评估镇痛性谷氨酰胺酶抑制剂6-Diazo-5-Oxo-L-Norleucine的毒性在体外和大鼠皮肤成纤维细胞

摘要

介绍

疼痛是一种普遍存在的症状和体征，它影响着世界各地无数人的生活。它的描述和效果一直是无数历史著作的主题。Celsus（公元前30BC-38AD）认为它是急性炎症的主要症状之一[1]. 目前，有1亿美国人患有慢性疼痛，估计有7620万美国人患有急性疼痛[2]. 目前仅治疗慢性疼痛的年成本估计为1000亿美元[三]. 对生活质量和体力活动的影响很大，估计42%的受影响人口日常活动受到限制[4]. 痛觉过度是对有害刺激的过度反应，而痛觉超敏是对非有害刺激的伤害性反应[5]. 这两种反应都是组织损伤的特征，例如手术创伤。支配皮肤的初级感觉神经元具有谷氨酸能，激活后释放谷氨酸[6]. 谷氨酸刺激初级传入纤维上的兴奋性氨基酸受体（EAA-R），这种刺激导致附近初级传入纤维的敏化和激活，增强伤害性感觉。在炎症过程中，外周传入终末释放谷氨酸和神经肽，如降钙素基因相关肽（CGRP）和P物质（SP）。这些神经元还从脊髓背角的突触末端释放谷氨酸，从而刺激二级神经元并进一步传递伤害性刺激[7–9]. 神经元谷氨酸的主要产生者是谷氨酰胺酶（GLS），大鼠佐剂性关节炎（AIA）和尾部手术切口（TSI）模型初级传入感觉神经元胞体中GLS水平升高[10,11]. 随后，由于通过外周神经轴突的运输，在皮肤的感觉神经末梢中发现GLS增加[10,11]. GLS的升高使皮肤中的感觉神经在炎症期间产生并释放大量谷氨酸。感觉神经释放的谷氨酸升高在一定程度上加剧了炎症的痛觉敏感性（痛觉过敏和痛觉超敏）[6,7,10,12]. 因为GLS负责神经元从谷氨酰胺中产生谷氨酸[13,14]，是缓解疼痛的潜在治疗靶点。事实上，当在AIA期间应用于外周感觉神经末梢时，几种GLS抑制剂是有效的镇痛药[10]. 将GLS抑制剂6-重氮-5-氧代-l-去甲亮氨酸（DON）单次皮内注射到炎症部位能够缓解几天的疼痛[10]. 因此，周围神经末梢中的GLS是治疗急慢性疼痛的新靶点。

DON是一种谷氨酰胺类似物，通过与谷氨酰胺受体位点共价结合抑制GLS[15,16]. DON已被测试为一种化疗药物，但毒性限制了其在人类中的批准和使用[17]. 尽管之前的研究已经确定了DON的毒性，但这是在化疗药物的背景下进行的。值得注意的是，在镇痛研究中，DON是一次性给药，使用的剂量远小于先前临床前毒性研究和临床化疗方案中提到的剂量。单次局部应用较小剂量的镇痛剂可以持续数天，这不仅证明了其有效性，还为安全使用提供了可能。评估DON作为一种局部应用的止痛药的下一步是检查其对皮肤细胞类型的可能细胞毒性作用。在当前研究中，我们检查了在体外不同浓度的DON及其微粒体代谢物对大鼠皮肤成纤维细胞系CRL1213（ATCC）的影响，因为它与细胞增殖、线粒体酶活性、细胞周期和凋亡有关。此外，我们评估了DON的微粒体激活是否会增强其对3T3成纤维细胞的毒性，并启动了DON毒性的初步研究体内在大鼠尾部和后爪皮肤细胞中出现皮肤细胞坏死、炎症和有丝分裂体。

