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BMC生物化学。2001; 2: 10.
2001年10月15日在线发布。 doi（操作界面）：10.1186/1471-2091-2-10
PMCID公司：PMC59658型
PMID：11696247

β1整合素在低密度膜中与CD98蛋白特异性结合

塔蒂亚娜·科莱斯尼科娃,1 布莱恩·曼尼恩,2 费多·贝尔迪切夫斯基,三和马丁·海姆勒通讯作者1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景

CD98（4F2，FRP-1）是一种广泛表达的细胞表面蛋白异二聚体，由糖基化重链和非糖基化轻链组成。最初被描述为T细胞激活抗原，后来被证明在氨基酸运输、细胞融合和同源细胞聚集中发挥作用。一些证据表明其与整合素的功能性相互作用，但这种相互作用的生化基础尚不清楚。

结果

我们证明CD98与β1整合素（α2β1、α3β1、α5β1和α6β1）组成性和特异性结合，但与α4β1的结合程度最低。通过相互免疫沉淀实验建立了整合素-CD98的相关性，并通过CD98诱导横纹肌肉瘤细胞表面的α3β1而非α4β1聚集来证实。整合素CD98的结合独立于α亚基细胞质尾部，在α3β1配体相互作用缺陷突变体中保持，并且不受EDTA的抑制。在CD98重链中，C109S突变（但不是C330S突变）导致β1整合素结合缺失。同样的C109S突变也导致CD98轻链结合的丢失。重要的是，CD98选择性地与蔗糖梯度上的低密度“轻膜”组分中的β1整合素相关。CD98不存在于含有大多数β1整合素的致密组分中。值得注意的是，CD98的C109S突变体与β1整合素无关，也显示其在轻质膜组分中的定位降低。

结论

我们证明CD98与β1整合素的结合是特异性的，发生在低密度膜的环境中，可能需要CD98轻链。

背景

CD98（4F2，FRP-1）分子是一种细胞表面二硫键异二聚体，最初被描述为T细胞激活抗原[1]，后来被证明为CD3介导的T细胞激活提供了一个共同刺激信号[2]，独立于CD28/CD80/CD86相互作用[三]. 在其他研究中，触发人单核细胞CD98可以抑制T细胞增殖[4]或促进单核细胞的同型细胞聚集[5]. 此外，CD98可能是自然杀伤细胞的靶抗原[6]，可能介导血单核细胞融合导致破骨细胞形成[7,8]，并可能调节造血细胞存活和分化[9].

CD98分子也在快速生长的非造血细胞上广泛表达，在那里它可能调节致癌转化[10,11]，金属离子传输[12,13]，细胞融合[14,15]和氨基酸运输[16-19]. CD98也表达于正常增殖组织，如鳞状上皮的基底层[20]以及对具有分泌或运输功能的细胞[21]. 随着多个CD98轻链的克隆和表征，对CD98在氨基酸转运中的作用的理解大大增强。不同的CD98轻链似乎介导不同的氨基酸转运活性（有关审查，请参阅[22,23]).

一些证据表明CD98可能调节整合素的功能。例如，CD98和β1整合素可能在T细胞共同刺激期间一起作用[24]. 基因筛查显示CD98可能间接影响整合素对配体的亲和力[25]. 另外，在两项独立的研究中，抗CD98单抗似乎调节整合素依赖性粘附[25,26]. 此外，CD98和α3β1整合素抗体促进细胞融合[27]β1和β2整合素抗体阻断抗CD98单克隆抗体诱导的单核细胞-细胞融合和聚集功能[5]. 最后，与CD98一样，α3β1整合素也与氨基酸转运有关[28].

CD98和整合素功能相互作用的生化机制尚不清楚。在非常温和的清洁条件下（0.05%Triton X-100），CD98分子与固定化β1整合素细胞质尾部融合蛋白特异结合[29]，但CD98尚未显示与完整的β1整合素有物理相互作用。我们以无偏见的方式搜索整合素相关蛋白开始了本研究（即我们没有专门寻找CD98）。我们使用了一种单克隆抗体筛选方法，包括在非刺激性洗涤剂条件下对整合素进行联合免疫沉淀[30,31]. 使用这种方法，我们以前发现了特定β1整合素与其他细胞表面分子（包括CD147/EMMPRIN）之间的特定关联[31]和各种tetraspanin（跨膜-4超家族）蛋白[30,32,33]. 在本报告中，我们首次证明CD98与完整的β1整合素异二聚体构成性和特异性相关。特异性CD98整合素相互作用发生在低密度蛋白-脂质微结构域的背景下，可能类似于脂筏[34,35]. 一些重要的信号分子，包括活化的TCR、LAT和LCK，存在于有组织的筏型微域中，这些微域的完整性对于T细胞受体信号转导是必要的[36,37]. 我们目前的发现是，β1整合素在脂质微域中与CD98特异性相关，这有助于解释在T细胞共刺激、单核细胞融合等过程中，β1整合素与CD98之间的功能联系。

