活化白细胞粘附分子（ALCAM/CD166）调节食物过敏小鼠模型的T细胞反应

抗体和试剂

对于流式细胞术分析，用购自eBioscience（美国加利福尼亚州圣地亚哥）的别藻蓝蛋白偶联的抗CD3、异硫氰酸荧光素偶联的抗CD4、藻红蛋白偶联的抗CD44和别藻蓝蛋白偶联的抗CD62配体（CD62L）抗体对细胞进行染色。为了进行Western blot分析，从Santa Cruz Biotechnology（美国德克萨斯州达拉斯）购买了抗β-actin和抗ALCAM兔多克隆抗体，从Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）购买了一种抗转铁蛋白兔多克隆抗。辣根过氧化物酶（HRP）结合二级抗体、链霉亲和素、抗CD6和抗IgG抗体购自圣克鲁斯生物技术公司，而白细胞介素-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM‐CSF）蛋白购自研发系统公司（明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）。卵清蛋白（V级）购自Sigma‐Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。霍乱毒素购自List Biologicals（美国加利福尼亚州坎贝尔）。

实验性食物过敏模型

通过腹腔注射50μg卵清蛋白（OVA）和10μg霍乱毒素（CT）作为佐剂，对野生型（WT）和ALCAM缺陷小鼠进行两次致敏，间隔2周。然后，每隔1天，用OVA（50 mg溶于200μl盐水中）对所有小鼠进行6次激发。对照组小鼠经口致敏，单用磷酸盐缓冲盐水（PBS）激发。在最后一次激发后1天将小鼠处死，并分析小肠中的过敏反应（图。​（图11a） ●●●●。

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图1

卵清蛋白（OVA）激发野生型（WT）小鼠的活化白细胞粘附分子（ALCAM）水平发生改变。（a） 诱导小鼠食物过敏的实验方案。用50µg OVA和10µg霍乱毒素（CT）致敏小鼠，并用50 mg OVA攻击小鼠。在最后一次激发后测量临床评分（b）、腹泻评分（c）和核心体温（d）。（e） 小鼠血清中OVA特异性免疫球蛋白（Ig）e水平。（f） 酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清ALCAM水平。（g） 通过实时聚合酶链反应测量小肠中的ALCAM mRNA。（h） Western blotting法测定血清和小肠中ALCAM蛋白水平。数据代表三个独立实验(n个=每组3-4）*P<0·05, **P<0·01与磷酸盐缓冲盐水（PBS）激发对照小鼠。[彩色图形可在以下位置查看http://wileyonlinelibrary.com]

骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的过继移植

为此，我们从骨髓中培养DC，如下所示。从一只小鼠上切除两个股骨并收集骨髓。骨髓细胞被纯化并以5×10的密度进行培养⁶/100π培养皿中加入20 ng/ml IL‐4和GM‐CSF。10天后，使用成熟的骨髓间充质干细胞进行过继移植。转移前1天，用1.5 ml OVA（1 mg/ml）和10μl脂多糖（1 mg/ml）对BMDC进行脉冲处理。小鼠腹腔注射（10⁶细胞/小鼠）两次，间隔2周，每隔1天用OVA或PBS挑战六次。

食物过敏参数的测量

在最后一次挑战中，用数字温度计在挑战前和挑战后15、30和60分钟分别测量小鼠的直肠核心温度（德国伦茨基尔奇，Testo）。如前所述，还观察小鼠2小时以记录腹泻和临床评分5,17.

免疫细胞的分离和培养

从小鼠体内分离出脾细胞、肠系膜淋巴结（mLN）细胞和固有层单核细胞。简单地说，脾脏和mLN在细胞过滤器中用注射器柱塞均质化（BD Falcon，40μm；BD Biosciences，San Diego，CA，USA）。细胞离心并用添加5%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基洗涤，红细胞用氯化铵-钾（ACK）裂解缓冲液（0.15M NH）裂解₄氯，0.1 mM KHCO_三，0.1 mM钠₂‐蒸馏水中的乙二胺四乙酸（EDTA）；pH值7·2）。然后，用含有5%FBS的RPMI和1×10⁶细胞在96孔平底板的每个孔中培养，有无50μl卵清蛋白（10 mg/ml）。培养72小时后，收集细胞并离心。分别冷冻上清液和离心细胞。如前所述分离小肠（空肠）固有层单核细胞18.