材料和方法

结果

细胞凋亡

细胞凋亡的早期特征是质膜的结构改变，这涉及膜磷脂、磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内层向外层的移位。钙离子存在时，膜联蛋白V与PS结合，因此为检测细胞凋亡提供了一种非常敏感的方法。值得注意的是，初步研究检查了6-重氮-5-氧代-l-去甲亮氨酸（DON）的较短暴露时间（即1、2、4和6小时），没有发现细胞凋亡或坏死有任何显著变化。这将进一步的实验引向更长的连续暴露时间（48小时）。Annexin V研究结果(图1)显示仅培养基的孔具有7369.3±769.62相对单位（ru）的荧光。含有细胞的培养基的相对荧光为9424.2±138.5 ru，而喜树碱6μM（凋亡细胞）处理的细胞荧光为10356.7±175.4 ru。2、20或200μM DON暴露的细胞荧光分别为9483.2±158.4 ru、9669.3±225.3 ru、9524.7±169.8 ru[19]. 唯一值得注意的统计学意义（p<0.05）是阳性对照喜树碱。

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图1

Annexin V分析。

将大鼠皮肤成纤维细胞暴露于浓度为2、20和200μM的DON中48小时。细胞培养基9424.20±138.5 ru；喜树碱细胞（6μM）10356.7±175.4 ru；2μM DON 9483.2±158.4 ru；20μM DON 9669.3±225.3 ru；200μM DON 9524.7±169.8 ru。除阳性对照喜树碱外，无显著差异（*p<0.05）。在485nm激发/535nm发射下读取荧光。数据报告为平均值±sem.N=7（每组）。

坏死

在坏死过程中，细胞质膜受损。碘化丙锭（PI）是一种荧光化合物，被排除在活细胞之外，只能进入质膜受损的细胞。一旦进入细胞，PI就会插入DNA/RNA碱基之间，从而为检测坏死提供了一种非常灵敏的方法。PI研究结果表明，仅培养基孔的荧光强度为2739.6±83.7 ru，而培养基中细胞的荧光强度增加至4058.8±180.2 ru。喜树碱（6μM）处理的细胞荧光强度降低至3686.6±116.1 ru，DON分别增至4522.1±155.3 ru、4502.0±171.1 ru、4208.7±169.4 ru。未观察到统计差异(图2) [20].

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图2

碘化丙锭相对荧光测定。

将大鼠皮肤成纤维细胞暴露于浓度为2、20和200μM的DON或6μM的喜树碱中48小时。培养基中的细胞4058.8±180.2 ru；喜树碱（6μM）3686.6±116.1 ru；2μM DON 4522.1±155.3 ru；20μM DON 4502.0±171.1 ru；200μM DON 4208.7±169.4 ru。未发现显著差异。在485nm激发/535nm发射下读取荧光。数据报告为平均值±sem.N=7（每组）。

线粒体活性

MTT（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化铵）和MTS（3-（4,5-二甲基噻唑-1-基）-5-（3-羧甲基氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四氮唑）分析基于活细胞将MTT/MTS转化为线粒体内的甲赞结晶。对于大多数细胞群体来说，线粒体的总活性与存活细胞的数量有关。这些分析可用于测量在体外药物的细胞毒性作用。MTT分析结果表明，仅培养基孔的吸光度为0.37±0.08，而培养基中的细胞吸光度增加至0.69±0.02。喜树碱（6μM）处理的细胞的吸光度为0.64±0.05。在2、20和200μM DON中处理的细胞的吸光度分别增加到0.68±0.06、0.64±0.02和0.70±0.10。未观察到统计学差异(图3) [21]. 在MTS（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲基氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四氮唑）分析中，0.001μM DON被设置为100.00%的吸光度百分比。从87.9%（0.015μM DON）到130.0%（1000.0μM DON）不等的百分比无统计学意义(图4).

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图3

MTT分析。

将大鼠皮肤成纤维细胞暴露于浓度为2、20和200μM的DON和6μM的喜树碱中48小时。向细胞中添加MTT并读取吸光度。MTT用于测定线粒体活性。培养基中的细胞0.69±0.03；喜树碱（6μM）处理细胞0.64±0.05；2μM DON 0.68±0.06；20μM DON 0.64±0.02；200μM DON 0.70±0.10。未发现显著差异。数据报告为平均值±sem。在485nm激发/535nm发射下读取荧光。N=每组7人。

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图4

MTS分析。

将大鼠皮肤成纤维细胞暴露于浓度为0、0.02、0.05、0.15、0.46、1.4、4、12、37、111、333和1000μM的DON中48小时。DON 0.001μM设置为100.00%的吸光度百分比。从87.9%（0.015μM DON）到130.0%（1000.0μM DON）不等的百分比无统计学意义。在485nm激发/535nm发射下读取吸光度。数据报告为平均值±sem.N=4/组。

