究道路受益于跨越和整合几十年来产生的科学知识，以及促进氧化还原生物化学和分子医学之间的协同作用。

致谢

我非常感谢娜塔莉亚·里奥斯（Natalia Rios）对马里奥·加尔卡尼奥（Mario Calcagno）和克劳迪奥·斯卡佐奇奥（Claudio Scazzocchio）在蒙得维的亚（Montevideo）纪念约翰·托特（John R.Totter）的日子的作品和回忆的帮助。我感谢所有为我们在乌拉圭蒙得维的亚共和国大学的研究项目做出共同贡献的联合研究者和合作者，以及为我们的工作提供长期支持的资助机构，包括霍华德·休斯医学院和国家卫生研究院。

脚注

作者声明没有利益冲突。

工具书类

1Gerschman R、Gilbert DL、Nye SW、Dwyer P、Fenn WO。氧中毒和x射线照射：一种常见的机制。科学。1954;119:623–626.[公共医学][谷歌学者]

2Daniels M，Scholes G，Weiss J.脱氧核糖核酸水溶液中的x射线辐照后效应。自然。1953;171:1153–1154.[公共医学][谷歌学者]

三。弗里多维奇I.超氧化物自由基和超氧化物歧化酶。Acc化学研究。1972;10:321–326. [谷歌学者]

4.Fridovich I，Handler P.黄嘌呤氧化酶。三、亚硫酸盐氧化作为超灵敏分析。生物化学杂志。1958;233:1578–1580.[公共医学][谷歌学者]

5Neta P，Huie RE。亚硫酸盐的自由基化学。环境健康展望。1985;64:209–217. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

6Reed GA、Curtis JF、Mottley C、Eling TE、Mason RP。（+/-）-7,8-二羟基-7,8--二氢苯并的环氧化[一]芘在（bi）亚硫酸盐自氧化过程中：由助癌原激活原癌原。美国国家科学院程序。1986;83:7499–7502. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

7Fridovich I，Handler P.亚硫酸盐氧化引发酶氧化过程中产生的自由基检测。生物化学杂志。1961;236:1836–1840.[公共医学][谷歌学者]

8McCord JM，Fridovich I.细胞色素的还原c（c）通过牛奶黄嘌呤氧化酶。生物化学杂志。1968;243:5753–5760.[公共医学][谷歌学者]

9.Cantu-Medellin N，Kelley EE。黄嘌呤氧化还原酶催化活性物种生成：一个亟需重新评估的过程。氧化还原生物。2013;1:353–358. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

10.Sawyer DT，Valentine J.超氧物是什么？Acc化学研究。1981;14:393–400. [谷歌学者]

11弗里多维奇I.超氧化物自由基和超氧化物歧化酶。生物化学年度收益。1995;64:97–112.[公共医学][谷歌学者]

12.Beckman JS、Beckman TW、Chen J、Marshall PA、Freeman BA。过氧亚硝酸盐产生的明显羟自由基：一氧化氮和超氧化物对内皮损伤的影响。美国国家科学院程序。1990;87:1620–1624. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

13.Radi R，Beckman JS，Bush KM，Freeman BA。巯基的过亚硝酸氧化。超氧化物和一氧化氮的细胞毒性。生物化学杂志。1991;266:4244–4250.[公共医学][谷歌学者]

14Radi R.过氧亚硝酸盐，一种隐形生物氧化剂。生物化学杂志。2013;288:26464–26472. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

15弗里多维奇一世在巨人的帮助下。生物化学年度收益。2003;72:1–18.[公共医学][谷歌学者]

16Totter JR，De Dugros EC，Riveiro C.化学发光化合物作为黄嘌呤氧化酶作用期间自由基生成的可能指示物的使用。生物化学杂志。1960;235:1839–1842.[公共医学][谷歌学者]

17.托特JR、麦地那VJ、斯科塞利亚JL。在硝酸二甲基双吡啶存在下黄嘌呤氧化酶氧化次黄嘌呤的过程中的发光。生物化学杂志。1960;235:238–241.[公共医学][谷歌学者]

18Merényi G、Lind J、Eriksen TE。鲁米诺化学发光：化学，激发，发射极。生物铝化学发光杂志。1990;5:53–56.[公共医学][谷歌学者]

