热等离子体A-ATPase A亚单位的内含子：结构、进化和表达大肠杆菌

摘要

背景

在过去的十年中，人们发现一些基因被自私的遗传元素打断，这些遗传元素与宿主蛋白一起翻译成框架。在翻译后处理过程中，这些元素将自身从宿主蛋白质中切除（参见[1]和[2]最近的评论）。剪接过程中删除的序列称为内含子（内部蛋白质的缩写）；宿主蛋白的部分被称为exteins（外部蛋白）[三-5].

内切蛋白无需任何已知的宿主特异性活性，即可促进其从宿主蛋白中清除。这种现象被称为蛋白质剪接，大约十年前在酿酒酵母V-ATP酶催化亚单位A[6,7]. 内切蛋白切除依赖于内切蛋白的剪接结构域和C-外切蛋白的第一个氨基酸残基[8]. 迄今为止已知的内含子长度在134到608个氨基酸之间，它们来自生命的三个领域：真核生物、真细菌和古细菌。Pietrokovski关于inteins的网页http://blocks.fhcrc.org/~pietro/inteins公司/目前在34种不同类型的蛋白质中列出了100多个内含子[9]. 宿主蛋白质的功能多样，包括代谢酶、DNA和RNA聚合酶、回转酶、蛋白酶、核糖核苷酸还原酶以及空泡型和古生型ATP酶。这些蛋白质的共同特征是它们在DNA复制过程中的表达[1]以及它们在进化过程中的低替代率[9].

大多数报道的内含子由两个结构域组成：一个负责蛋白质剪接，另一个具有核酸内切酶活性[10-13]. 内切酶的功能是将内含子传播到宿主蛋白的无内含子同源物。在这个称为归巢的过程中，编码无内含子同源物的基因在内含子整合位点或其附近被核酸内切酶切割。在断裂基因的修复过程中，内含子被复制到以前的无内含子同源物。金布尔和索纳[14]显示在酿酒酵母使用之前去除了内含子编码部分的工程化V-ATPase基因。然而，一些内含子缺乏内切酶结构域。无此结构域的内切蛋白执行自动催化拼接[15,16]. 归巢核酸内切酶和归巢过程在自剪接内含子中得到了更深入的研究[17]，并且假设该过程与内含物类似。

嗜酸热浆菌是迄今为止已报道其内含物的16个古菌之一（内含物数据库http://www.neb.com/inteins/int_reg.html[18]). 属的成员热等离子体缺乏细胞壁并拥有细胞骨架。它们生活在高温和酸性环境中，经常附着在硫磺颗粒上[19].嗜酸乳杆菌在59°C和外部pH值介于1-2之间时生长最佳[20]. 已间接测量到5.5的细胞质pH值[21].

质子泵ATP酶/ATP合成酶存在于当今所有生物群中[22]. 典型的古生物ATP合酶与真核生物液泡ATP酶同源。由于序列高度相似，古代ATP合成酶（A型ATP酶）有时被标记为液泡型或V型ATP酶。古细菌和液泡型ATP酶均与细菌F-ATP酶同源，但与F-ATP酶的序列相似性水平远低于V-和A-ATP酶。迄今为止，已鉴定出7种物种在其ATP酶催化亚单位中含有内含子。第一个内含子是在vma公司-1个基因酵母菌属[7]. 酵母热带念珠菌[23]在同一位置拥有一个intein。整合素也存在于嗜酸热单胞菌、火山锥菌、深海热球菌、霍里克希菌和P.furiosus公司。

这里我们提供了克隆和表达嗜酸乳杆菌A-ATP酶A亚单位大肠杆菌，我们还讨论了内含子在生物体中的定位、繁殖和分布的意义。

结果

的序列分析嗜酸乳杆菌内肽

这个嗜酸乳杆菌在对来自嗜酸乳杆菌用于系统目的[24]. 最近嗜酸乳杆菌[25]和火山锥[26]已报告。在这两种情况下，ATPsynthase的催化亚单位是整个基因组中唯一报道有内含子的基因。使用PSI-BLAST[27]使用不同的内含子作为种子，与查询序列相比，序列标识少于10%的发散内含子被恢复（未显示数据）；然而，使用这种方法，我们没有发现任何额外的内含子或归巢内切酶编码基因嗜酸乳杆菌。

不同内含子序列的多重序列比对确定了八个由适度保守残基组成的基序[18,28]. A-ATP酶A亚单位热等离子体和热球菌属intein多序列比对（带手动修改）如图所示​图1。1. The嗜酸乳杆菌内含子（173个氨基酸长）是已知的最短内含子之一，与其他内含子的比对表明，没有与典型内切酶基序同源的序列。只有自剪接域的基序特征出现在热等离子体内含物（见图​图11).