结果和讨论

CD98作为β1整合素相关蛋白的鉴定

用MTSV1-7人乳腺上皮细胞免疫小鼠，产生约600个杂交瘤。经单克隆抗体筛选，共鉴定出16种免疫共沉淀的整合素，但未直接识别整合素。其中一个识别出CD63，如之前报道的[30]，和三个（包括mAb 6B12）识别出由85 kD重链和35 kD轻链组成的二硫键细胞表面异二聚体。

来自I125表面标记的HT1080细胞，mAb 6B12在还原条件下免疫沉淀出85和35 kD的异二聚体（图。​（图1，1，lane a，固体箭头）和在非还原条件下120 kD的单个蛋白带（未显示），但在1%Triton XI 00洗涤剂中制备裂解产物时没有其他蛋白带。然而，在不太严格的Brij 58洗涤剂中，mAb 6B12共同免疫沉淀了130 kD的整合素样蛋白带（图。​（图1，1，车道b，虚线箭头）。当使用CHAPS或Brij 99清洁剂（未显示）时，注意到类似的结果。

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单克隆抗体6B12的特性。答：。HT1080细胞用125I、 在指定的洗涤剂中裂解（每种为1%），然后使用mAb 6B12免疫沉淀蛋白质（泳道a、b）。也，125在1%Triton XI 00中裂解I标记的Molt4细胞，并使用mAb 6B12（通道c）、4F2（通道d）或抗mAb A2-2E10（通道e）沉淀标记的蛋白质。在还原条件下，蛋白质在10%SDS-PAGE上溶解。B。转染CD98 cDNA（实线）、β1整合素cDNA（闭合虚线）或模拟转染（虚线）的中国仓鼠卵巢细胞分别用mAb 6B12染色。在FITC-标记的山羊抗鼠二抗染色后，如前所述，使用FACScan仪器（Becton Dickinson，Mountainview，CA）进行流式细胞术[30].

因为6B12识别的蛋白质类似CD98的二硫键85和35kD亚基[38,39]，将其与使用mAb 4F2沉淀的正品CD98进行比较。如还原SDS-PAGE所示，mAb 4F2和mAb 6B12都沉淀出相同的细胞表面蛋白模式（图。​（图1A，1安培，车道c、d）。此外，细胞裂解物与mAb 4F2的预培养导致mAb 6B12识别的抗原丢失（未显示）。在细胞裂解物中添加10 mM DTT后，mAb 6B12免疫沉淀仅产生85 kD蛋白带，这与CD98重链的特异性识别一致。转染CD98重链cDNA的CHO细胞的流式细胞术证实CD98重链子是6B12抗原（图。​（图1B）。1B年). 此外，通过流式细胞术，所有检测到的人类细胞系（超过20个）中的6B12抗原均呈高水平，与预期的CD98一样。

CD98整合素结合的特异性

为了鉴定与CD98共沉淀的整合素样130 kD蛋白，将HT1080细胞制备的免疫复合物分离并用单克隆抗体对各种细胞表面分子进行再沉淀。我们从CD98免疫沉淀物中回收了α3β1整合素，但没有回收其他细胞表面分子，包括LDL受体、HLA I类、金属蛋白酶调节物EMMPRIN（CD147）、CD71或CD109（图。​（图2A）。2安培). HT1080细胞上丰富的其他几种β1整合素（α3β1、α2β1、β5β1和α6β1）也可以从CD98免疫沉淀物中重新沉淀（图。​（图2C）。2摄氏度). 使用相同的实验条件，我们无法在从横纹肌肉瘤细胞系RD、淋巴母细胞系Molt4或转染α4整合素的K562细胞制备的CD98免疫沉淀中检测到α4β1（未显示）。然而，我们确实观察到在2 mM锰存在下CD98与α4β1整合素的免疫共沉淀（未显示）。锰的确切作用尚不清楚。与抗β1“激活抗体”TS2/16（未显示）孵育并没有模拟锰对α4β1-CD98结合的影响。因此，尽管众所周知锰可以“激活”β1整合素[60]，这种激活可能与α4β1-CD98关联无关。将从CD98免疫沉淀物中分离出来的材料与细胞表面每种整合素的总量进行比较，结果表明大约5-10%的整合素与CD98相关（图。​（图2C，2摄氏度，比较车道a-d和e-h）。在交互实验中，CD98重链从α3β1整合素免疫沉淀中重新沉淀（图。​（图2B，2B型，通道a）的水平与再沉淀CD81（通道b）相当，这是一种与α3β1整合素相关的分子[32]. 图中的结果。​图2A2安培和​和2B2B型表明CD98整合素复合物不同于先前描述的整合素-CD81[32,40]和整合素CD147/EMMPRIN[31]复合物。