细胞增殖

使用CyQUANT®分析分析细胞增殖。这是一种灵敏的基于荧光的检测方法，用于测定培养物中的细胞数量。CyQUANT®GR荧光染料与DNA结合，可以使用激发和发射波长进行测量。结合染料的荧光发射在很大范围内与细胞数线性相关（即每200μl 50–50000个细胞）[22]. 用0.10μM DON处理的大鼠成纤维细胞的CyQUANT®吸光度百分比设置为100%。经0.45-10μM DON处理的细胞无统计学差异。在30μM DON下，CyQUANT®吸光度降低至77.1%。37–333μM DON时，CyQUANT®吸光度进一步降低（60.0–51.3%）。CyQUANT®吸光度的最大降低（38.2%）发生在1000μM DON。在细胞增殖试验中，半数最大抑制浓度（IC₅₀)大鼠皮肤成纤维细胞上的6-重氮-5-氧代-l-去甲亮氨酸（DON）测定为232.5μM(图5).

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图5

使用CyQUANT®测定法分析细胞增殖。

用0.10μM DON处理的大鼠成纤维细胞的CyQUANT®吸光度百分比设置为100%。用0.45–10μM DON处理的细胞没有观察到统计学差异。在30μM DON下，CyQUANT®吸光度降低至77.1%。37–333μM DON时，CyQUANT®吸光度进一步降低（60.0–51.3%）。CyQUANT®吸光度的最大降低（38.2%）发生在1000μM DON。IC50为232.5μM*与0.45-10μM DON处理的细胞相比，p<0.05。数据报告为平均值±sem。在480nm激发/520nm发射下读取荧光。N=每组4个。

细胞周期

利用流式细胞术，可以分析细胞复制状态的总体。这是通过用核酸嵌入荧光染料处理细胞，然后分析群体中每个细胞的荧光特性来实现的。静态和G1细胞有一个DNA拷贝，并且会有一倍（1倍）的荧光强度。处于细胞周期G2/M期的细胞有两个DNA拷贝，其强度是其两倍（2X）。处于S期的细胞正在合成DNA，其荧光值介于1×和2×强度之间。G的流式细胞术控制数据₁时相69.5%；G₂/M期为15.1%，S期为15.3%。在DON（232.5μM）中培养24小时的细胞在G中占71.0%₁相位，G为5.8%₂/M相，S相为23.2%。DON暴露48小时时，G细胞₁G期为75.0%，13.6%₂/M相，S相11.4%[23]. 对于所有组，无子G₁尽管DON暴露时间较长，但观察到的峰值表明没有凋亡。此外，对照组和DON处理的细胞之间的细胞周期相位分布相似(图6). 这些数据支持先前的膜联蛋白和碘化丙啶实验，分别显示没有凋亡或坏死。

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图6

细胞周期分析。

在无（对照）和存在232.5μM DON的情况下，对大鼠真皮成纤维细胞（ATCC CRL-1213）进行24小时和48小时的流式细胞术分析。DON治疗24和48小时后，未出现明显的Sub-G1峰，表明未出现凋亡。

细胞增殖微粒体代谢物

PrestoBlue®（Life Technologies™）试剂是一种基于resazurin的溶液，通过使用活细胞的还原能力来定量测量细胞的增殖，从而作为细胞活性指标。PrestoBlue®试剂含有一种细胞渗透性化合物，呈蓝色，几乎无荧光。当添加到细胞中时，PrestoBlue®试剂会被活细胞的还原环境所修饰，并变为红色，变成高荧光。这种变化可以使用荧光或吸光度测量来检测。用0.10μM DON处理的小鼠胚胎成纤维细胞的吸光度百分比设置为100%。用高达1000μM DON处理的细胞没有观察到统计学差异[24]. 在细胞增殖试验中，半数最大抑制浓度（IC₅₀)小鼠胚胎成纤维细胞上的6-二氮杂-5-氧-1-亮氨酸（DON）被测定为>1000μM(图7)对于接受和不接受人类肝微粒体治疗的组。

