AP-4缺乏综合征小鼠模型神经元中ATG9A分布和轴突聚集物的改变

AP-4εKO小鼠的运动和行为缺陷

杂合AP-4εKO小鼠的交配产生了预期孟德尔比率的后代。纯合子KO小鼠没有表现出任何显性表型，具有正常的寿命，并且可以生育。大体解剖、主要器官重量和血液学参数也没有显著改变。然而，我们注意到AP-4εKO小鼠在被尾巴抓住时表现出反常的紧抱后肢表型(图1D和1E). 这种表型是各种脑和脊髓疾病的常见表现[20]这促使我们进一步详细研究这些小鼠的运动和行为功能。

使用旋转试验评估运动协调性和平衡性，该试验测量小鼠从加速旋转的圆柱体上跌落的速度（5分钟内从每分钟4到40转（RPM））。我们观察到AP-4εKO小鼠的跌倒速度低于WT小鼠（KO:15.7±1.0 RPM，n=19；WT:26.9±1.0 RPM，n=22；t（39）=7.335，P<0.0005）(图1F). 我们还发现AP-4εKO小鼠相对于WT小鼠在45°角网格上的握力降低（KO:0.84±0.03 N，N=25；WT:1.27±0.05 N，N:27；t（50）=8.004，P<0.0005）(图1G). 其他试验表明，与WT小鼠相比，AP-4εKO小鼠在旷野试验中不适应新的环境（F（1,22）=4.43，P=0.047），这表现在30分钟试验中行驶距离没有逐渐减少，以及AP-4εKO小鼠相对于WT小鼠的较长行程（KO:72.1±4.6 m，n=12；WT:60.2±3.3 m，n/12；t（22）=2.105，P=0.047）(图1H). 在AP-4εKO小鼠中观察到的运动活动增加可能与焦虑或冒险行为的改变无关，因为WT和AP-4ε的KO小鼠探索高架正迷宫开放臂的时间百分比相似（KO:8.5±1.5%，n=8；WT:9.3±1.7%，n=9；P>0.05，我.e（电子）.，不显著）(S1A图). AP-4εKO小鼠对≥105 dB的大声声刺激也表现出增强的惊吓运动感觉反应（KO:n=22；WT n=22，F（1504）=61.32，P<0.0005）(图1I). 与上述表型相比，我们无法检测到WT和AP-4εKO小鼠在Barnes中与工作、学习和空间记忆相关的任务上的差异(S1B图)和T迷宫测试(S1C图). 总之，我们的发现表明AP-4εKO小鼠表现出一系列运动和行为异常，这些异常至少与AP-4缺陷患者的一些临床特征相一致[6,7,8,9,10,11,12].

AP-4εKO小鼠胼胝体和小脑球体的薄化

脑MRI显示AP-4εKO小鼠胼胝体比WT小鼠薄(图2A、箭头和绿色高亮显示）。在这种分辨率水平下，AP-4εKO小鼠的其他大脑结构似乎正常(图2A). 大脑切片的苏木精和伊红（H&E）染色也显示，与WT小鼠相比，KO小鼠胼胝体的厚度减少(图2B). 相反，KO小鼠的大脑皮层厚度没有改变(S2图). H&E染色还显示，AP-4εKO小鼠小脑深核（DCN）的神经膜中存在直径高达20μm的强染色和弱染色球状体，但WT小鼠没有(图2C和2D). 其他脑区或其他器官切片的H&E染色未显示AP-4εKO和WT小鼠之间的任何明显差异。事实上，AP-4εKO小鼠有一个薄薄的胼胝体样AP-4缺陷患者，这进一步支持了该小鼠模型与人类疾病的对应性[6,7,8,9,10,11,12].

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图2

AP-4εKO小鼠脑内薄胼胝体和轴突球体。

（A） MRI显示，一只9个月大的KO相对于一只年龄匹配的WT小鼠的大脑胼胝体较薄（箭头和绿色亮点）。结果代表每组三只小鼠。（B） H&E染色的冠状脑切片显示，与年龄匹配的WT小鼠相比，9个月大的KO小鼠胼胝体较薄约55%。棒材：500μm。显示了可比切片中胼胝体的厚度。结果代表每组两只小鼠。9个月大小鼠大脑冠状切片的（C，D）H&E染色显示，在KO小鼠的小脑深核（DCN）中出现弱染色和强染色的球体（箭头），但在WT小鼠中没有。编号的面板是装箱区域的四倍放大。棒材：20μm。（E，F）小脑切片中钙结合蛋白（绿色）的免疫组织化学染色显示，在KO小鼠而非WT小鼠的DCN（F）中，浦肯野神经元（E）的近端轴突中有罕见的轴突球状体，浦肯野神经元（F）的远端轴突中有大量球状体。球体用箭头表示。棒材：50μm。（G） 小脑切片calbindin（绿色）和LAMP1（红色）的免疫组织化学联合染色显示，KO小鼠DCN中的Purkinje细胞球体对LAMP1呈阴性。棒材：50μm。（H） 中脑白质束切片中神经丝蛋白NFH（绿色）和LAMP1（红色）的免疫组织化学联合染色显示KO小鼠中含有这两种蛋白（箭头）的球体。棒材：50μm。在G和H中，单通道图像以倒置灰度显示。在E-H中，用DAPI（蓝色）染色细胞核。