共同文化

从WT和ALCAM缺陷小鼠分离脾细胞。CD3（CD3）⁺CD4细胞⁺T细胞和CD11b⁺CD11c公司⁺DC在FACS Aria II（BD Biosciences）上进行分类。下一个，2×10⁵/well WT T细胞和10⁵/在存在或不存在50μl OVA（10 mg/ml）、3.5μg/ml抗CD6抗体和IgG抗体的96孔U型板中培养WT或ALCAM缺陷DC 5天。对细胞进行增殖试验和酶联免疫吸附试验（ELISA）。

增殖试验

从脾脏和mLNs分离的细胞在96孔平底板（1×10⁶/well）添加或不添加50μl卵清蛋白（10 mg/ml）5天。第五天，将细胞计数试剂盒-8（CCK‐8；Dojindo Molecular Technologies，Rockville，MD，USA）中的10μl溶液添加到每个孔中，并培养2-4小时。然后，用ELISA阅读器在450 nm处读取平板。

酶联免疫吸附法

根据制造商的说明，通过ELISA（R&D Systems）测定培养上清液中IL‐4、IL‐5和IL‐13的浓度。根据制造商的说明，使用小鼠IgE ELISA检测试剂盒（BD Biosciences）测量血清总IgE。为了测量卵清蛋白特异性IgE，在微孔板上涂上抗IgE抗体和涂层缓冲液中的卵清蛋白。

流式细胞术分析

单细胞悬液（含1×10⁶至2×10⁶细胞）重新悬浮在100μl荧光活化细胞分选器（FACS）缓冲液（PBS中的0.5%FBS）中，并用活性染料eFluor780（eBioscience）排除死细胞。用CD3、CD4、CD44和CD62配体（CD62L）特异性单克隆抗体（mAbs）的最佳稀释液在4°C下同时对细胞染色30分钟。染色细胞用冷染色缓冲液（2%FCS和PBS中的0.02%叠氮化钠）冲洗两次。样本在FACSVerse流式细胞仪（BD Biosciences）上运行，数据使用FlowJo软件（Tree Star，Ashland，OR，USA）进行分析。

通过定量实时聚合酶链式反应（RT–PCR）测量细胞因子

如前所述，进行定量RT-PCR以测量细胞因子表达水平19计算细胞因子和ALCAM在小肠（空肠）中相对于β-actin的表达。

蛋白质印迹

用Western blotting分析ALCAM的小肠和血清蛋白水平。将小肠组织匀浆，并在放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（Thermo Fisher Scientific）中提取蛋白质。使用Bio-Rad蛋白质检测试剂盒（美国加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad）测定蛋白质浓度。接下来，将5×十二烷基硫酸钠（SDS）样品装载缓冲液添加到蛋白质提取物中并煮沸5 min。然后，将10–20μg蛋白质样品在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，并将其电转移到聚偏氟乙烯膜上（Millipore，Bedford，MA，USA）。用5%脱脂牛奶在含有0.1%吐温-20的1×Tris缓冲盐水中封闭1小时后，在4°C下用抗ALCAM和β-actin的一级抗体孵育膜过夜，然后用HRP偶联的抗兔二级抗体孵化。使用增强化学发光试剂盒（英国白金汉郡GE Healthcare），通过ImageQuant上的胶片曝光，观察蛋白质条带^TM（TM）LAS 4000微型生物分子成像仪（GE Healthcare）。对于血清中的蛋白质分析，我们使用皮尔斯白蛋白/IgG去除试剂盒（Thermo Fisher Scientific）去除白蛋白和IgG，并添加5×SDS样品加载缓冲液。抗转铁蛋白多克隆抗体用于家政蛋白控制。

组织学评价

小肠（空肠）切片用苏木精和伊红（H&E）染色。组织损伤评分测量如下20：0，无损伤；1、损伤程度低，结构成分明显（上皮层和固有层）；2、结构成分仍可分化，但上皮层与固有层明显分离；3、绒毛部分结构紊乱，结构成分难以区分；绒毛结构混乱；绒毛结构混乱，许多绒毛被完全破坏，直至组织基底层。

电子显微镜

小肠（空肠）标本固定、脱水并包埋。用JEM-1011透射电子显微镜（日本东京JEOL）在80 kV的加速电压下观察薄片。用MegaView III相机（日本东京奥林巴斯）获得图像。

人类受试者

2012年4月至2014年9月期间，共有143名儿童在Severance儿童医院接受了食物过敏检查或常规健康检查。食物过敏是根据国家过敏和传染病研究所2010年专家小组报告的指南定义的21获得了详尽的病史，并在第一次就诊时进行了身体检查。被诊断患有其他过敏性疾病（如特应性皮炎、慢性荨麻疹、过敏性鼻炎或哮喘）的患者被排除在外，因为他们对过敏性致敏有潜在影响。获得同意后，采集血样并储存在−20°C。我们通过Pharmacia CAP试验（瑞典乌普萨拉）测量了总IgE和特异性IgE水平。对怀疑食物过敏原的个人进行了特定的IgE测试，如果没有具体说明，还对韩国五种最常见的食物过敏原进行了测试：牛奶、蛋清、小麦、大豆和花生。根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒（美国明尼阿波利斯R&D Systems公司）评估血清ALCAM水平。本研究由Severance医院机构审查委员会批准（方案编号：4‐2004‐0036）。获得参与者及其父母的书面知情同意。

