雄激素受体和热休克蛋白27共同调节分子顶泌乳癌的恶性潜能

质粒和转染

这个热休克蛋白27siRNAs和对照质粒由Genechem（中国）构建。三个目标序列热休克蛋白27研究了siRNA，包括siRNA#4892-1:5′-CTGTGGAGGACTGGATAA-3′、siRNA#4893-1:5’-CCCCAGCAATCCTCTA-3′和siRNA#14894-2:5′-GGCAGTCACAGCATT-3′。

HSP27磷酸化位点（Ser15、Ser78和Ser82；CS-I0586-Lv201-01、CS-I0586-Lv201-02和CS-I0586-Lv201-03）的缺失由《基因药典》（中国，附加文件1). 质粒在大肠杆菌，然后使用无内毒素质粒大小试剂盒（中国天津）提取。

细胞转染的方法如下：首先，细胞接种在6孔板中，密度为1.0×10⁴每孔细胞过夜。随后，将2μg构建的质粒分别添加到MEM（美国Gibco）中，并在37°C下培养5分钟。此外，添加并混合FuGENE转染试剂（美国Promega）。培养15分钟后，将复合溶液添加到细胞中，8小时后替换为完整培养基。将反应培养48小时。

定量实时PCR（qPCR）

本研究中使用的RNA是使用Trizol试剂提取的（日本Takara）。使用SuperScript RT工具包（日本高原市）进行逆转录。qPCR是根据制造商的协议，使用SYBR Green PCR试剂盒（日本东京）进行的。的转录水平GAPDH公司作为内部对照，使用的引物如下：GAPDH公司：5′-GGAAGGTGAAGGTCGGTCTC-3′和5′-GTCTCTGGGTGCAGTGAT-3′；应收账：5′-GGAATTCCCTGTGCATGAAA-3′和5′-CGAAGTTCATCAAAGAAT-3′；热休克蛋白27：5′-GCGTGCCCTGGATGCAAC-3′和5′-TGTTATTCCGCGTGAAGCAC-3′。每个样品化验三份。

蛋白质印迹分析

总蛋白用RIPA缓冲液（美国Thermo Scientific公司）和1 mM PMSF提取。根据制造商的说明，使用核和细胞质分离试剂盒（中国KeyGEN）进行细胞质和核亚细胞分离。所有蛋白质在10%SDS-PAGE（Invitrogen，美国）凝胶上分离，转移到PVDF膜上（Millipore，美国），然后用5%脱脂牛奶封闭。通过孵育以下主要抗体检测蛋白质：抗AR（AR441；Abcam，美国）、抗雌激素受体（ER；D8H8；CST，美国），抗孕酮受体（PR；6A1；CST（美国））、抗HSP27（G3.1，Abcam（美国）、抗热休克蛋白27（phospha S15）（EP2293Y，Abcan，美国）（EPR7278，美国Abcam）、抗β-肌动蛋白（8H10D10，美国CST）和抗组蛋白H3（D18C8，美国CSC）过夜；并与辣根过氧化物酶标记的抗兔或抗鼠IgG孵育，然后使用ECL检测试剂盒进行检测（索拉比奥，中国）。每个样品分析三份。

协同免疫沉淀（Co-IP）和蛋白质印迹

AR和HSP27的Co-IP是根据制造商的协议使用Pierce Co-IP试剂盒（美国赛默科技公司）进行的。简言之，AR或HSP27抗体（10μL）首先与AminoLink Plus偶联树脂孵育。将抗体偶联树脂与蛋白裂解物孵育过夜。随后，洗涤树脂，随后洗脱与AR或HSP27抗体结合的蛋白质复合物。随后，如前所述，使用HSP27或AR抗体通过western blot检测样本。每个样品化验三份。

细胞计数器kit-8（CCK8）细胞增殖和克隆形成分析

细胞（DHT治疗或热休克蛋白27敲除）悬浮于96周板中，每孔5000个细胞，培养24小时。此外，在第1天、第2天、第3天、第4天和第5天向每个孔中添加10μL CCK8（KeyGEN，中国）溶液。1–4小时后，使用微孔板阅读器在450 nm处测量每个孔的吸光度。克隆原性测定是使用每孔具有1000个细胞的6孔板进行的。15天后，收集细胞并用结晶紫染色，然后计算细胞集落数。每个样品化验三份。