AP-4εKO小鼠脑内广泛轴突肿胀

为了寻找AP-4εKO相对于WT小鼠大脑中更特异的异常，我们对大脑切片进行了免疫染色。用Purkinje神经元标记物calbindin的抗体染色显示，相对于WT小鼠，AP-4εKO中Purkinje神经元的数量和外观正常(图2E,S3图). 然而，AP-4εKO小鼠Purkinje神经元的近端轴突区偶尔观察到钙结合蛋白阳性球体，但WT小鼠没有观察到(图2E，箭头）。在投射到AP-4εKO小鼠DCN的Purkinje神经元的远端轴突中，钙结合蛋白阳性球体数量更多(图2F，箭头）。这些球体可能与上述H&E染色的球体相对应(图2D). 含有溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）的溶酶体中未富集DCN球体(图2G，箭头）。AP-4εKO小鼠中脑白质束也显示为球形，但LAMP1和轴突非磷酸化神经丝H（NFH）蛋白的共同染色(图2H). 在AP-4εKO小鼠的海马和脊髓切片中还发现LAMP1阳性的大轴突肿胀（直径达15μm）(S4A图). AP-4εKO小鼠培养海马神经元的相控成像也可以观察到沿着轴突的大量肿胀(S4B和S4C图). DCN塑料包埋切片的透射电镜显示，WT小鼠Purkinje神经元的有髓轴突外观正常，AP-4εKO小鼠的有髓肿胀异常增大，包括紧密包裹的膜池和细胞器增殖，线粒体和自噬体出现(S4D图). 因此，这些分析表明，AP-4εKO导致不同神经元类型和中枢神经系统（CNS）不同区域的轴突肿胀。其中一些肿胀含有溶酶体，而另一些则没有，这表明它们在性质上是异质的。上述薄胼胝体(图2A和2B)以及广泛存在的神经轴突营养不良(图2C-2H,S4图)可能是AP-4εKO小鼠运动和行为缺陷的原因。

AP-4εKO小鼠浦肯野神经元谷氨酸受体的分布

研究AP-4εKO小鼠的神经表型是否可能是由于谷氨酸受体的体脂蛋白极性丢失所致，如之前报道的AP-4β4 KO小鼠[18]，我们检测了内源性δ2R（也称为GluD2或GRID2）、AMPAR亚基GluA2（也称为GluR2或GRIA2）和GluA1（也称为GluR1或GRIA1）在小脑浦肯野神经元中的定位(图3A–3C;S5图). 这些神经元非常适合树突-松质极性的可视化就地因为所有树突都朝向分子层（Mo），所有轴突都朝向小脑皮层的颗粒层（Gr）(图3A–3C). 如上所述，小脑切片免疫组织化学显示大量钙结合蛋白阳性球体，表明AP-4εKO小鼠DCN浦肯野轴突远端肿胀(图3A–3C，箭头）。δ2R免疫染色显示，在WT和AP-4εKO小鼠中，受体主要集中在Purkinje神经元的胞体和树突状区(图3A). 然而，在AP-4εKO小鼠钙结合蛋白阳性的DCN球体中也可以观察到δ2R染色，但在WT小鼠中没有观察到(图3A，箭头）。GluA2的免疫染色太弱，无法确定浦肯野神经元中AMPAR亚单位的极性，尽管我们可以在AP-4εKO而非WT小鼠的钙结合蛋白阳性DCN球体中观察到该亚单位的存在(图3B，箭头）。GluA1的类似分析(图3C)或不进行抗原检索(S5图)使用两种不同的抗体(S5图)结果表明，该AMPAR亚单位在WT和AP-4εKO小鼠的Purkinje神经元的体脂蛋白结构域中极化，在钙结合蛋白阳性的DCN球体中完全缺失。DCN中唯一可见的GluA1染色与小脑这一区域一些神经元的胞体和树突相对应(图3C;S5图). 内源性GluA1和绿色荧光蛋白（GFP）标记的转基因GluA1在DIV10中的定位分析原代培养的海马神经元显示，该AMPAR亚单位也主要局限于体脂蛋白结构域，在WT和AP-4εKO神经元的轴突肿胀中未检测到(S6图). 因此，我们的实验表明，AP-4εKO小鼠的轴突球体含有定位错误的δ2R和GluA2，但不含GluA1。

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图3

WT和AP-4εKO小鼠小脑浦肯野神经元中谷氨酸受体的分布。

（A-C）用钙结合蛋白（红色）和δ2R（Frontier Institute co.，ltd的AB_2571601）（A）、GluA2（Sigma的SAB4501295）（B）或GluA1（Millipore的AB1504）（C）抗体对WT和AP-4εKO小鼠的小脑切片进行联合免疫染色。在用胃蛋白酶处理的切片上进行δ2R染色，在用柠檬酸钠缓冲液处理的85°C切片上进行GluA1染色，用于抗原检索。使用未经高温硝酸钠缓冲液处理的样品也获得了类似的结果(S5C和S5D图)并使用不同的GluA1抗体（来自Abcam的抗体ab31232）(S5A和S5B图). Mo：分子层；Gr：颗粒层，Pc：浦肯野细胞层，DCN：小脑深核。使用DAPI（蓝色）对细胞核进行染色。棒材：50μm。球体的示例用箭头表示。单通道图像以反转灰度显示。注意AP-4εKO DCN中钙结合蛋白阳性球体中δ2R和GluA2的存在，以及GluA1的缺失。

ATG9A在AP-4μ4突变患者成纤维细胞和AP-4εKO小鼠神经元中的分布改变

接下来，我们考虑了AP-4缺乏不仅导致谷氨酸受体定位改变，而且导致自噬机制本身改变的可能性。在这方面，我们最近报道了AP-4缺陷的非神经元人类细胞系和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中TGN自噬蛋白ATG9A的输出缺陷[19]. 为了评估这些发现与AP-4缺乏综合征患者的相关性，我们检测了一名对照个体和两名纯合子失活突变患者皮肤成纤维细胞中ATG9A的分布AP4M1型AP-4μ4亚单位编码基因[7] (图4). 因为我们没有合适的AP-4μ4抗体，所以无法通过免疫印迹法检测该亚单位的表达。然而，AP-4ε的免疫印迹显示患者成纤维细胞中该亚单位的水平降低(图4A)与之前报道的AP复合体未组装亚基在一个亚基突变或缺失时的降解一致[21]. 此外，在患者的成纤维细胞中未检测到TGN处AP-4ε的免疫荧光染色(图4B). 免疫印迹分析也显示ATG9A水平显著增加(图4A). 与AP-4ε或高尔基基质蛋白130（GM130）相比，ATG9A的免疫染色显示，对照组成纤维细胞在TGN处显示ATG9A染色，并且点状分布在细胞质中，而μ4突变的成纤维细胞则在TGN上显示更亮的染色，并从外周细胞质中消失(图4B–4D). 更大范围的细胞显示了这种表型的普遍性S7图.