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整合素与CD98的选择性共沉淀。答：。HT1080细胞用125一、 在1%Brij 58中溶解，然后用抗CD98单克隆抗体6B12免疫沉淀。然后使用1%Triton X-100分离CD98免疫沉淀物，并用单克隆抗体重新沉淀到指定的蛋白质。每条车道上方括号中的数字表示通过流式细胞术分析确定的每个细胞表面抗原的平均荧光强度。B。HT1080细胞隔夜贴上标签35S蛋氨酸在1%Brij 58中溶解，然后用单克隆抗体A3-IIF5免疫沉淀。使用1%Triton X100分离免疫复合物，并使用抗CD98 mAb 6B12或抗CD81 mAb M38重新沉淀。C、。分别使用单克隆抗体A2-2E10、A3-IIF5、A5-PUJ2和A6-BB（左4车道）通过免疫沉淀法分析A部分制备的裂解液。用单抗6B12进行免疫沉淀后，用1%Triton X100洗脱，并分别用A2-2E10、A3-IIF5、A5-PUJ2和A6-BB单抗进行再沉淀（右4车道）。D。转染野生型α3或α3整合素缺乏细胞质尾部（X3C0）的细胞，表面标记有125我在Brij 58中溶解了1%。用抗α3单克隆抗体A3-IIF5免疫沉淀裂解液（左2道），或先用单克隆抗体6B12免疫沉淀，然后再用单克隆抗体A4-IIF5再沉淀（右2道）。E.公司。转染野生型α3（lane a）或突变型α3的细胞（W220A或Y218A）在1%Brij 58中进行细胞表面生物素化和裂解。用抗α3单克隆抗体A3-IIF5免疫沉淀裂解液（左三条通道），或先用单克隆抗体4F2免疫沉淀，然后用单抗A3-IIF再沉淀裂解液。

由于并非所有β1整合素都与CD98构成相关（在无锰的情况下），α链必须有助于调节CD98关联的特异性。值得注意的是，具有截短细胞质尾部的α3和野生型α3与CD98同样相关（图。​（图2D，二维，车道c、d）。因此，与CD98构成关联的特异性可能存在于整合素α链胞外或跨膜结构域中。为了检查CD98是否是α3β1整合素的配体，我们使用转染野生型α3或α3突变体的K562细胞，这些突变体缺乏对α3配体层粘连蛋白5（W220A）和侵袭蛋白（Y218A）的粘附[41]. 所有这些与CD98相关的α3蛋白结构（图。​（图2E）。第二版). 值得注意的是，2 mM EDTA对组成性整合素-CD98相关性没有抑制作用（未显示）。因此，CD98本身似乎不是整合素配体。我们无法证明CD98转染后CHO细胞的粘附功能发生任何变化。然而，过量的内源性仓鼠CD98可能掩盖了转染人CD98的功能效应。

接下来，我们询问CD98的聚集是否会导致β1整合素的选择性聚集。在RD-A3细胞表面，通过与抗CD98单克隆抗体4F2孵育，然后与兔抗鼠抗体孵育来聚集CD98。随后用与Alexa-488直接偶联的抗α3单克隆抗体孵育显示α3β1高度聚集（图。​（图3C），3C公司)，除非省略了CD98的预聚类（图。​（图3A）。3A级). 相反，抗α4-Alexa-488单克隆抗体染色显示出扩散型染色模式，与CD98聚集无关（图。3B、3D). 如果未添加Alexa-488结合抗体，则未观察到染色（未显示）。α3β1和CD98的免疫荧光染色显示，它们在HT1080和RD-A3细胞的细胞表面分布相似，并且部分共定位（未显示）。