19.Di Mascio P，Medeiros MH.黑暗生物过程中产生的单重态分子氧。自由基生物医药。2014;75（补充1）：S28–S29。[公共医学][谷歌学者]

20Boveris A等。器官化学发光：氧化自由基反应的无创检测。美国国家科学院程序。1980;77:347–351. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

21Cadenas E，Sies H.低水平化学发光作为生物系统中单重态分子氧的指示物。方法酶制剂。1984;105:221–231.[公共医学][谷歌学者]

22Blanco PR、De Angelis WJ、Demicheli De Díaz G、Prodanov E.使用三苯基四氮唑研究黄嘌呤氧化酶活性的双相法。蒙托夫·乌鲁格共和国医科大学。1965;50:114–120.[公共医学][谷歌学者]

23Blanco PR、Oyamburo GM、Prodanov E、Garciamoreira C.黄嘌呤氧化酶。鲁米诺化学发光法检测次黄嘌呤酶促氧化的一些动力学特征。蒙托夫·乌鲁格共和国医科大学。1963;48:349–354.[公共医学][谷歌学者]

24Oyamburo GM、Prego CE、Prodanov E、Soto H.黄嘌呤氧化酶。通过鲁米诺化学发光研究次黄嘌呤的酶催化氧化。Biochim生物物理学报。1970;205:190–195.[公共医学][谷歌学者]

25Radi RA、Rubbo H、Prodanov E.超氧化物歧化酶和细胞色素作用的比较c（c）黄嘌呤氧化酶催化反应产生的鲁米诺化学发光。Biochim生物物理学报。1989;994:89–93.[公共医学][谷歌学者]

26Kagan VE等，细胞色素c（c）充当释放促凋亡因子所需的心磷脂加氧酶。自然化学生物。2005;1:223–232.[公共医学][谷歌学者]

27Radi R，Cosgrove TP，Beckman JS，Freeman BA。过氧亚硝酸盐诱导鲁米诺化学发光。生物化学杂志。1993;290:51–57. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

28Loschen G，Azzi A，Richter C，FlohéL.作为线粒体过氧化氢前体的超氧化物自由基。FEBS信函。1974;42:68–72.[公共医学][谷歌学者]

29Boveris A，Cadenas E.线粒体产生超氧阴离子及其与抗霉素不敏感呼吸的关系。FEBS信函。1975;54:311–314.[公共医学][谷歌学者]

30.Babior BM.NADPH氧化酶。Curr Opin免疫学。2004;16:42–47.[公共医学][谷歌学者]

31Sies H、Berndt C、Jones DP。氧化应激。生物化学年度收益。2017;86:715–748.[公共医学][谷歌学者]

32墨菲议员。线粒体如何产生活性氧物种。生物化学杂志。2009;417:1–13. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

33Quijano C、Castro L、Peluffo G、Valez V、Radi R。高血糖内皮细胞线粒体超氧化物增强：过氧化氢和过氧亚硝酸盐的直接测量和形成。美国生理学杂志心脏循环生理学。2007;293：H3404–H3414。[公共医学][谷歌学者]

34Turrens JF、Freeman BA、Crapo JD。高氧增加H₂O（运行）₂由肺线粒体和微粒体释放。生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。1982;217:411–421.[公共医学][谷歌学者]

35Cadenas E，Davies KJ。线粒体自由基生成、氧化应激和衰老。自由基生物医药。2000;29:222–230.[公共医学][谷歌学者]

36MD品牌。线粒体产生超氧化物和过氧化氢，作为线粒体氧化还原信号的来源。自由基生物医药。2016;100:14–31.[公共医学][谷歌学者]

37墨菲议员。理解和预防线粒体氧化损伤。生物化学Soc Trans。2016;44:1219–1226. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

38Gardner PR、Raineri I、Epstein LB、White CW。超氧化物自由基和铁调节哺乳动物细胞中的顺乌头酸酶活性。生物化学杂志。1995;270:13399–13405.[公共医学][谷歌学者]

39.Radi R、Sims S、Cassina A、Turrens JF。过氧化氢酶和细胞色素的作用c（c）大鼠心脏和肾脏线粒体中过氧化氢依赖性脂质过氧化和化学发光。自由基生物医药。1993;15:653–659.[公共医学][谷歌学者]