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图7

使用PrestoBlue®进行微粒体细胞活性测定。

用0.10μM DON处理的小鼠胚胎成纤维细胞的吸光度百分比设置为100%（激发570 nm，发射600 nm）。用高达1000μM DON处理的细胞没有观察到统计差异。两个治疗组（有微粒体和无微粒体）经DON处理的小鼠胚胎成纤维细胞的IC50均大于1000μM。N=每组7人。

后爪和尾皮的组织学发现

在原始对照皮肤中，表皮和真皮细胞形态正常，偶尔有凋亡小体或有丝分裂象。在盐水注射皮肤中，偶尔在表皮中观察到凋亡小体和有丝分裂像。在注射盐水的尾部皮肤中，一只动物的表皮角质层区域有一个局部的抓痕，严重发炎。这可能是创伤（摩擦、抓挠等），而不是与研究相关。在注射盐水的后足爪皮肤中，皮下有一个局部区域，含有中度的炎性细胞，主要由中性粒细胞和淋巴细胞组成。也有证据表明，与细胞浸润相关的轻度组织坏死。在DON注射的皮肤（尾巴、后爪）中，没有细胞坏死或炎症的证据。在DON处理的皮肤表皮中，偶尔出现有丝分裂像和凋亡小体(图8).

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图8

皮肤毒性。

图8A：后爪皮肤控制。

图8B：尾部蒙皮控制。

图8C：脚掌皮肤盐水注射。

图8D：尾部皮肤盐水注射。

图8E：后爪皮肤DON注射。

图8F：尾皮DON。

讨论

DON是L-谷氨酰胺的结构类似物，破坏了几个谷氨酰胺依赖途径，包括嘌呤和嘧啶生物合成途径，从而导致各种副作用体内[25]. 早在1957年，DON就在临床试验中进行了初步研究。先前对动物肿瘤模型的研究发现，DON对几种癌症（如肺癌、乳腺癌、结肠癌）有效[17]. 在小鼠模型中对DON前药氮霉素的毒性进行的临床前研究显示，其半数致死剂量（LD₅₀)单次腹膜内（ip）给药后为262mg/kg。当每天重复ip给药阿霉素时，LD₅₀降至0.86 mg/kg，显示出累积致死效应，其中大剂量单次耐受，小剂量重复被证明是致命的[26]. 在研究偶氮霉素诱导的毒性与给药方案的关系的研究中，评估了三种方案：单次静脉注射；单次24小时静脉输液，每周静脉注射6周。这些在比格犬身上进行的研究证实，快速静脉注射这种药物的耐受性最好。在动物中，无论给药方案如何，毒性曲线都是相似的，总结如下。几乎在所有测试剂量下都会出现胃肠道毒性，主要表现为呕吐和厌食。在较高剂量下，胃肠道出血和胃肠道上皮病理改变。重要的是要注意，大剂量将导致任何方案的胃肠道毒性。血液学毒性随着剂量的增加而增加，如中性粒细胞减少、淋巴细胞减少和血小板减少。转氨酶和碱性磷酸酶水平升高可引起肝毒性。血尿素氮（BUN）水平升高、蛋白尿、多饮和多尿提示肾毒性。心外膜和心内膜出血、局灶性肺纤维化和轻度局灶性慢性肺炎都证明了心肺毒性。每天静脉注射高剂量（50–100 mg/kg/天，持续7周）会导致心电图（EKG）变化[26].

使用高达500 mg/m剂量的DON在人体的第一阶段试验²恶心、呕吐、粘膜炎和血小板减少是主要副作用，恶心和呕吐是剂量限制性副作用[27]. 第二阶段试验表明，剂量为50 mg/m时毒性较小²，主要表现为轻度白细胞减少。大剂量（>50 mg/m²)，出现明显恶心和呕吐，但疗效最低[28,29]. 在人体临床试验中，大多数患者的口服剂量为0.2–1.1 mg/kg/天。总的来说，胃肠道毒性是最常见的，在低剂量范围内单独给予DON几乎没有骨髓毒性。然而，据报道，频繁服用DON会增加其毒性，通过间歇服用（每4天一次），总剂量越高，耐受性越好[28]. 实际上，这些副作用阻止了DON成为可行的化疗药物。虽然以前的研究已经确定了DON的口服和静脉毒性，但这是在化疗药物的背景下进行的。当被视为止痛剂时，研究使用了局部注射或单剂量局部应用，远远小于临床前毒性和临床化疗应用的剂量[10,11]. 单次局部应用较小剂量的镇痛剂可持续数天，因此在适当的临床环境下可安全有效地使用。