免疫荧光（IF）分析

将细胞接种在24孔板中。24h后，用4%多聚甲醛固定细胞，用0.2%Triton X-100渗透，用牛血清白蛋白封闭，与一级抗体和荧光标记的二级抗体孵育，然后用DAPI（美国Thermo Scientific）染色细胞核。图像通过荧光显微镜进行可视化和分析。每个样品分析三份。

体内实验

购买18只雌性BALB/c裸鼠（4-6周龄，18-20g），随机分为三组：MDA-MB-453细胞经DHT处理，热休克蛋白27击倒组和对照组。电池（2×10⁶)在腹股沟皮下接种。小鼠的护理和程序由天津医科大学肿瘤研究所和医院动物使用和护理委员会研究所提供。将所有小鼠处死至55天。肿瘤体积的计算与之前的报告相同[11].

所有肿瘤、肝脏和肺部均为石蜡包埋，并用苏木精-伊红（HE）染色。如前所述，采用免疫组织化学方法分析小鼠肿瘤HSP27和Ki67的表达[三]. 为了检测凋亡细胞，根据制造商的说明进行末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测，试剂盒从KeyGEN（中国）获得。

雄激素对MABC细胞增殖的影响

用CCK8法检测DHT对MDA-MB-453细胞增殖的影响，并以MCF7细胞系为对照。第四天，DHT对MCF7细胞有显著的抗增殖作用。然而，在第三天检测到DHT处理显著促进了MDA-MB-453细胞的细胞增殖（图。​（图1c）。1c个). 克隆形成试验还表明，与对照细胞相比，经DHT处理的MDA-MB-453细胞形成的菌落数量显著增加（分别为221%和100%），而经DHT治疗的MCF7细胞与对照细胞相比较，菌落数量减少（分别为56%和100%；图。​图1d）。1天). 因此，MDA-MB-453和MCF7细胞的增殖对DHT治疗表现出相反的反应。

雄激素对AR和HSP27表达和定位的影响

为了确定雄激素是否会影响AR和HSP27的表达，进行了western blot，结果表明，DHT处理的MDA-MB-453和MCF7细胞中AR蛋白水平显著增加。然而，DHT对HSP27的表达没有影响。由于HSP27在三个丝氨酸残基（Ser15、Ser78和Ser82）上磷酸化，因此分析了DHT处理后HSP27的磷酸化形式。有趣的是，Ser82的表达显著增加，而其他的保持不变（图2a个). 中的更改应收账和热休克蛋白27这两个细胞系在DHT处理前后的转录水平与蛋白质水平的变化一致。然而应收账显著增加，而热休克蛋白27表达式保持稳定（图。​（图2b2亿).

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图2

DHT影响AR和HSP27的表达和定位。western blot分析DHT对AR、HSP27和HSP27磷酸化形式在丝氨酸15、78和82的表达的影响(一). 用qPCR检测DHT对AR和HSP27 mRNA表达的影响(b条). western blot分析MDA-MB-453和MCF7细胞经DHT处理前后AR和HSP27在细胞质和细胞核中的表达和定位(c（c）)和免疫荧光(天)分析*P（P） < 0.05

此外，还分析了亚细胞分离后细胞质和细胞核中AR和HSP27的蛋白水平。在MDA-MB-453细胞中，DHT处理使细胞核中AR和HSP27的水平均显著升高，细胞质中则降低，而MCF7细胞中只有AR的水平在细胞核中升高，在细胞质中降低（图。​（图2c）。2厘米). 此外，IF分析表明，与对照细胞的细胞质相比，DHT处理后AR和HSP27均定位于MDA-MB-453细胞的细胞核中。然而，DHT处理后，只有AR定位在MCF7细胞的细胞核中（图。​（图2d二维).

DHT诱导AR和HSP27细胞质/核转位的机制

为了进一步证实DHT诱导AR和HSP27从细胞质向细胞核移位的机制，采用Co-IP方法分析了HSP27和AR之间的相互作用。首先，从经DHT处理的MDA-MB-453和MCF7细胞中提取总蛋白。结果表明，在HSP27免疫沉淀复合物中可以检测到AR，反之亦然（图3a年). 随后，进行细胞质和核亚细胞分离。分析表明，只有在DHT处理后，才能在MDA-MB-453细胞的细胞质和细胞核中检测到AR-HSP27复合物（图。​（图3b），3亿)MCF7细胞的细胞质中（图。​（图3c3立方厘米).