40Vasquez-Vivar J，Kalyanaraman B，Kennedy MC。线粒体乌头酸酶是羟基自由基的来源。电子自旋共振研究。生物化学杂志。2000;275:14064–14069.[公共医学][谷歌学者]

41.山崎一世，左皮埃特。铁反应的ESR自旋追踪研究²⁺含H的离子₂O（运行）₂-生物氧毒性中的活性物种。生物化学杂志。1990;265:13589–13594.[公共医学][谷歌学者]

42Lambeth JD，Neish AS。Nox酶和活性氧的新思维：一把双刃剑重新审视。《病理学年鉴》。2014;9:119–145.[公共医学][谷歌学者]

43Freeman BA、Crapo JD。疾病生物学：自由基和组织损伤。实验室投资。1982;47:412–426.[公共医学][谷歌学者]

44Furchgott射频。内皮衍生舒张因子：发现、早期研究和鉴定为一氧化氮。收件人：Jornvall H，编辑。1996-2000年诺贝尔生理学或医学讲座。世界科学出版公司；新加坡：2003年。第152-169页。[谷歌学者]

45Palmer RMJ、Ferrige AG、Moncada S.一氧化氮释放是内皮衍生舒张因子的生物活性的原因。自然。1987;327:524–526.[公共医学][谷歌学者]

46Ignarro LJ、Buga GM、Wood KS、Byrns RE、Chaudhuri G.动脉和静脉产生和释放的内皮衍生舒张因子是一氧化氮。美国国家科学院程序。1987;84:9265–9269. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

47Marletta MA。一氧化氮合酶：结构和催化方面。单元格。1994;78:927–930.[公共医学][谷歌学者]

48Gryglewski RJ，Palmer RM，Moncada S.超氧阴离子参与内皮衍生血管舒张因子的分解。自然。1986;320:454–456.[公共医学][谷歌学者]

49Rubanyi GM，Vanhoutte PM。超氧阴离子和高氧灭活内皮衍生舒张因子。美国生理学杂志。1986;250：H822–H827。[公共医学][谷歌学者]

50Ignarro LJ、Byrns RE、Buga GM、Wood KS、Chaudhuri G。内皮衍生舒张因子为一氧化氮的药理证据：使用邻苯三酚和超氧化物歧化酶研究内皮依赖性和一氧化氮诱导的血管平滑肌舒张。药理学实验与治疗杂志。1988;244:181–189.[公共医学][谷歌学者]

51内华达州布拉夫市，萨菲里奥县。在碱性水溶液中，超氧物与一氧化氮反应生成过氧亚硝酸盐。无机化学。1985;24:3502–3504. [谷歌学者]

52Ferrer Sueta G等。过氧亚硝酸盐和蛋白质酪氨酸硝化的生物化学。化学版次。2018;118:1338–1408.[公共医学][谷歌学者]

53Mahoney LR.过亚硝酸在水溶液中异构化为硝酸时形成羟基自由基的证据。美国化学学会杂志。1970;92:5262–5263. [谷歌学者]

54Halfpenny E，Robinson PL.过亚硝酸对芳香化合物的硝化和羟基化。化学社会杂志。1952;1952:939–946. [谷歌学者]

55Radi R，Beckman JS，Bush KM，Freeman BA。过氧化亚氮诱导的膜脂质过氧化：超氧化物和一氧化氮的细胞毒性潜力。生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。1991;288:481–487.[公共医学][谷歌学者]

56Ischiropoulos H、Zhu L、Beckman JS。巨噬细胞衍生一氧化氮形成过氧亚硝酸盐。生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。1992;298:446–451.[公共医学][谷歌学者]

57Ischiropulos H等。超氧化物歧化酶催化过氧亚硝酸盐介导的酪氨酸硝化。生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。1992;298:431–437.[公共医学][谷歌学者]

58Koppenol WH、Moreno JJ、Pryor WA、Ischiropoulos H、Beckman JS。过氧亚硝酸盐，一种由一氧化氮和超氧物形成的隐形氧化剂。化学研究毒物。1992;5:834–842.[公共医学][谷歌学者]