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CD98交联诱导的整合素聚集。RD A3细胞在涂有纤维粘连蛋白（20μg/ml）的盖玻片上生长48小时。用20%的山羊血清封闭细胞，在某些情况下用抗CD98单克隆抗体4F2（10μg/ml）培养细胞（C、D）接下来，洗涤细胞，用20%山羊血清封闭，并用兔抗小鼠抗体（5μg/ml）孵育。最后，用2%多聚甲醛固定细胞15分钟，用20%山羊血清封闭，并用抗α3单克隆抗体A3X8 PUJ1（10μg/ml）（A，C）或抗α4单克隆抗体A4-PUJ1（10ug/ml）孵育（B、D）、，每个都与Alexa-488（分子探针）直接耦合。使用ProLong防褪色试剂盒（分子探针）安装盖玻片，并使用配备外荧光光学元件的蔡司Axioscop进行免疫荧光检测。

CD98突变与蔗糖密度梯度定位

CD98重链含有两种细胞外半胱氨酸。每个半胱氨酸都被突变为丝氨酸，并评估其对β1整合素结合的影响。在NIH 3T3细胞中稳定表达的人CD98重链C330S突变体与内源性小鼠β1保持关联，与野生型CD98重链可比。然而，C109S突变体没有检测到β1关联（图。​（图4A，4A级，右侧面板）。小鼠β1（图。​（图4A，4A级，左面板），CD98的突变型和野生型（参见图例）在每个转染剂中以可比较的水平表达。值得注意的是，对于C330S突变体，CD98重链与CD98轻链的关联保持不变，但对于C109S突变体（未显示），这种关联消失了，这与先前发表的结果一致，表明半胱氨酸109是二硫键与轻链连接所必需的[42]. 这些结果表明，CD98轻链可能是CD98整合素结合所必需的。一种可能性是轻链更接近整合素。当合适的抗轻链试剂可用时，可以在共价交联实验中直接测试。在这方面，我们迄今为止无法使用膜透性或膜不透性交联剂（未显示）将CD98重链直接交联到β1整合素。

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CD98整合素结合与CD98重链轻链二聚体的相关性。答：。NIH 3T3细胞（107表达野生型人CD98重链、CD98重链式突变体（C109S或C330S）或对照NIH 3T3细胞在1%Brij 58中裂解，然后使用4F2单克隆抗体免疫沉淀蛋白质。细胞裂解物（左4道）和免疫沉淀物（右4道）在8%SDS-PAGE中溶解，转移到硝化纤维素膜上，用生物素化KMI6 mAb（抗小鼠β1整合素）进行探测，然后用ExtrAvidin-HRP（Sigma）孵育，并使用Renaissance Chemillumination试剂（NEN Life Science Products，Boston，MA）进行开发。B。HT1080电池（107细胞/实验）在pH为11的碳酸钠缓冲液中进行裂解，并在材料和方法中描述的等密度不连续蔗糖梯度中进行分馏。通过SDS-PAGE电泳分析组分，然后使用生物素化TS2/16 mAb或多克隆抗小窝蛋白抗体进行Western blot分析，或者调节pH值至7.5，用4F2 mAb免疫沉淀，然后用生物素化的TS2/16 m Ab进行印迹。C、。NIH 3T3细胞（107表达野生型人类CD98重链或突变型CD98重链子（C109S或C330S）的细胞在细胞表面生物素化，在碳酸钠缓冲液中溶解，pH值为11，并在蔗糖梯度中分馏，如材料和方法所述。将组分调节至pH 7.5，并使用4F2单克隆抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀蛋白在非还原条件下在8%SDS-PAGE中分离，并印在硝酸纤维素膜上。使用ExtrAvidin-HRP（Sigma）和Renaissance化学发光试剂（NEN Life Science Products，马萨诸塞州波士顿）开发印迹。对于NIH3T3细胞，使用流式细胞术证明野生型CD98（MFI=27）、C109S（MFI=30）和C330S（MFI=53）表达的可比水平。细胞100%阳性，具有均匀的峰，远高于背景染色（MFI=1）。MFI=平均荧光强度。D。图所示的Western blot中CD98野生型和C109S及C330S突变体在轻组分（组分3-6）和致密组分（第9-12组分）中的相对分布。​图4C。4摄氏度使用GeneGenius生物成像系统和分析软件（Syngene，Frederick，MD）进行密度测定。显示了三个典型实验中的一个。