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图1

古代ATP酶A亚单位内含子序列的比对。中的巨大差距热等离子体序列表明嗜酸热浆菌（Tac）和热浆火山（Tvo）内含子不包含内切酶结构域，只包含自剪接结构域，而深海热球菌（Pab）、糠秕热球菌（Pfu）和P.horikoshii（照片）A-ATP酶A-亚单位内含子是双功能的。与保守块相对应的区域[18]以粗体和标记的A-H表示。区块A、B、F和G是剪接域的一部分，而区块C、D、E和H是典型的LAGDIDAG型内切酶[18].

比赛的重要性嗜酸乳杆菌使用PRSS在http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta/prss.htm[29]. 该匹配的P值，即仅通过偶然机会获得该质量匹配的概率，被计算为低于10^-10这表明，不仅外显子，而且内含子本身都具有可识别的同源性。相反，所有已知内含子的序列比对表明内含子序列的发散性要大得多（未显示）。例如，用于比较嗜酸乳杆菌和酿酒酵母内含子为0.28，即酵母和热等离子体只有使用成对比对才能检测到内含子。

内含子在宿主蛋白中的位置

液泡ATP酶和古菌ATP酶与细菌和器质F型ATP酶同源。牛线粒体F的结构₁-ATP酶已通过X射线晶体学测定[30]. 酵母V-ATP酶的内含子插入点和热等离子体和热球菌属A-ATP酶对应于ATP在催化循环中结合并水解的催化位点。图​图22表明内含子位于这些非常保守的蛋白质的区域[22]替代率最低的国家。

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图2

沿古生和液泡ATP酶A亚基的分化。该图描述了沿着62个空泡型和古生型ATP酶催化亚基排列的10个氨基酸残基的滑动窗口计算的每个位点的取代数。纵坐标给出了在路线中每个位置观察到的替换数量。箭头指示内嵌的位置。第一（A）给出了热等离子体和热球菌，第二个（B）给出了酵母液泡ATP酶的位置。

A-ATP酶催化亚基与16S rRNA系统发育的比较

古代ATP酶催化亚基和小亚基核糖体RNA的系统发育如图所示​图3。三对一组相似物种进行了两种系统发育计算。虽然这两种系统发育显示出一些显著的差异，但它们都没有将来自热等离子体使用热球菌属同源物。在这两种系统发育中，还有其他几个古生菌，即。，jannaschii支原体、嗜热石支原体、热球菌属、盐杆菌属、甲藻属和热自养甲烷杆菌在ATP酶催化亚单位中携带内含子的两个组之间的分支。所有这些介入的古细菌ATP酶都没有内含子。

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图3

液泡/古细菌ATP酶A亚基和小亚基核糖体RNA系统发育的比较。（A）中描述的系统发育仅根据基因外显部分计算；（B） 根据小亚单位核糖体RNA计算。这些树被计算为未生根的，但被描述为生根，使用真核生物作为古生菌（A）的外群，或使用克雷纳恰奥塔作为欧雷纳恰奥塔（B）的外组。数字给出了使用简约分析从100个引导样本中计算出的引导值。仅为支持率超过50%的组提供值。星号表示最大似然评估中的分支分别不大于其估计标准误差的3倍或2倍。所有其他分支至少比其标准偏差大三倍。有关所使用的系统发育重建方法的更多详细信息，请参阅实验程序。A亚基含有内含子的物种用箭头表示。