59Bartesaghi S等。跨膜肽中的酪氨酸氧化和硝化与脂质过氧化有关。生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。2017;622:9–25.[公共医学][谷歌学者]

60Zhu L、Gunn C、Beckman JS。过氧亚硝酸盐的杀菌活性。生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。1992;298:452–457.[公共医学][谷歌学者]

61Denicola A、Rubbo H、Rodríguez D、Radi R.过氧亚硝酸盐介导的细胞毒性克氏锥虫.生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。1993;304:279–286.[公共医学][谷歌学者]

62Evans TJ等。细胞因子处理的人类中性粒细胞含有诱导型一氧化氮合酶，可使摄入的细菌硝化。美国国家科学院程序。1996;93:9553–9558. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

63De Groote MA等。周质超氧化物歧化酶保护沙门氏菌来自吞噬细胞NADPH-氧化酶和一氧化氮合酶的产物。美国国家科学院程序。1997;94:13997–14001. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

64Alvarez MN，Peluffo G，Piacenza L，Radi R.吞噬体内过氧亚硝酸盐作为一种巨噬细胞衍生的抗内化细胞毒素克氏锥虫：氧化杀伤的后果以及微生物过氧化物酶在传染性中的作用。生物化学杂志。2011;286:6627–6640. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

65Mulligan MS、Hevel JM、Marletta MA、Ward PA。免疫复合物沉积引起的组织损伤是我-精氨酸依赖性。美国国家科学院程序。1991;88:6338–6342. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

66.White CR等。动脉粥样硬化中的超氧化物和过氧亚硝酸盐。美国国家科学院程序。1994;91:1044–1048. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

67Beckmann JS等。免疫组织化学检测人类动脉粥样硬化中蛋白质酪氨酸的广泛硝化。生物化学霍普·塞勒。1994;375:81–88.[公共医学][谷歌学者]

68Beckman JS、Carson M、Smith CD、Koppenol WH。ALS、SOD和过氧亚硝酸盐。自然。1993;364:584.[公共医学][谷歌学者]

69SzabóC、Ischiropoulos H、Radi R.过氧亚硝酸盐：生物化学、病理生理学和治疗学的发展。Nat Rev药物发现。2007;6:662–680.[公共医学][谷歌学者]

70Pacher P，Beckman JS，Liaudet L.健康和疾病中的一氧化氮和过氧亚硝酸盐。生理学评论。2007;87:315–424. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

71Sharma SK等人，一种六配位过氧亚硝酸盐低自旋铁（III）卟啉络合物——一氧化氮（·NO）反应的产物_（g）)含铁超氧物。美国化学学会杂志。2017;139:17421–17430. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

72Herold S，Exner M，Nauser T.氧化肌红蛋白和氧化血红蛋白的NO*介导氧化动力学和机理研究。生物化学。2001;40:3385–3395.[公共医学][谷歌学者]

73韦德RS，卡斯特罗CE。含氧肌红蛋白与NO、NO的反应₂和否₂⁻在氩气和空气中。化学研究毒物。1996;9:1382–1390.[公共医学][谷歌学者]

74Denicola A，Souza JM，Radi R.过氧亚硝酸盐在红细胞膜上的扩散。美国国家科学院程序。1998;95:3566–3571. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

75Romero N等人，《人类血红蛋白与过氧亚硝酸盐的反应》。异构化为硝酸盐和蛋白质自由基的二次形成。生物化学杂志。2003;278:44049–44057.[公共医学][谷歌学者]

76陈海杰，陈永春。活性氮氧化物物种诱导人类血红蛋白的翻译后修饰及其与吸烟的关系。分析化学。2012;84:7881–7890.[公共医学][谷歌学者]

77陈华杰，杨玉凤，赖萍，陈凤。纳米液相色谱-串联质谱法分析2型糖尿病患者血红蛋白中酪氨酸的氯化、硝化和亚硝化以及蛋氨酸和半胱氨酸的氧化。分析化学。2016;88:9276–9284.[公共医学][谷歌学者]

78Radi R，Rubbo H，Thomson L，Prodanov E.使用黄嘌呤和次黄嘌呤·鲁米诺作为黄嘌呤氧化酶底物的化学发光。自由基生物医药。1990;8:121–126.[公共医学][谷歌学者]