另一种可能性是，CD98轻链可以将CD98异二聚体靶向特定的膜结构域，在该结构域中可以定位与β1整合素的相互作用。为了验证后一假设，我们比较了HT 1080细胞上β1整合素总分布与β1整合素与CD98复合部分的分布（图。​（图4B）。4B类). 虽然β1整合素主要存在于蔗糖梯度上的致密膜组分中，但与CD98复合的β1整合素亚群局限于“轻”膜组分。这些组分通常含有小窝和“膜筏”，被认为富含活性信号复合物[34,35,43]. 轻膜组分中检测到的β1整合素组分不超过总β1整合素的5%（基于密度分析，未显示）。尽管小窝蛋白与CD98整合素复合物存在于相同的组分中，但在这些条件下（未显示），它不会与CD98共同免疫沉淀，因此不是整合素-CD98复合物的一部分。类似地，在轻膜组分中可以发现大量GPI-连接蛋白（如CD109）、TM4SF蛋白（如CD81）和其他跨膜蛋白（例如CD147/EMMPRIN）[44,45]和我们未发表的结果），并且这些也没有与CD98共同免疫沉淀（图。2A、2B). 因此，CD98与整合素的结合除了在轻膜组分中简单地共存外，还有另一种特异性。

最后，为了观察CD98轻链是否有助于将CD98重链靶向轻膜组分，我们观察了野生型CD98和CD98突变体在蔗糖梯度中的分布（图。4C、D). 大多数野生型CD98重链和对照突变体（C330S）定位于轻膜部分（55-60%，图。​图4D），4D（四维）)而C109S突变体部分转移到致密组分（轻组分为40%，致密组分为50%，图。​图4D）。4D（四维）). 这些结果与针对CD98重链到轻膜部分的CD98轻链一致。观察到约40%的C109S重链突变体残留在轻膜部分中，这可能并不奇怪（图。4C、D)考虑到CD98异二聚体即使在亚单位没有二硫键的情况下也保留了部分结合和氨基酸转运功能[42]. 值得注意的是，CD98重链的过度表达导致BALB 3T3细胞的转化需要与轻链结合，C109的错义突变消除了其转化活性[10].

CD98蛋白最近被证明与整合素β链细胞质尾部融合蛋白特异相关[29]在0.05%Triton X-100清洁剂条件下。可以推测，使用0.05%Triton X-100可能可以维持β1相互作用所需的CD98微域。在这方面，在0.05%Triton X-100裂解液中，许多跨膜蛋白保留在蔗糖梯度的轻膜部分中[46,47]. 虽然CD98轻链的作用在早期的研究中没有提到[29]，我们认为它可能发挥了关键作用。此外，在缺乏α链的情况下，CD98与重组β链细胞质尾部融合蛋白的相互作用[29]，与我们的观察一致，α链细胞质尾部不需要与整合素CD98结合。另一方面，我们观察到CD98与几个β1整合素相互作用，但与α4β1没有相互作用。因此，对于哺乳动物细胞中完整的整合素，整合素β链显然有助于CD98相互作用的特异性。α链可能通过改变β链的构象和/或提供与CD98轻链或重链相互作用的额外位点来提供一定程度的特异性。

因为我们的整合素CD98复合物是在轻质膜组分中观察到的，而不是在致密蔗糖梯度组分中，并且因为我们无法通过共价交联（未显示）捕获该复合物，所以相互作用可能不是直接的。尽管如此，大量证据表明了这种复合体的功能相关性（以上参考文献）。此外，整合素αVβ3-CD47复合物具有相当大的功能相关性，尽管它仅在相对温和的洗涤剂条件下（例如Brij 58）被发现，并且只存在于蔗糖梯度的轻膜部分中[48,49].

结论

总之，我们显示了完整的β1整合素和CD98之间的高度特异性的生物化学联系，如相互免疫共沉淀和共聚类实验所证明的。此外，CD98与β1整合素的结合似乎发生在有序的脂质微结构域中（如蔗糖密度梯度的轻膜组分中的共定位所证明的那样），并且似乎需要CD98的轻链。这些结果可能有助于解释最近的报道，即CD98可能调节整合素配体结合、粘附、信号传递、T细胞协同刺激和细胞融合功能。

材料和方法

抗体、细胞系、cDNA

本研究中使用的单克隆抗体为：4F2，抗CD98重链[39]，A2-2E10，抗α2整合素[32]; A3-IIF5，抗α3整合素[50]; A5-PUJ2，抗α5整合素[51]; B5G10，抗α4整合素[52]; A4-PUJ1，抗α4整合素[51]; A6-BB，抗α6整合素[32]; TS2/16，抗β1整合素；W6/32，抗HLA I类[53]; C7，抗低密度脂蛋白受体[54]; 5E9，抗CD71[55]; IIIC4，抗CD 109[32]; 8G6，抗CD147/EMMPRIN[31]; 和KMI6，抗小鼠β1整合素（Pharmingen，加州圣地亚哥）。单克隆抗体P3[56]在所有免疫沉淀和流式细胞术实验中用作阴性对照。