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图4

AP-4μ4突变患者成纤维细胞TGN处ATG9A的积累。

（A） 来自一名对照个体和两名患者的皮肤成纤维细胞的基因突变纯合子AP4M1系列编码AP-4μ4的基因[7]通过SDS-PAGE和免疫印迹分析AP-4、ATG9A和α-微管蛋白的ε亚基（负荷控制）。分子质量标记的位置（单位：kDa）显示在左侧。（B，C）对A中提到的成纤维细胞内源性ATG9A（绿色）和AP-4ε（红色）（B）或GM130（红色）。DAPI（蓝色）染色细胞核。（D） 使用ImageJ和Radial Profile插件量化对照组（n=9）、患者1（n=7）和患者2（n=8）成纤维细胞中ATG9A相对于细胞核的分布。数值为各组荧光强度相对于总细胞强度的平均值±SEM。注意TGN处ATG9A的浓度及其在患者成纤维细胞外周细胞质中的耗竭。

在原代培养的DIV9 WT小鼠海马神经元中，ATG9A也定位于细胞体中的TGN和散布在细胞质中的许多病灶，包括树突和轴突(图5A). 相反，在AP-4εKO神经元中，ATG9A仅在TGN处发现，并从外周位置耗尽(图5A). 溶酶体标记LAMP1-GFP在树突和轴突的非极化分布[22]突触囊泡标记RAB3A-GFP的轴突极性[23]相对于WT神经元，AP-4εKO没有改变(S8A图)表明AP-4的缺失并没有阻止细胞器运输到轴突和树突，也没有导致极化分选的普遍缺陷。用编码HA-标记ε（HA-ε）的质粒拯救KO神经元可降低TGN处ATG9A的浓度并恢复其外周分布(图5B).

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图5

AP-4εKO小鼠神经元中TGN处ATG9A的积累。

（A） WT和KO小鼠海马神经元对ATG9A（绿色）和GM130（红色）的共免疫。单通道图像以倒灰度显示。神经元的轮廓用虚线表示。最右边一列的图像是合并图像中神经元胞体的3倍放大视图。棒材：10μm。（B） 通过将编码HA标记ε和PM-RFP的质粒转染KO小鼠海马神经元，挽救内源性ATG9A的正常分布。对神经元进行内源性ATG9A（绿色）和GM130（白色）染色，并对HA表位（蓝色）进行染色。右侧的六个面板是左侧方框区域1和2的单通道倒置灰度放大视图。棒材：20μm。注意AP-4εKO神经元TGN处ATG9A的浓度和伴随的外周耗竭，以及HA-ε-挽救神经元中这一表型的逆转。

大脑皮层、小脑皮层、海马和脊髓切片的免疫染色(图6)WT小鼠神经元中ATG9A的胞质分散染色和AP-4εKO小鼠神经元TGN的较亮染色。这些切片的染色差异如此显著，以至于很难在WT样品中观察到ATG9A染色，但在KO样品中很容易看到(图6). 从这些实验中，我们得出结论，与非神经元细胞一样(图4B-4D) [19]，AP-4是从神经元TGN中导出ATG9A所必需的。

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图6

AP-4εKO小鼠不同脑区TGN处ATG9A的积累。

使用内源性ATG9A抗体（绿色）对WT和AP-4εKO小鼠的大脑皮层、小脑皮层、海马和脊髓切片进行免疫染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。第二列和第四列上的图像分别是第一列和第三列上方框区域的放大倍数。条形图：50μm（缩小视图）和10μm（放大）。注意AP-4εKO小鼠神经元TGN处的ATG9A染色较亮。

AP-4εKO小鼠大脑不同区域ATG9A水平升高，但LC3B水平未升高

除了ATG9A重新分配到TGN外，对大脑不同区域的免疫印迹分析表明，相对于WT小鼠，AP-4εKO的大脑皮层、小脑和海马中的ATG9A水平显著增加(图7A和7B). 脑和脊髓切片中TGN处ATG9A的重分布和较高表达水平可能导致其染色更亮(图6). 另一种自噬蛋白，自噬相关蛋白5（ATG5）的水平在KO小鼠中似乎略有增加，如图所示图7A，但对几个实验的分析表明，这些差异在统计学上并不显著(图7C). 在AP-4εKO的所有脑区，其他自噬蛋白如LC3B、γ-氨基丁酸受体相关蛋白（GABARAP）和自噬相关蛋白7（ATG7）的水平没有变化与.WT小鼠(图7A). KO小鼠和患者细胞中ATG9A水平的增加(图4A)，可能反映了一种机制，以补偿无法从TGN动员ATG9A。

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图7

AP-4εKO小鼠大脑和神经元中ATG9A水平增加，其他自噬蛋白水平正常。

（A） 用SDS-PAGE和免疫印迹法分析WT和AP-4εKO小鼠的嗅球（OB）、大脑皮层、小脑（Cerebell）、海马（Hippo）、中脑和脑干的匀浆，并用右侧所示的蛋白抗体进行免疫印迹。指示了LC3B的I型和II型的位置。分子质量标记的位置（单位：kDa）显示在左侧。（B） 根据实验定量ATG9A水平，如A所示。数值为四次测定的平均值±SEM*P<0.05，**P<0.005。注意AP-4εKO某些脑区ATG9A水平增加与.WT小鼠。（C） 根据实验定量ATG5水平，如A所示。数值为四次测定的平均值±SEM。注意，AP-4εKO中ATG5水平没有显著变化与.WT小鼠。（D） 将WT和AP-4εKO小鼠原代培养的皮层神经元在没有（n.t.）或存在100 nM巴非霉素A1（Baf）的情况下孵育5 h。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析总蛋白提取物的LC3B、SQSTM1和β-微管蛋白。指示了LC3B的I型和II型的位置。分子质量标记的位置（单位：kDa）显示在左侧。（E-G）根据实验（如D中的实验）定量LC3B-II与LC3B-I的比值（E）、总LC3B（F）和总SQSTM1（G）。值是三次测定的平均值±SD*P<0.05。注意，与巴非霉素孵育后，WT和AP-4εKO皮层神经元中的SQSTM1显著增加。还要注意，AP-4εKO不影响LC3B处理和自噬通量。