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图3

DHT诱导AR-HSP27复合物的形成。经或不经DHT处理的MDA-MB-453和MCF7细胞总蛋白中AR和HSP27的Co-IP(一). Co-IP检测MDA-MB-453细胞质和细胞核提取蛋白中AR和HSP27(b条)和MCF7(c（c）)用或不用DHT处理的细胞

HSP27对MABC细胞增殖的影响

转染siRNA的细胞热休克蛋白27检测HSP27对AR表达的影响。qPCR和western blot分析确定热休克蛋白27siRNA#4893–1可以明显降低热休克蛋白27与其他相比（图4a类和​和b）。b条). CCK8分析显示热休克蛋白27与DHT处理的细胞相比，敲除降低了MDA-MB-453细胞的增殖能力。DHT治疗可以部分阻止这种影响。MCF7细胞的增殖能力也因热休克蛋白27敲除类似于DHT处理，当细胞同时接受这两种处理时更为明显热休克蛋白27siRNAs和DHT（图。​（图4c）。4厘米). 克隆形成试验表明，对于MDA-MB-453细胞热休克蛋白27与DHT治疗组相比，敲除组表现出显著下降（分别为27%和100%）。当细胞敲除热休克蛋白27再次用DHT处理，菌落数增加（75%）。对于MCF7细胞，热休克蛋白27敲除降低了集落的数量，其程度几乎与DHT相同（分别为90%和100%），并且当细胞同时用二者处理时，集落的数量要低得多热休克蛋白27siRNAs和DHT（62%，图。​图4d第4天).

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图4

HSP27影响AR的表达和定位。通过qPCR检测三个位点（4894-2、4893-1、4892-1）HSP27特异性siRNA的验证(一)和western blot(b条). The proliferation ability of热休克蛋白27用CCK8测定DHT处理或不处理的敲除细胞(c（c）)和克隆形成(天)分析。影响热休克蛋白27western blot分析MDA-MB-453和MCF7细胞AR表达的下调(e（电子）)和qPCR(（f）). Western blot分析MDA-MB-453中HSP27特异性siRNA转染细胞后细胞质和细胞核AR表达水平(克)和MCF7(小时)单元格*P（P） < 0.05

HSP27对AR表达和定位的影响

AR的蛋白质水平热休克蛋白27western blot检测敲除细胞，结果表明HSP27的下调降低了这些细胞中AR蛋白的水平（图。​（图4e）。第四版). 然而，热休克蛋白27敲除对mRNA水平没有影响应收账（图。​（图4f）。第4页). 此外，热休克蛋白27敲除降低了MDA-MB-453和MCF7细胞中AR易位到细胞核的水平（图。​（图4g4克和​安迪小时).

AR细胞质/核转位的HSP27磷酸化关键位点

分别检测转染HSP27丝氨酸15缺失、HSP27丝氨酸78缺失和HSP27序列82缺失结构的细胞，以确定哪个位点在AR细胞质和核转位中起关键作用。进行蛋白质印迹以验证缺失的影响（图5a级). 分析用或不用特异性质粒转染并用DHT处理的细胞的细胞质和细胞核亚细胞分级。与对照组相比，HSP27丝氨酸82缺失转染细胞的AR水平在细胞核中降低，在细胞质中升高，而HSP27丝氨酸15缺失或HSP27序列78缺失转染的细胞与对照组无显著差异（图。​（图5b）。5亿). IF分析进一步证实，与其他三组的细胞核相比，DHT治疗后，AR和HSP27均定位于MDA-MB-453和转染HSP27丝氨酸82缺失的MCF7细胞的细胞质中（图。​（图5c5厘米).

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图5

AR细胞质/核转位的HSP27磷酸化关键位点。通过western blot检测HSP27磷酸化位点（丝氨酸15、78和82）残基的删除情况(一). western blot分析HSP27磷酸化位点缺失和DHT处理后AR和HSP27在细胞质和细胞核中的表达和定位(b条)和免疫荧光(c（c）)化验

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。