本研究中使用的人类细胞系为纤维肉瘤细胞系HT1080；稳定转染人α3整合素（RD A3）的横纹肌肉瘤细胞株RD；淋巴母细胞T细胞系Molt4、人乳腺上皮细胞系MTSV1-7；红白血病K562细胞和φnx-Eco包装细胞。表达整合素α4、α3或α3整合素亚基的K562细胞缺乏细胞质尾部（K562-X3C0）在别处描述[30,40]. 还使用了表达α3 D154A、W220A和Y218A突变体的K562细胞[41]和表达人α2、α3、α5或β1整合素亚单位的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞[30,32]. 编码人CD98重链的cDNA[57]由Jeffrey Leiden（芝加哥大学）在pUC18载体中提供。采用重组PCR技术制备CD98重链突变体（C109S和C330S）[58]使用以下引物：C109Ss–5'-CGAGCGCCGTTCTCGAGCTACGCGCG-3'；C109Sas-5'-CGCCGGTAGCTCGCGTCGCGAGAACGCGGCGCCTCG-3’；C330Ss–5’-GGCAATCGCTGGTCCAGCTTGGAGTGTCTCAGGC-3’；C330Sas–5'-GCCTGAGACACCCAGCTGCAGACCCAGCGACGATGCCC-3'。将CD98重链结构亚克隆到pLXIZ逆转录病毒载体（Clontech）中。瞬时转染φnx-Eco细胞并逆转录病毒感染NIH 3T3细胞[59]. 在含有1mg/ml zeocin的生长培养基中选择稳定的NIH 3T3感染者。

免疫沉淀实验

对于免疫沉淀，用裂解缓冲液（1%的指定洗涤剂，20mM Hepes，pH 7.4，150mM NaCl，2mM PMSF，10μg/ml亮蛋白肽，10μg/ml抑肽酶，2mM MgCl2，0.5mM CaCl2）在4°C下提取标记的细胞蛋白60分钟。用蛋白A-sepharose 4CL预孵育后，将细胞提取物与与sepharose4B直接偶联的特异性单克隆抗体孵育60 min，用适当的裂解缓冲液洗涤3次，并用Laemmli样品缓冲液洗脱。在一些实验中，向细胞（裂解前10分钟）和裂解缓冲液中添加氯化锰（2 mM）。

对于再免疫沉淀实验，在PBS中的1%Triton X100中从免疫复合物中洗脱相关蛋白，然后与蛋白A-琼脂糖-4CL预孵育。然后使用mAb在4°C下直接与sepharose 4B珠结合30分钟，从洗脱液中重新沉淀剩余蛋白质，用1%Triton X100在PBS中洗涤三次，用Laemmli样品缓冲液洗脱，并在SDS-PAGE上进行解析。

轻质膜组分的无洗涤剂净化

蔗糖梯度中的等密度分馏基本上如所述进行[43]. 简单地说，细胞（一个表达不同CD98结构的HT1080或NIH 3T3细胞的汇合T162烧瓶）在2 ml 500 mM碳酸钠缓冲液（pH 11）中在蛋白酶抑制剂的存在下溶解，并通过25号针5次，然后通过27号针6次。通过在MBS（25 mM MES，pH6.5，150 mM NaCl）中添加1 ml 90%蔗糖，将匀浆（1 ml）调整为45%蔗糖，并放置在超离心管的底部。在上面形成5–35%的不连续蔗糖梯度（1 ml 5%蔗糖：2 ml 35%蔗糖，均在含有250 mM碳酸钠的MBS中），并在SW 55 Ti转子中以45 000 rpm离心16–18小时（加州帕洛阿尔托贝克曼仪器公司）。从每个梯度的顶部收集0.4 ml组分，并通过SDS-PAGE电泳进行分析，或调节至pH 7.5（使用HCl）并用于免疫沉淀实验。

致谢

我们感谢Jeffrey Leiden博士提供的CD98 cDNA。这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）CA42368（M.E.H.）和CA71740-02（B.A.M.）资助，白血病和淋巴瘤学会博士后奖学金（T.V.K.）和塔塔夫人博士后奖（F.B.）的支持

工具书类

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