自噬激活后，LC3B从细胞溶质LC3B-I型转化为与发育中的自噬体膜相关的脂质LC3B-II型[24]. 我们观察到LC3B-I是LC3B的主要形式，并且LC3B-II与LC3B-I的比率在大脑的不同区域相似(图7A)以及WT和AP-4εKO小鼠的皮层神经元（7D，E）。这与KO动物的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）形成对比，其中LC3B-II与LC3B-I的比率相对于WT-MEF降低[19]. 此外，在WT和AP-4εKO小鼠的皮层神经元中，LC3B和自噬货物受体螯合体1（SQSTM1）（也称为p62）的总水平没有显著差异，与V-ATP酶抑制剂巴非霉素A1孵育导致自噬流量指标SQSTM1的水平类似增加(图7D、7F和7G). 这些观察结果表明，在基本培养条件下，ATG9A在AP-4εKO神经元中的分布变化对LC3B-I向LC3B-II的转化以及LC3B-III和SQSTM1在自溶体中的降解几乎没有影响[24,25]. 在基础条件下，这种明显的自噬缺陷的缺失可能是由于AP-4εKO细胞和组织中ATG9A水平的代偿性增加（图​（图4A，4A级,7A和7B) [19].

AP-4εKO小鼠是AP-4缺乏综合征的合适动物模型

先前的研究表明，AP-4β4 KO小鼠在旋转试验中表现不佳，但没有报告任何其他运动或行为异常[18]. 在这里，我们发现AP-4εKO小鼠表现出额外的神经缺陷，包括后肢紧抱、握力降低、行走增加和声惊吓反应增强。AP-4εKO小鼠的一些神经表型与AP-4缺乏综合征患者的运动障碍相一致[6,7,8,9,10,11,12]. 然而，目前尚不清楚在AP-4εKO小鼠中观察到的行走增加和惊吓反应是否与AP-4缺陷患者相关。我们无法检测到AP-4εKO小鼠的学习和记忆缺陷，而人类AP-4缺陷的特征是智力残疾。这种差异可能表明突变小鼠缺乏认知缺陷，或者小鼠的基本学习和记忆测试对患者的智力残疾类型不够敏感或特异。因此，AP-4εKO小鼠似乎是一种合适的动物模型，用于研究AP-4缺乏患者运动功能障碍的发病机制，并测试潜在治疗方法的有效性。

AP-4εKO小鼠胼胝体和神经轴突营养不良

MRI和组织病理学分析显示AP-4εKO小鼠的另一个特征与AP-4缺陷患者的特征相匹配：胼胝体较薄。胼胝体是连接两个大脑半球的一大片有髓轴突，集运动、感觉和认知功能于一体[32]. 在其他形式的热休克蛋白中也发现了薄胼胝体，包括SPG1、SPG7、SPG11、SPG18、SPG21、SPG32、SPG45、SPG46、SPG47、SPG48、SPG49、SPG52、SPG54、SPG56、SPG63、SPG65和SPG71[1,三]. 包括AP-4在内的所有这些疾病中都有缺陷的蛋白质可能需要与胶质细胞一起构成胼胝体的轴突的生长、引导或维持。

除了薄薄的胼胝体外，AP-4εKO小鼠还表现出类似于AP-4β4 KO小鼠的轴突球体或肿胀[18]. AP-4εKO小鼠的轴突球体广泛存在于中枢神经系统，包括小脑、海马、中脑和脊髓。除了LAMP1（一种通常定位于晚期内体、溶酶体和自体溶酶体的蛋白质）的可变存在外，我们没有进一步描述这些球体的组成。此外，DCN球体含有谷氨酸受体蛋白δ2R和GluA2的积累。然而，AP-4εKO小鼠的轴突球体与其他HSP人类或小鼠模型（包括SPG2）中观察到的类似[33]，SPG4[34]，SPG7[35]，SPG10[36]，SPG11[37]，SPG35[38]和SPG79[39]. 因此，AP-4缺陷与HSPs的一个子集具有薄胼胝体和广泛神经轴突营养不良的表型，表明相应的蛋白质都是轴突正常发育和功能所必需的。

AP-4缺陷小鼠和人类中ATG9A定位错误和自噬缺陷

虽然在AP-4εKO小鼠的钙结合蛋白阳性DCN球体中存在δ2R和GluA2，但GluA1仍然极化到Purkinje神经元的体脂蛋白结构域，并且在AP-4κKO鼠的钙结合素阳性DCN球形中没有积累。在染色前，使用两种不同的抗体和两种不同的小脑切片处理方案观察到GluA1的这种正态分布。此外，内源性和转基因GluA1在培养的AP-4εKO小鼠海马神经元中均表现出体脂蛋白极性，且无轴突肿胀。综上所述，这些发现支持了这样的观点，即一些谷氨酸受体蛋白在AP-4εKO小鼠的轴突球体中积累，正如之前报道的AP-4β4 KO小鼠那样[18]. 然而，他们也指出了AP-4缺乏对具有不同亚基组成的AMPAR受体运输的不同影响。然而，我们不能排除GluA1和GluA2在AP-4εKO小鼠中分布的差异是由于我们研究中使用的抗体识别不同群体的AMPAR所致。

接下来，我们考虑了谷氨酸受体在轴突球体中的积累可能是AP-4缺乏对自噬的更直接影响的结果。我们将注意力集中在ATG9A上，这是一种最近在非神经元细胞中表现为AP-4载体的蛋白质[19]. 事实上，我们发现内源性ATG9A从外周细胞质中耗尽，并高度集中于AP-4μ4突变患者皮肤成纤维细胞中的TGN，这是第一例内源性AP-4货物在患者细胞中被错误编码。在AP-4εKO小鼠的海马、大脑皮层、小脑和脊髓的神经元中也观察到类似的变化。通过患者成纤维细胞和KO小鼠大脑各部分ATG9A水平的升高，使TGN处ATG9A的浓度更加明显。ATG9A的上调可能是一种生理机制的一部分，以补偿ATG9A在突变小鼠中的定位错误，确保有足够的ATG9B逃逸TGN的滞留，从而缓解自噬缺陷。