基因的表达和内含子剪接嗜酸乳杆菌A-ATP酶A亚基

编码嗜酸乳杆菌将A-ATPase A亚基克隆到表达载体pET-11a（Stratagene）中并转化为大肠杆菌Bl21（DE3）和大肠杆菌Bl21-CodonPlus（DE3）-RIL菌株用于蛋白质表达。什么时候？大肠杆菌Bl21（DE3）是一株不表达额外稀有tRNA的菌株，用克隆的嗜酸乳杆菌ATP酶A亚单位，在诱导细胞的提取物中未观察到额外的蛋白带（未显示）。然而大肠杆菌用相同质粒转化的Bl21-CodonPlus（DE3）-RIL菌株在诱导后表达两个额外的20和65 kDalton蛋白质（图。​（图4）。4). 诱导后，在85 kDa处未发现额外的条带，表明存在未处理的内含子。这表明自催化拼接在大肠杆菌。当大肠杆菌在42°C下生长和诱导，或当大肠杆菌在16°C下诱导16小时（图。​（图4A）。4A级). 在SDS凝胶电泳的制备过程中，在DTT存在下将样品加热至72°C。就温度而言，这些条件与嗜酸乳杆菌细胞质比条件大肠杆菌。肠内蛋白切除可能只发生在这种高温治疗期间。因此，诱导的蛋白质大肠杆菌在添加或不添加DTT的非变性条件下分离。从非变性凝胶中去除诱导带，并使用变性SDS凝胶电泳分离（图。​（图5）。5). 诱导后，两个缓慢迁移的带都可见（图中的A和B）。​图5），5)在SDS变性凝胶中分离后，仅发现一条主带对应于剪接和重排的A亚基。推测缓慢迁移带是a亚单位单体的二聚体或更高聚集体。在这些实验中，我们没有发现任何未加工或未完全拼接内含子的迹象。

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图4

诱导蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳大肠杆菌。面板A，车道1和3：大肠杆菌Bl21-CodonPlus（DE3）-RIL菌株用空pET-11a载体转化（阴性对照）；车道2、4、5和6：大肠杆菌Bl21-CodonPlus（DE3）-RIL菌株经热等离子体将A-ATP酶克隆到pET-11a中；1-4道：诱导细胞4h；第5通道：在16°C下诱导细胞16小时；通道6：在42°C下诱导细胞2小时；Sup.：上清液。面板B示意性地描述了拼接过程。未处理的嗜酸乳杆菌A-ATP酶A亚单位的计算大小为85 kDalton。内含子的预期分子量为20kDalton，重寄生宿主蛋白的重量约为65kDalton。

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图5

诱导蛋白的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳大肠杆菌。泳道1和2：来自细胞裂解物上清液的蛋白质的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。箭头指向包含的条带大肠杆菌用热等离子体A-ATP酶，但在阴性对照中不存在。样品缓冲液不含DTT或SDS。通道3、4、5和6是变性SDS聚丙烯酰胺凝胶中的分离物。通道3：来自通道2的电洗脱蛋白质（箭头A）；通道4：来自通道2的电洗脱蛋白（箭头B）；车道1和5：大肠杆菌Bl21-CodonPlus（DE3）-RIL菌株用空pET-11a载体转化（阴性对照）；车道2和6：大肠杆菌Bl21-CodonPlus（DE3）-RIL菌株经热等离子体A-ATPase克隆到pET-11a并在37°C下诱导8小时。

讨论

这个胡萝卜[32]和酿酒酵母（Alireza Senejani未发表）催化V-ATP酶亚基在大肠杆菌。相比之下嗜酸乳杆菌亚单位在大肠杆菌细胞质。尽管大肠杆菌细胞质和环境嗜酸乳杆菌互联网正在发挥作用体内，我们没有发现任何迹象表明，内含子的自我剪接在大肠杆菌。即使在大肠杆菌在较低的温度下生长，内部的处理和外部的重新结合看起来100%有效。当大肠杆菌蛋白质在非变性和非还原凝胶中分离。自动催化拼接嗜酸乳杆菌A-ATP酶催化亚单位在大肠杆菌细胞质。这个嗜酸乳杆菌A-ATPase内含子在非常不同的pH值下似乎有效剪接（7.2比5.5[21,33])和温度（16至37°与55°C[20]).

这个嗜酸乳杆菌内含子显示出与A-ATP酶催化亚基中发现的内含子的显著序列相似性热球菌。此外，这些内含子插入到ATP结合位点的相同高度保守序列中。这表明热等离子体和热球菌属在进化意义上是同源的，即。，它们来自一个共同的祖先基因。然而，热球菌属和热等离子体不被认为与古生菌有密切关系。根据它们的16S rRNA，它们被认为是远亲真古宙（见图。​图3b3亿).