我们通过检查在体外不同浓度的DON对大鼠皮肤成纤维细胞系CRL1213（ATCC）的影响，因为它与细胞活力和凋亡有关。这些研究表明，在与AIA研究中给出的剂量相当的浓度下连续接触DON 48小时后，没有显著影响。然后我们试图检测DON对线粒体功能的影响。由于GLS主要存在于线粒体中，我们建议测试线粒体毒性。使用MTT和MTS分析表明，DON对连续暴露48小时、浓度高达1000μM的大鼠皮肤成纤维细胞无明显毒性作用（p>0.05）。正如预期的那样，促凋亡剂campothecin在凋亡试验（Annexin V）中显示出显著增加（p<0.05），而在所有其他试验中则无显著影响（p>0.05）。

接下来，我们试图确定IC₅₀DON对大鼠皮肤成纤维细胞的作用。我们的结果显示DON IC₅₀使用CyQUANT®细胞增殖测定法在大鼠皮肤真皮成纤维细胞系CRL1213（ATCC）中测定为232.5μM。接下来，我们用IC处理大鼠皮肤真皮成纤维细胞₅₀232.5μM的剂量来检测对细胞周期的影响。流式细胞术数据显示，与对照组相比，24小时S期从11%增加到23%，但48小时后又恢复到15%。值得注意的是，没有发现凋亡或坏死的证据。问题是，如果不是凋亡或坏死，那么什么可能导致细胞增殖减少？谷氨酰胺是核苷酸合成所需的氮供体。细胞增殖需要核苷酸合成。如前所述[11]DON的主要化学治疗作用是通过抑制氨基磷酰转移酶（EC 2.4.2.14）、磷酸核糖基甲酰甘氨酸氨基二合酶（EC 6.3.5.3）和一些氨基转移酶来阻断嘌呤（核苷酸）的生物合成。核苷酸合成的这种抑制可能是细胞增殖减少的原因[30]. 关于DON对细胞增殖的影响的其他可能解释可能包括调节细胞周期素依赖性激酶（CDKs），CDKs是细胞周期控制系统的核心激活剂，在细胞周期的适当时间起到打开和关闭特定蛋白质的作用。另一种可能性是G1检查点的调节，这是细胞准备DNA复制的时间。此外，细胞在G1晚期需要生长因子依赖性信号，称为“限制点”，之后转变为S期。这是癌症中经常失调的关键控制点。早期G1和晚期G1之间的转换（“开始”）由CDK调节，因此可以通过作为CDK抑制剂的化合物进行调节。还有一种可能性是抗有丝分裂原途径的激活。TGFβ-Smad抗有丝分裂途径就是一个例子。转化生长因子β是一种细胞外蛋白，与细胞表面受体结合，使细胞停止细胞周期并进入G0。与TGFβ结合后，受体磷酸化细胞质中的蛋白质，称为Smads。Smad蛋白进入细胞核并作为转录因子启动特定的靶基因。因此，TGFβ通过启动CDK抑制剂基因的转录来阻止细胞分裂[31].

下一步是确定肝脏代谢如何影响DON。换句话说，微粒体代谢是否使DON毒性降低或增加？为了解决这个问题，我们用DON处理NIH 3T3小鼠成纤维细胞，DON与人类肝微粒体孵育。结果显示IC非常高₅₀值（>1000μM有微粒体和无微粒体）。微粒体激活是否会增强DON的毒性尚不清楚，但浓度>1000μM的DON并未显示任何毒性。因此，微粒体激活是否发生并具有任何生物学意义，需要进一步检查。这些实验的结果提出了一个问题，为什么IC存在差异₅₀大鼠和小鼠成纤维细胞系之间的值？可能的考虑因素包括细胞系的发育差异（即成人与胚胎），导致固有细胞敏感性的差异。这些变化可能发生在膜通透性、细胞内合成途径、适应性和恢复机制、化合物的生化转化、受体和转运体结合等方面。总之，所有IC₅₀与先前研究中使用的镇痛剂量相比，该值较大。这提供了一定的安全范围，并为DON的持续毒性测试提供了令人鼓舞的结果。