ATG9A的功能是传递脂质或膜，在细胞质内形成自噬体[40]. 然而，我们没有检测到AP-4εKO脑内内源性LC3B-I/II和其他自噬蛋白水平的明显变化与.WT小鼠。这与非神经元细胞相反，在非神经元细胞中，LC3B-I向LC3B-II的转化受到损害[19]. 这种细胞类型特异性行为与之前的研究一致，这些研究表明神经元自噬的调节和功能与其他细胞相比存在差异[26,27]. 神经元自噬的一个重要功能是降解异常蛋白质和细胞器[41,42]. 根据这一功能，我们发现AP-4εKO海马神经元轴突中亨廷顿蛋白突变聚集体的积累增加。因此，AP-4缺陷的神经元清除轴突聚集蛋白的能力受损，这是神经元变性的常见原因[43]. 这种表型被ATG9A-mCherry的过度表达所逆转，这与聚集清除受损是由于ATG9A-mCherri到达自噬体形成位点的数量不足的观点一致。此外，我们观察到AP-4εKO中远端轴突中的LC3B-GFP结构相对于WT海马神经元的活动性较小。因为运动性与自噬体的成熟有关[31]，AP-4依赖性地向轴突传递ATG9A可能对轴突自噬体的成熟至关重要。因此，自噬体成熟和聚集清除缺陷可能导致AP-4εKO小鼠中观察到的神经轴突营养不良，并导致人类AP-4缺陷的神经症状。

表型与其他自噬障碍重叠

AP-4缺陷小鼠和人类的表型与自噬机制成分突变引起的其他疾病的表型重叠。特别相关的是，具有ATG9A脑特异性KO的小鼠在DCN中表现出较差的扭转性能、胼胝体发育不全和钙结合蛋白阳性球体[44]类似于此处描述的AP-4εKO小鼠。这些观察结果支持AP-4与ATG9A的功能联系。然而，ATG9A KO比AP-4ε或β4 KO更有害，因为ATG9A-KO在胚胎期或围产期死亡，这取决于小鼠菌株以及KO是一般性的还是CNS特异性的[44,45,46]. 因此，完全缺乏ATG9A的结果比其在TGN中的滞留更糟糕。这可能是因为AP-4εKO神经元中ATG9A水平的代偿性增加允许一些ATG9A到达自噬前结构，从而在没有AP-4的情况下保持一定水平的自噬。

其他自噬蛋白的突变也会导致在AP-4缺乏的人类和小鼠中观察到的一些缺陷。例如，SPG49是另一种复杂的痉挛性截瘫，由TECPR2公司编码LC3B相互作用蛋白的基因[47]. SPG49患者还表现出胼胝体薄和神经轴索营养不良[47]. 同样，Vici综合征患者，一种由自噬体-溶酶体系留蛋白EPG5突变引起的多系统疾病[48,49,50]，有胼胝体发育不全、发育迟缓、小头畸形和癫痫发作[51]. EPG5 KO小鼠也出现皮质脊髓束变性[52]. 最后，编码自噬蛋白ATG5的基因KO[41]，第7页[42]、RB1CC1 29]或WDR45[53]在小鼠中都会引起运动和行为异常、轴突肿胀、神经元包涵体积聚和轴突变性。这些观察结果突出了AP-4缺乏症和原发性自噬障碍之间的共同特征，提示了相关的发病机制，并支持将AP-4缺乏综合征作为一种先天性自噬障碍的另一种分类[54].

老鼠

C57BL/6J型4月1日^{tm1b（KOMP）Wtsi公司}小鼠（在图1A)，按照参考[61]，从加州大学戴维斯分校KOMP库中获得(https://www.komp.org/). 这些小鼠携带了AP4E1接口基因。将tm1b小鼠培育成来自Jackson实验室的定点Flp缺失菌株（B6.Cg-Tg（Pgk1-flpo）10Sykr/J，Stock 011065/flpo-10），以去除LacZ和新霉素报告盒(图1A). WT小鼠对应物从杰克逊实验室获得（C57BL/6J，库存000664/Black 6）。通过繁殖杂合小鼠获得纯合AP-4ε-/-突变（KO）、杂合AP-4λ+/-突变和纯合AP-4ε+/+（WT）小鼠。大多数实验都使用了利特曼盐。将小鼠分为每组，每组不超过4只，并提供食物和水随意在12小时的光-暗循环下（6:00开，18:00关）。断奶后不久，使用KAPA Biosystems的小鼠基因分型试剂盒从耳剪中分离出基因组DNA。使用外显子3侧翼区域的引物进行PCR：5'-GCCTCTGTTAGTTTGCGATG-3'和5'-TGATCCAAAAGGATCACA-3'。这些引物从WT等位基因扩增出932 bp的片段，从KO等位蛋白扩增出268 bp的片段。DNA扩增采用初始变性（95°C，持续3分钟），然后进行30个变性周期（95℃，15秒）、退火周期（60℃，15 s）和延伸周期（72℃，15秒钟）。所有PCR反应均使用KAPA快速基因分型混合物。PCR产物的大小在琼脂糖凝胶上测定。