79Ferrer-Sueta G，Radi R.过氧亚硝酸盐的化学生物学：动力学、扩散和自由基。ACS化学生物。2009;4:161–177.[公共医学][谷歌学者]

80Bonini MG、Radi R、Ferrer-Sueta G、Ferreira AM、Augusto O。过氧亚硝酸盐和二氧化碳产生的碳酸盐自由基阴离子的直接EPR检测。生物化学杂志。1999;274:10802–10806.[公共医学][谷歌学者]

81.Trindade DF、Cerchiaro G、Augusto O。过碳酸一酯在碳酸氢盐/二氧化碳对刺激生物硫醇过氧化中的作用。化学研究毒物。2006;19:1475–1482.[公共医学][谷歌学者]

82Liochev SI，Fridovich I.CO公司₂，非HCO_三⁻，促进Cu、Zn超氧化物歧化酶加H的氧化₂O（运行）₂.美国国家科学院程序。2004;101:743–744. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

83Smith CD等。过氧亚硝酸盐修饰牛铜、锌超氧化物歧化酶的晶体结构。生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。1992;299:350–355.[公共医学][谷歌学者]

84van der Vliet A、Eiserich JP、O'Neill CA、Halliwell B、Cross CE。活性氮对酪氨酸的修饰：更详细的研究。生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。1995;319:341–349.[公共医学][谷歌学者]

85.Brennan M-L等人。两个争议的故事：使用嗜酸性粒细胞过氧化物酶和髓过氧化物酶缺乏小鼠定义过氧化物酶在体内硝基酪氨酸形成中的作用，以及过氧化物酶生成活性氮物种的性质。生物化学杂志。2002;277:17415–17427.[公共医学][谷歌学者]

86Alvarez B，Ferrer-Sueta G，Freeman BA，Radi R.过亚硝酸根与氨基酸和人血清白蛋白反应的动力学。生物化学杂志。1999;274:842–848.[公共医学][谷歌学者]

87Radi R.一氧化氮、氧化剂和蛋白质酪氨酸硝化。美国国家科学院程序。2004;101:4003–4008. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

88Ye YZ、Strong M、Huang ZQ、Beckman JS。识别硝基酪氨酸的抗体。方法酶制剂。1996;269:201–209.[公共医学][谷歌学者]

89Batthyány C等人，《酪氨酸硝化蛋白质：蛋白质组学和生物分析方面》。抗氧化剂氧化还原信号。2017;26:313–328. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

90Brito C等。过氧亚硝酸盐通过促进酪氨酸磷酸化损伤和过氧亚硝酸盐驱动的凋亡死亡来抑制T淋巴细胞的活化和增殖。免疫学杂志。1999;162:3356–3366.[公共医学][谷歌学者]

91Sokolovsky M，Riordan JF，Vallee BL.四硝基甲烷。一种用于硝化蛋白质中酪氨酸残基的试剂。生物化学。1966;5:3582–3589.[公共医学][谷歌学者]

92Rocha BS等人。胃蛋白酶在大鼠胃中被硝化，获得抗溃疡活性：饮食硝酸盐和肠道蛋白质之间的新型相互作用。自由基生物医药。2013;58:26–34.[公共医学][谷歌学者]

93Darley-Usmar VM、Hogg N、O'Leary VJ、Wilson MT、Moncada S。超氧化物和一氧化氮的同时产生可引发人体低密度脂蛋白的脂质过氧化。自由基Res Commun。1992;17:9–20.[公共医学][谷歌学者]

94Rubbo H等。一氧化氮对超氧化物和过氧亚硝酸盐依赖性脂质过氧化的调节。新型含氮氧化脂质衍生物的形成。生物化学杂志。1994;269:26066–26075.[公共医学][谷歌学者]

95Schopfer FJ，Cipollina C，Freeman BA。亲电脂质的形成和信号传递作用。化学版次。2011;111:5997–6021. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

96Bartesaghi S等。脂质过氧自由基介导细胞膜中的酪氨酸二聚化和硝化。化学研究毒物。2010;23:821–835. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

97Shchepin R等人，自由基终止的酪氨酸脂质过氧化物加合物：对位偶联和分子内Diels-Alder环化。美国化学学会杂志。2010;132:17490–17500. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