对A-ATPase内含子的系统发育分类和分布之间差异的一种解释是水平基因转移：内含子不存在于热等离子体和热球菌，相反，intein在其中一个谱系分裂后侵入，最近水平转移到另一谱系。水平转移场景比假设存在于共享的共同祖先中更为简约，因为后者需要一些独立发生的内含子损失以及它在共同祖先中的长期持续性热球菌属和热等离子体血统(囊性纤维变性。图。​图3b）。3亿). 在不同物种之间，整个基因和操纵子的水平转移是一个经常发生的事件[34-37]. 甚至家政基因也在不同物种之间转移[37].

水平转移有两种可能性。要么整个A-ATP酶催化亚基被转移，要么内含子单独作为自私的遗传元素传播。为了区分这两种情况，我们构建了宿主蛋白的系统发育图（图。​（图3a）。3a年). 由此产生的系统发育与核糖体rRNA系统发育是合理一致的，主要的例外是脱硫球菌。根据其16S rRNA，这种生物被明确归类为Crenacheote；然而，其ATP酶催化亚基与嗜热球菌宿主蛋白本身不属于该属的发现热等离子体使用热球菌属表明内含子是在热等离子体和热球菌，以及热等离子体和热球菌属催化亚单位足以使其归巢到相同的插入位点。

内含子作为一种自私的遗传元素的散布与戈达德和伯特的工作一致[38]研究了酵母线粒体中含有归巢内切酶的内含子的持久性。这些作者研究了空靶位点的分布，以及含有和不含功能内切酶基因的内含子在不同酵母中的分布。他们得出结论，内含子的长期持续性取决于一个周期，该周期始于内含子在内含子内开放阅读框编码的归巢内切酶的帮助下侵入空靶位点。然而，一旦含有内含子的等位基因固定在群体中，核酸内切酶（其本身是内含子在群体中快速传播的原因）就不再被选择，核酸内切酶变得无功能并丢失，导致内含子没有归巢核酸内切酶活动。然而，一旦内切酶丢失，含有内含子的等位基因就更有可能被一个完全丢失内含子的等位基因取代，入侵和连续丢失的循环重新开始。

内脏归巢的过程可能依赖于类似的循环；然而，内含子丢失的时间间隔可能比内含子丢失更长。A-ATP酶和V-ATP酶内含子位于宿主基因最保守的部分。基因本身的内含子的任何缺失都需要精确，因为催化位点氨基酸序列的任何改变都可能导致一种不起作用的酶。比较序列分析（图。​（图1）1)表明嗜酸乳杆菌和火山T内含子不包含核酸内切酶结构域。我们对这些古生菌基因组的搜索没有发现任何可能在归巢中起作用的内切酶。虽然未能鉴定归巢核酸内切酶并不能证明其缺失，但以反式作用的归巢核酸酶的存在将是前所未有的，必须被视为不可能。自私遗传元素通过归巢长期持续存在的循环再侵入模型[38]表明小热等离子体内含子通过还原从含有内含子的大型核酸内切酶进化而来，类似于在高温球菌a-ATP酶中发现的内含子。很明显，小婴儿一直坚持热等离子体A-ATP酶自分裂后嗜酸乳杆菌和火山T没有归巢内切酶的帮助。

循环再灌注模型也解释了为什么插入位点位于替代率很低的区域：围绕整合点的高度序列相似性有助于利用归巢内切酶在不同种群和物种之间进行内含子转移。围绕整合点的更可变序列将限制同一物种成员的归巢，从而降低内含子长期存活的机会。

结论

小内脏热等离子体A-ATP酶与含有内含子的内切酶密切相关热球菌属A-ATP酶。用宿主蛋白（A-ATP酶催化亚基）和16S rRNA构建的系统发育不将这两种生物归为一类，这表明A-ATP酶内含子通过水平基因转移传播。小内脏一直存在热等离子体显然没有归位。这个嗜酸乳杆菌intein在表达于大肠杆菌。这种活性不取决于嗜酸乳杆菌细胞质。

材料和方法

嗜酸热浆菌培养物来自阿默斯特马萨诸塞大学的丹尼斯·西尔西。如前所述，培养生物体并分离其DNA[39]. DNA操作、测序和克隆遵循Sambrook中描述的标准程序等. [40]和奥苏贝尔等. [41].

致谢

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