抗体

本研究中使用了以下抗体：兔抗ATG9A（Abcam，cat.ab108338，1:200用于免疫荧光（IF），1:1000用于免疫印迹（IB），兔抗LC3B（Sigma-Aldrich，cat.L7543，1:1000 for IB）、鼠抗AP-4ε（BD Biosciences，cat.612018，1:75用于IF，1:400用于IB）和兔抗AP-4β4（C末端）在我们的实验室生成（抗β4C，参考[4]，1:500代表IB），小鼠抗AP-1γ1（BD Biosciences，cat.610385，1:2500代表IB），绵羊抗TGN46（Bio-Rad，cat.AHP500G，1:500表示IF），鼠抗GM130（BD bioscience，cat 610822，1:250代表IF）、鸡抗血凝素（HA）（Millipore，cat.ab3254，1:250表示IF，小鼠抗α-微管蛋白（Sigma，cat.T9026，1:1000代表IB，兔抗β-微管蛋白（Cell Signaling，cat.2146，1:2500 for IB），小鼠抗钙结合蛋白（Abcam，clone CB-955，cat.ab82812，1:1000 for免疫组织化学（IHC），大鼠抗LAMP1（Developmental Studies Hybridoma Bank，cat.1D4B，1:500 for IHC，兔抗谷氨酸受体1（AMPA亚型GluA1）（Abcam，cat ab31232，IF 1:100，IHC 1:100和Millipore，cat AB1504，IHC1 1:300），兔抗谷氨酸受体2（AMPA子型GluA2）（Sigma，SAB4501295，IF:100，IHC 1:100），兔多克隆抗GluD2-C（δ2R）（Frontier Institute Co.，ltd，897-934/Rb-Af1200，AB_2571601，1:300用于IHC），小鼠HRP-结合抗GAPDH（Santa Cruz，克隆0411，cat.sc-47724，1:500用于IB），兔抗GABARAP（Abcam，克隆EPR4805，cat.ab109364，1:1000用于IB，兔抗ATG7（细胞信号，克隆D12B11，cat.8558，1:1000用于IB），豚鼠抗SQSTM1（MBL，cat.PM066，1:1000 for IB）、Alexa Fluor 488-结合驴抗兔IgG（Invitrogen，cat.A21206，1:100）、Alexa Fluoro 488-接合驴抗鼠IgG，Alexa Fluor 555结合驴抗鼠IgG（Invitrogen，猫。{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“A31570”，“term_id”：“85652”，“term_text”：“pir||A31570“}}A31570型，1:1000），Alexa Fluor 405结合驴抗鼠IgG（Invitrogen，cat.A31553，1:1000、HRP偶联驴抗兔IgG（GE Healthcare，cat.NA934V，1:5000）、HRP接合羊抗鼠IgG、HRP结合驴抗豚鼠IgG和HRP偶联驴抗豚鼠Ig（Jackson ImmunoResearch，cat.706-035-148,1:5000）。

免疫印迹

使用Polytron PT2500E均质器（Fisher Scientific），在pH 7.5的10 mM HEPES、150 mM NaCl、1mM EDTA、1%v/v Triton X-100（添加蛋白酶抑制剂（罗氏））中均质组织。或者，将原代培养中的皮层神经元在加入或不加入100 nM巴非霉素A1（Sigma）的培养基中培养5小时。然后在pH 7.5、0.5%v/v Triton X-100并添加蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液（PBS）中从平板上刮取细胞，在冰上培养30分钟，并在16000 X g下离心10分钟。然后将上清液转移到新鲜试管中。在0.8 ml 50 mm Tris/HCl（pH 7.4）、0.8%v/v Triton X-100、75 mm NaCl（补充有蛋白酶抑制剂）中溶解100 mm培养皿上的人成纤维细胞（不含EDTA的完整培养基；罗氏培养基）。使用Bio-Rad-Bradford蛋白质分析试剂测量蛋白质浓度。样品在95°C或50°C（对于ATG9A）下在含有2.5%v/v 2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich）的Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad）中变性5分钟，然后通过SDS-PAGE进行拆分，并转移到硝化纤维素或Immobilon-P（Millipore）膜上。使用5%牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich）或3%干乳（BioRad）在含有0.1%吐温20（Sigma Aldrich或Western Lighting Plus（PerkinElmer，Inc.）。

运动和行为测试

年轻的WT和AP-4εKO小鼠（PND 1–18）最初使用SHIRPA方案进行一般健康措施筛选[62]并发现两者并无不同。随后，对8-25只成年（2-8个月大）雄性和雌性小鼠进行一系列行为测试，以检查运动、运动感觉和高级神经功能，包括扣球、握力、旋转、旷野、惊吓反应、高架迷宫、自发T迷宫和巴恩斯迷宫。每项实验的动物性别和年龄相匹配。使用D’Agostino正态性检验计算每组所需的小鼠数量，并使用t检验和双向方差分析对重复测量进行统计分析，然后进行Bonferroni事后检验。

夹紧。将WT和KO小鼠在离手术台20cm的高度处用尾巴悬吊15s，并目视检查后肢的姿势。如果在悬吊过程中一条或两条后肢缩回并接触腹部超过3秒，则该反应被视为抱紧。另一方面，如果在整个悬吊过程中，后肢保持向外张开，我们认为这只老鼠没有紧抱。

握力。为了评估神经肌肉功能，我们评估了小鼠从与测力仪（BIO-GS3；Bioseb）相连的45°网格中拉出时所施加的最大抓取力（单位：牛顿，N）。对每只小鼠同时进行三次连续测量，测试所有四只爪子的握力，并将握力计算为每次测量的平均值。

罗塔罗德。加速旋转试验用于评估平衡和运动协调性[63]. 简单地说，将WT和KO小鼠放置在五车道旋转装置上（ENV-574M，Med Associates Inc.）。小鼠以4转/分的速度启动10秒，并在5分钟内逐渐加速至40转/分。转子底部的红外光束自动记录小鼠从杆上跌落的时间。Rotarod的表现在每只老鼠的三次连续试验中得到评分。

打开字段。在照明（200 lux）的白色方形竞技场（50 x 50 cm，35 cm高的墙壁）中每隔5分钟记录一次WT和AP-4εKO小鼠的新颖诱导运动活动，总共持续30分钟。使用Any-Maze软件V5.1（Stoelting Co）对水平运动活动进行视频记录，并对旅行距离进行评分。在试验之间，用70%体积比的乙醇擦拭开阔场地。

惊慌失措。在通风消声室和65 dB白噪声背景（圣地亚哥仪器）下，在有机玻璃圆柱体中进行30分钟的训练，测量声惊吓反应。在5分钟的习惯化期后，WT和KO小鼠共进行了260次试验，试验间周期为伪随机期（5–25 s），包括不同强度白噪声爆发的声惊吓试验（65至120 dB；每强度10次试验）。在每次试验中，在惊吓刺激后的100毫秒间隔内测量最高惊吓强度峰值（以仪器指定的任意单位表示），从中记录100毫秒零周期内个体的平均最高惊吓密度峰值。