98蒙卡达S，希格斯EA。一氧化氮的发现及其在血管生物学中的作用。英国药理学杂志。2006;147：S193–S201。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

99Hausladen A，Fridovich I.测量一氧化氮和超氧化物：乌头酶反应的速率常数。方法酶制剂。1996;269:37–41.[公共医学][谷歌学者]

100洛杉矶麦克米兰-克罗公司、克劳JP公司、科尔比JD公司、贝克曼JS公司、日本汤普森公司。人肾移植慢性排斥反应中锰超氧化物歧化酶的硝化和失活。美国国家科学院程序。1996;93:11853–11858. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

101.Demicheli V等人。人类锰超氧化物歧化酶与过氧亚硝酸盐反应的机制：关键酪氨酸的硝化34。生物化学。2016;55:3403–3417.[公共医学][谷歌学者]

102Martinez A等人。过氧亚硝酸盐介导硝化和灭活的结构和分子基础克氏锥虫铁超氧化物歧化酶（Fe-SODs）A和B：由于Cys83通过分子内电子转移修复Fe-SODB中的Tyr35自由基而导致的不同敏感性。生物化学杂志。2014;289:12760–12778. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

103Bryk R，Griffin P，Nathan C.细菌过氧化物酶类的过氧亚硝酸盐还原酶活性。自然。2000;407:211–215.[公共医学][谷歌学者]

104Trujillo M等人。布氏锥虫和克氏锥虫色氨酸红素过氧化物酶通过氧化快速反应的硫醇来催化脱毒过氧亚硝酸盐。生物化学杂志。2004;279:34175–34182.[公共医学][谷歌学者]

105.Alegria TG等。Ohr在细菌对脂肪酸氢过氧化物和过氧亚硝酸盐的反应中起着核心作用。美国国家科学院程序。2017;114：E132–E141。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

106Trujillo M、Alvarez B、Radi R.硫醇的单电子和双电子氧化：机理、动力学和生物命运。自由基研究。2016;50:150–171.[公共医学][谷歌学者]

107Drapier JC，Pellat C，Henry Y.在与活化巨噬细胞共同培养的肿瘤靶细胞中生成EPR可检测的亚硝基铁络合物。生物化学杂志。1991;266:10162–10167.[公共医学][谷歌学者]

108Brown GC、Bolaños JP、Heales SJ、Clark JB。活化的星形胶质细胞产生的一氧化氮快速可逆地抑制细胞呼吸。神经科学快报。1995;193:201–204.[公共医学][谷歌学者]

109Bolaños JP、Peuchen S、Heales SJ、Land JM、Clark JB。一氧化氮介导的培养星形胶质细胞线粒体呼吸链抑制。神经化学杂志。1994;63:910–916.[公共医学][谷歌学者]

110Radi R、Cassina A、Hodara R、Quijano C、Castro L.线粒体中的过氧亚硝酸盐反应和形成。自由基生物医药。2002;33:1451–1464.[公共医学][谷歌学者]

111Radi R，Rodriguez M，Castro L，Telleri R.过氧亚硝酸盐对线粒体电子传递的抑制。生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。1994;308:89–95.[公共医学][谷歌学者]

112Pearce LL、Pitt BR、Peterson J.细胞色素的过氧亚硝酸盐还原酶活性c（c）氧化酶涉及血红素a（3）-Cu（B）位点的双电子氧化还原反应。生物化学杂志。1999;274:35763–35767.[公共医学][谷歌学者]

113Moncada PS。一氧化氮和氧气：在健康和疾病中的作用和相互作用。氧化还原生物。2015;5:421.[公共医学][谷歌学者]

114Schöpfer F等。过氧亚硝酸盐对泛喹啉的氧化作用：线粒体对亚硝化损伤的保护意义。生物化学杂志。2000;349:35–42. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

115Castro L、Demicheli V、Tórtora V、Radi R.线粒体蛋白酪氨酸硝化。自由基研究。2011;45:37–52.[公共医学][谷歌学者]

116温特博恩CC。协调活性氧的化学和生物学。自然化学生物。2008;4:278–286.[公共医学][谷歌学者]

117Imlay JA公司。细胞对超氧物和过氧化氢的防御。生物化学年度收益。2008;77:755–776. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