我们的研究扩展到了对大鼠尾部和后爪皮肤上DON的组织学检查。为了补充之前的疗效研究，皮肤切口研究中使用了0.05 ml的注射量[11]. 由于在几项AIA研究中使用了后爪，因此我们的分析中包括了后爪皮肤。我们在本研究中使用了10 mM DON的浓度，其剂量相当于最大细胞毒性IC的10倍₅₀（>1000μM）。表皮组织学检查显示，注射盐水的尾皮中很少有凋亡小体或有丝分裂象。在注射盐水的后足爪皮肤中，皮下有一个局部区域，含有中度的炎性细胞，主要由中性粒细胞和淋巴样细胞组成。也有证据表明，与细胞浸润相关的轻度组织坏死。在DON注射皮肤（尾部、后爪）中，没有细胞坏死或炎症的迹象，但表皮偶尔出现有丝分裂像和凋亡小体。如果10 mM剂量的DON有毒，我们预计凋亡小体和/或坏死的形成会增加。凋亡体的形成是一种机制，可防止死亡细胞中潜在毒性或免疫原性细胞内容物的泄漏，并将炎症、自身免疫反应和组织破坏降至最低[32]. 此外，如果DON促凋亡，我们预计会有异常数量的细胞进行细胞分裂，如有丝分裂像或纺锤体数量增加所示。然而，很少观察到有丝分裂像。总的来说，这些结果提供了令人鼓舞的数据，说明在浓度为最大IC十倍的情况下局部应用DON的安全性₅₀浓度（>1000μM）。仅观察到偶尔的凋亡小体和有丝分裂象，在正常范围内。总之，DON注射组织的皮肤组织学与大多数对照组相似，没有明显的细胞毒性。

在这些研究中，我们试图阐明、表征和定义DON在一系列浓度下对大鼠皮肤成纤维细胞活性、凋亡、坏死、细胞增殖、细胞周期改变和皮肤细胞毒性的毒理作用。我们的初步研究检查了较短的暴露时间（即1、2、4和6小时），未发现剂量对大鼠成纤维细胞有任何显著影响。这将我们的实验导向更长的连续暴露时间（即48小时）。最重要的是，用比AIA镇痛剂量大2个数量级的DON连续处理的细胞对早期凋亡标志物、膜联蛋白V、细胞活力、线粒体氧化能力、细胞周期状态和皮肤形态没有显示出显著的毒性作用。重要的是要强调，临床前镇痛研究中使用的剂量与化疗使用和局部用药相比要小得多（1毫升2 mM DON或更少）。与癌症化疗研究中使用的剂量相比，用于镇痛的浓度、体积和局部应用都较小，因此可能缺乏毒性作用。此外，局部应用的浓度是最大IC的十倍₅₀在我们的研究中观察到，镇痛剂量是切口疼痛模型中使用的镇痛剂量的5倍，表明没有皮肤毒性[11]. 总的来说，这些结果为描述和定义DON及其微粒体代谢物在一系列浓度下对大鼠皮肤成纤维细胞活性、增殖、线粒体酶活性、凋亡、皮肤毒性的影响提供了第一步。这些数据支持了DON作为止痛药的进一步研究。附加体内需要进行研究来评估急性和慢性DON给药在临床应用中的安全性。

结论

我们的研究表明，在有效提供镇痛的浓度下，DON对大鼠皮肤成纤维细胞没有/只有最小的细胞毒性。如前所述，细胞增殖（IC₅₀)在先前的炎性疼痛实验中，受影响的浓度是镇痛剂量的两倍。此外，DON的局部应用浓度超过IC的十倍₅₀对细胞增殖无皮肤毒性。值得注意的是，尾部手术切口模型中的DON给药是作为一个单独的应用程序给出的，而在体外连续暴露48小时观察细胞毒性。此外，以前的研究表明，在幼年大鼠体内注射DON后，其机械或热敏感性没有改变，这为缺乏功能性毒性提供了支持体内[11]. 后爪注射和局部应用也是如此。需要强调的是，在镇痛研究中，它只是局部应用的单一DON剂量。这与较大剂量的口服和肠外给药途径以及重复化疗方案形成对比，允许较高的药物组织浓度。从这个角度来看，需要进一步研究这种和其他谷氨酰胺酶抑制剂在疼痛治疗中的局部应用。

致谢

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脚注

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