高架加迷宫。使用高架十字迷宫评估基本焦虑和冒险行为。实验在Plexiglas plus-sforme迷宫上进行，该迷宫包含两个暗封闭的臂和两个高出地面50厘米的开放臂。四条手臂各30 x 5 cm，与一个5 x 5 cm的中心竞技场相连，闭合手臂的墙壁高20 cm。试验开始时，将WT和KO小鼠放置在迷宫中心，通过视频记录5分钟来跟踪探索活动。小鼠在闭臂/张开臂和迷宫中心的总时间由Any-maze软件（Stoelting）进行评分。加号迷宫在两次试验之间用70%v/v酒精清洗。

T迷宫。如前所述，在T型迷宫中评估短期空间记忆，以测试自发探索性工作记忆行为[64]. 简言之，T形迷宫由三条23厘米长的手臂组成。鼠标被放置在“起始臂”上，并允许探索其偏好的其余两个“目标臂”中的任何一个。一旦鼠标进入左侧或右侧目标臂（四只爪子和一只手臂内的尾巴），一扇限制鼠标探索此手臂的门在30秒内被放下。鼠标立即回到起始臂，并允许再次自由探索仪器。如果在第二次试验中，老鼠决定探索之前未访问过的剩余手臂，则记录下行为的“交替”。每只小鼠记录三次训练，每次延迟时间为90分钟，并对交替的百分比进行评分。

巴恩斯·梅兹。巴恩斯迷宫测试如前所述进行[65]. 该仪器由一个白色圆形平台（直径92厘米）组成，沿周长有20个等间距的孔（直径5厘米，孔间7.5厘米），高出地面100厘米。其中一个洞被指定为逃生洞，并提供了通往装有金属楼梯的逃生箱的通道，除非老鼠靠近该洞，否则很容易进入。在测试期间，小鼠接受了厌恶性增强（85分贝背景噪音和900勒克斯强光），以鼓励它们逃离迷宫。在习惯化阶段（30分钟）后，测试包括两个阶段：训练（空间获取）和测试（探索试验）。训练阶段包括连续四天的4次试验/天/只小鼠，每次试验间隔为30分钟。每次试验的持续时间为3分钟。在训练阶段，从第1天到第4天，对小鼠寻找靶盒所花费的时间（潜伏期）和每次试验的错误次数（在任何无靶孔中戳鼻子）进行评分。测试阶段在训练阶段结束后24小时（第5天）进行，包括每只小鼠90秒的单次试验。在这种情况下，将目标盒从迷宫中取出，以便老鼠无法从迷宫中逃生，并记录逃生/错误洞中的鼻子戳数以及在正确区域内的时间（平台区域的¼，包括逃生两侧的两个错误洞）。使用AnyMaze程序（Stoelting Co.）自动测量潜伏时间、戳鼻孔次数和在正确区域的时间。试验之间用70%v/v酒精擦拭试验室。

磁共振成像

MRI按照参考进行[66]. 使用14.1T磁共振显微成像系统和89mm垂直超导磁体（Bruker Spectrospin）以及由Paravision 5.1软件（Bruke Instruments）控制的Bruker Avance III核磁共振成像控制台（具有35mm ID主动屏蔽梯度）获取MRI数据。在这些实验中使用了一个20 mm ID的鸟笼体积射频谐振器。使用标准多回波自旋回波3D RARE序列采集3D MR图像，回波时间（TE）为6.837ms，重复时间（TR）为200ms，RARE因子为2，平均值为1，采集带宽为119.047kHz。图像视场为20 x 13 x 13 mm，成像数据矩阵为400 x 256 x 256。这为规定的视野生成了50μm各向同性图像。k空间图像数据在梯形k空间滤波、截止（0.25，0.75）和滑动窗口k空间基线校正之前，通过对800 x 512 x 512矩阵进行零填充处理，然后将傅里叶变换为最终的25μm各向同性数字分辨率图像集。

组织学

Historserv，Inc.（Germantown，MD）对WT和KO大脑进行石蜡包埋、切片和H&E染色。

脑切片的免疫组织化学

为了对组织切片进行免疫染色，小鼠经左心室灌注50 ml pH 7.5的磷酸盐缓冲液（PBS），然后在PBS中注入40 ml 4%v/v多聚甲醛（PFA）。在室温下将大脑浸泡在4%PFA中，然后再将其固定16小时。随后，将大脑转移到30%蔗糖中的0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）中过夜。在徕卡9000s切片机上制备了矢状自由浮动切片（35μm厚）。对于GluA1（Millipore AB1504）染色，在阻断前，将切片在85°C的10 mM柠檬酸钠缓冲液中额外处理30分钟，以回收抗原。对于δ2R（Frontier Inst.897-934，RB-Af1200）染色，切片在0.2 M NH中的1 mg/ml胃蛋白酶（DAKO）中培养₄37°C下Cl 10分钟，用于抗原回收。在0.1 M PB中冲洗切片，然后在室温下用含0.25%v/v Triton X-100（封闭溶液）的0.1 M PB4%正常山羊血清封闭切片2 h。在封闭溶液中稀释初级抗体，并在4°C下轻轻搅拌培养切片过夜。用洗涤缓冲液（0.1 M PB含0.25%Triton X-100）洗涤3次后，在室温下用稀释在洗涤缓冲液中的适当荧光团结合二级抗体（AlexaFluor 488和594）培养切片2小时。在用洗涤缓冲液进行另外三次洗涤后，用含有4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）的MOWIOL/DABCO将各部分安装在盖玻片上。使用奥林巴斯共焦显微镜和平面Apochro 63x物镜（N.a.1.40）收集共焦显微镜图像。