118Zielonka J等人。硼酸盐探针作为实时监测过氧亚硝酸盐和过氧化氢的诊断工具。化学研究毒物。2012;25:1793–1799. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

119Rios N等人。使用硼酸荧光素对细胞衍生过氧亚硝酸盐通量的敏感检测和估算。自由基生物医药。2016;101:284–295.[公共医学][谷歌学者]

120.Viner RI、Ferrington DA、Williams TD、Bigelow DJ、Schöneich C.生物老化过程中的蛋白质修饰：肌浆网钙的SERCA2a亚型的选择性酪氨酸硝化²⁺-骨骼肌中的ATP酶。生物化学杂志。1999;340:657–669. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

121.van der Loo B等人。过氧亚硝酸盐形成增强与血管老化相关。《实验医学杂志》。2000;192:1731–1744. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

122Eiserich JP等人。中性粒细胞中髓过氧化物酶形成一氧化氮衍生的炎症氧化剂。自然。1998;391:393–397.[公共医学][谷歌学者]

123Abu-Soud HM，Hazen SL。一氧化氮调节髓过氧化物酶的催化活性。生物化学杂志。2000;275:5425–5430.[公共医学][谷歌学者]

124Estévez AG等。一氧化氮和超氧化物有助于营养因子剥夺诱导的运动神经元凋亡。神经科学杂志。1998;18:923–931. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

125Cassina P等人。SOD1G93A负载星形胶质细胞的线粒体功能障碍促进运动神经元变性：通过线粒体靶向抗氧化剂进行预防。神经科学杂志。2008;28:4115–4122. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

126Ye Y，等。含酪氨酸肽预防过氧亚硝酸盐诱导的运动神经元和PC12细胞凋亡。生物化学杂志。2007;282:6324–6337.[公共医学][谷歌学者]

127Franco MC等。Hsp90硝化诱导细胞死亡。美国国家科学院程序。2013;110：E1102–E1111。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

128Zielonka J等。作为抑制过氧亚硝酸盐形成的策略的NADPH氧化酶2活性的缓解。生物化学杂志。2016;291:7029–7044. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

129Lee J、Hunt JA、Groves JT。锰卟啉作为氧化偶联过氧亚硝酸盐还原酶。美国化学学会杂志。1998;120:6053–6061. [谷歌学者]

130Ferrer-Sueta G，Batinić-Haberle I，SpasojevićI，Fridovich I，Radi R.异构体Mn（III）对过氧亚硝酸盐的催化清除N个-还原剂存在下的甲基吡啶卟啉。化学研究毒物。1999;12:442–449.[公共医学][谷歌学者]

131.Batinic-Haberle I等人，《SOD疗法：对其构效关系和对细胞氧化还原信号通路影响的最新见解》。抗氧化剂氧化还原信号。2014;20:2372–2415. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

132Valez V等人，暴露于一氧化氮的亚线粒体颗粒中过氧亚硝酸盐的形成：锰卟啉的检测、氧化损伤和催化去除。生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。2013;529:45–54. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

133Batinić-Haberle I等人。纯MnTBAP选择性地清除超氧化物上的过氧亚硝酸盐：在两种氧化应激损伤模型（SOD-特异性大肠杆菌模型和角叉菜胶诱导的胸膜炎。自由基生物医药。2009;46:192–201. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

134SpasojevićI等。基于锰卟啉的超氧化物歧化酶（SOD）模拟物，MnIIITE-2-PyP5+，靶向小鼠心脏线粒体。自由基生物医药。2007;42:1193–1200. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

135Hooper DC等。尿酸，一种过氧亚硝酸盐的天然清除剂，用于实验性变态反应性脑脊髓炎和多发性硬化症。美国国家科学院程序。1998;95:675–680. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

136Miquel E等。线粒体靶向抗氧化剂MitoQ在遗传性肌萎缩侧索硬化模型中的神经保护作用。自由基生物医药。2014;70:204–213.[公共医学][谷歌学者]

137Fiuza B等。SIN-1衍生的过氧亚硝酸盐通量对内皮细胞氧化还原稳态和生物能量学的影响：二苯基二硒醚通过诱导过氧氧化还原素的保护作用。自由基研究。2015;49:122–132.[公共医学][谷歌学者]

文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院