人皮肤成纤维细胞的培养

来自一名对照个体（85E0344）和两名SPG50患者的皮肤成纤维细胞，两名患者的皮肤纤维母细胞的内含子14中携带供体剪接位点致病性突变AP4M1系列基因（c.1137+1G->T）（患者1:87RD38和患者2:87RD39）[7]在37°C、5%CO气氛下，在含有10%FBS（Corning）、2 mM L-谷氨酰胺（Gibco）、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素（Gibco-）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中培养。这两名患者还携带了杂合和纯合突变自动转换开关但这些突变并不能解释SPG50表型[7]. 细胞在第10代被用于免疫印迹和免疫荧光显微镜。

神经元的制备、培养和转染

如前所述，从18.5天龄（E18.5）WT和AP-4εKO小鼠胚胎中制备初级海马神经元[67]. 根据海马神经元的方案，制备皮层神经元。简而言之，在断头后，解剖E18.5小鼠的皮层，用0.25%胰蛋白酶（Corning）和100μg/ml DNAse在2.2 mM EDTA中处理15分钟。然后用10 ml和5 ml移液管上下移液10次，破坏组织。细胞通过70μm细胞过滤器过滤，并在900 x g的条件下离心5分钟。将颗粒重新悬浮在含有Dulbecco改良Eagle培养基的10 ml培养基中(D类MEM）（含4.5 g/l葡萄糖，25 mM HEPES，不含酚红），补充10%热灭活马血清，100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。将每个孔80000个细胞接种在预先涂有聚赖氨酸和层粘连蛋白的12孔板上。4 h后，将培养基更换为完整的神经基底培养基（CNB），包括神经基底培养液（含酚红）（Gibco），补充B27无血清（Gibco100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。

用于转染编码的LAMP1-GFP的质粒[22]，质膜红色荧光蛋白（PM-RFP）（具有C末端RFP的FYN-FKBP1A，J.Lippincott Schwartz赠送），HTT103Q-GFP（Addgene#1385），Rab3A-GFP（从Origene SC319905克隆），ε-HA（pCI-neo-（HA）3-ε，参考[19])，和ATG9-mCherry（ATG9带有C端子mCherri，在我们的实验室中生成）。使用1.3μL Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）在DIV4的200 mL Opti-MEM I（Gibco）中转染12孔板上的神经元，每孔转染2-3μg DNA。转染后约1小时，更换培养基。细胞在固定前培养9-12天。

免疫荧光显微镜

将人皮肤成纤维细胞和原代小鼠海马神经元在补充有0.1mM氯化钙和1mM氯化镁（PBS-CM）（含4%蔗糖）的PBS中的4%v/v PFA中固定18分钟。然后在PBS-CM中清洗细胞两次，并在室温下用0.2%v/v Triton X-100渗透15分钟，或在-20°C下用100%甲醇渗透5分钟，以进行AP-4ε染色。在含有0.2%明胶的PBS-CM中稀释初级和次级抗体，然后在37°C下培养30分钟。盖玻片安装有荧光G（电子显微镜科学）。共聚焦显微镜图像是使用蔡司LSM 780共聚焦显微镜和平面Apochro 63x物镜（N.a.1.40）采集的。

实时细胞成像

对于LysoTracker成像，在DIV4转染PM-RFP的小鼠海马神经元在DIV8成像。神经元在CNB中用LysoTracker Green DND-26（Thermo Fisher）孵育40分钟。细胞在成像前用CNB清洗两次。为了进行DQ-BSA成像，将DIV8处未转染的原代小鼠海马神经元与DQ-Red BSA（Thermo-Fisher）孵育4 h。然后将神经元清洗两次，用CellMask Deep Red Plasma membrane染色剂孵育5 min，再清洗三次，然后在一个环境室中拍摄现场图像（温度控制在37°C和CO₂5%），使用日蚀钛显微镜系统（尼康）。NIS-Elements AR显微镜成像软件用于收购和斐济(网址：https://fiji.sc/)用于处理。使用Plan Apo VC 60×物镜（N.a.1.40）和安装在左侧入口的高速电子倍增电荷耦合器件相机（DU-897；Andor）拍摄旋转圆盘共焦图像。在DIV4转染的神经元中观察到LC3B阳性小泡的运动，并在DIV8实时成像。利用斐济的5分钟视频，通过重新分裂堆叠和z投影，从拉直的线条（1像素厚度和25μm长度）生成Kymography。每1秒连续记录一次绿色通道。顺行、逆行或静态事件的数量是通过波形记录仪手动确定的。在Zeiss Axio Vert上对培养的DIV8海马神经元进行相控成像。A1倒置显微镜，带有平面Apochra 40x物镜（N.a.0.55）。

电子显微镜

对于透射电子显微镜，使用VetEquip汽化器用异氟醚麻醉整个小鼠，直到脚趾捏没有反应，然后通过左心室经心灌注50 ml pH 7.5的磷酸盐缓冲液（PBS），然后在PBS中灌注30 ml 2%戊二醛（GA）、2%甲醛（FA）和2 mM氯化钙。1 mm小脑样本^三将其解剖，在pH 7.4的0.1M二羧酸盐中洗涤三次，并在4°C的2%GA、2%FA、2 mM氯化钙、pH 7.4、0.1M二羰酸盐中进一步固定2 h，在缓冲液中洗涤四次10 min，并在同一缓冲液中的2%四氧化锇中冰上固定2 h。样品在缓冲液中清洗两次，在水中清洗五次，然后染色整体在2%乙酸铀酰水溶液中过夜，在水中洗涤三次，在一系列乙醇浓度下脱水，并用EMbed 812（EMS，Hatfield，PA）渗透，EMbed在65°C的平板模具中聚合60小时。样品的薄片（80 nm）在徕卡EM UC7切片机（徕卡，迪尔菲尔德，IL）上切割，并用乙酸铀酰/柠檬酸铅染色。在120 kV下操作的FEI Tecnai 20电子显微镜上检查样品，并在AMT XR81 CCD相机上记录图像。

我们感谢朱晓林（Xiaolin Zhu）和丹尼尔·阿贝贝（Daniel Abebe）提供的出色技术援助，感谢克莱尔·勒·皮尚（Claire Le Pichon）对抱合表型的建议，感谢克里斯·麦克拜恩（Chris McBain）、詹妮弗·利平科特·施瓦茨（Jennifer Lippincott-Schwartz）和丹尼斯·德雷纳。