OVA激发的ALCAM中免疫反应减弱^–/–老鼠

为了确定ALCAM对OVA诱导的食物过敏的作用，我们诱导了WT和ALCAM的食物过敏^–/–OVA小鼠。OVA激发的WT小鼠食物过敏参数（包括Th2细胞因子水平、总IgE和OVA特异性IgE以及小肠组织损伤）高于对照小鼠（图。​（图2）。2). OVA挑战ALCAM^–/–小鼠的临床和腹泻评分低于OVA激发的WT小鼠（图。​（图2a、b）。2a、 b）。OVA激发的ALCAM的核心温度变化较小^–/–与OVA激发的WT小鼠相比（图。​（图2c）。2c） ●●●●。此外，OVA激发的ALCAM的小肠（空肠）中Th2细胞因子（如IL-4、IL-5和IL-13）的mRNA表达减少^–/–与OVA激发的WT小鼠相比（图。​（图2d）。2d） ●●●●。OVA激发的ALCAM中血清总IgE和OVA特异性IgE水平也降低^–/–鼠标（图。​（图2e）。2e） ●●●●。OVA挑战ALCAM^–/–受损小肠的特征，如受损绒毛和浸润细胞，比OVA激发的WT小鼠更温和（图。​（图2f，g）。2f、 g）。我们通过扫描电子显微镜（SEM）观察到肠道紧密连接是食物过敏的标志。在对照组小鼠中，小肠（空肠）的紧密连接和桥粒似乎更清晰，而OVA激发的WT小鼠的肠道紧密连接和桥粒则被涂抹并铺开。然而，这些发现在OVA激发的ALCAM中不太严重^–/–鼠标（图。​（图22h） ●●●●。

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图2

活化白细胞粘附分子（ALCAM）调节食物过敏小鼠模型的免疫反应。用50µg卵清蛋白（OVA）和10µg霍乱毒素（CT）致敏小鼠，并用50 mg OVA激发。在最后一次激发后，在OVA激发的野生型（WT）和ALCAM中测量临床评分（a）、腹泻评分（b）和核心温度（c）^–/–小鼠（数据代表三个独立实验，n个=每组4个）。（d） 小鼠小肠中T辅助因子2型（Th2）细胞因子[IL-4、IL-5和IL-13]的mRNA表达。（e） 用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定各组小鼠血清中总免疫球蛋白（Ig）e水平和OVA特异性IgE的光密度值(n个=每组5份），每份样品一式三份。小肠组织学观察（f）和损伤评分（代表三个独立实验的数据，n个=每组4）（g）。（h） 通过电子显微镜（EM）对肠紧密连接的形态学观察**P<0·01[磷酸盐缓冲盐（PBS）与WT/OVA）]；^## P<0·01（WT/OVA）与美国资产负债管理委员会^–/–/OVA）。放大倍数：f，×200；i、 ×50 000。[彩色图形可在以下位置查看http://wileyonlinelibrary.com]

ALCAM中T细胞反应减弱^–/–老鼠

众所周知，APC上的ALCAM和T细胞上的CD6在免疫突触上相互作用，并作为共刺激分子发挥作用22因此，我们试图确定ALCAM在T细胞反应中的作用体外实验。从WT和ALCAM中分离出脾细胞和mLN细胞^–/–小鼠，在有或无OVA的情况下培养。然后用CCK-8测定法测定总T细胞增殖。OVA激发的ALCAM获得的细胞中总T细胞增殖率降低^–/–与OVA激发的WT小鼠进行比较（图。​（图3a）。三a） ●●●●。OVA激发的ALCAM培养脾细胞上清液中Th2细胞因子水平，包括IL-4、IL-5和IL-13，降低^–/–小鼠对抗OVA激发的WT小鼠（图。​（图3三b） ●●●●。

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图3

活化的白细胞粘附分子（ALCAM）影响T细胞增殖。从小鼠中取出脾脏和肠系膜淋巴结（mLNs），并从这些组织中分离细胞。脾和mLNs的总细胞在缺乏（对照；CON）或存在卵清蛋白（OVA）的情况下培养5天。使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）分析评估T细胞增殖。在脾细胞培养上清液中测量释放的T辅助因子2型（Th2）细胞因子[白细胞介素（IL）-4、IL‐5和IL‐13]。（a） 脾（左）和mLN（右）中的总细胞增殖。（b） 通过酶联免疫吸附试验（ELISA）评估脾细胞培养基上清液中的Th2细胞因子水平。三口井的平均值±标准偏差；n个=每组4个，代表三个独立实验的数据**P<0·01（CON与WT/OVA）；^## P<0·01（WT/OVA）与美国资产负债管理委员会^–/–/OVA）。

为了明确评估免疫组织中T细胞反应的变化，我们从脾脏、mLN和小肠分离和培养细胞。为了鉴定T细胞，使用CD3和CD4作为标记。CD3的数量⁺CD4细胞⁺与对照野生型小鼠的T细胞数量相比，OVA激发的野生型小鼠整个免疫组织中的T细胞都增强了，尤其是小肠。然而，CD3的数量⁺CD4细胞⁺OVA激发的ALCAM中T细胞较低^–/–与OVA激发的WT小鼠相比。（图。​（图4a）4a） 我们还发现活化细胞（CD4）的数量⁺CD44细胞^高的CD62L型^低的)在OVA激发的ALCAM中下降更多^–/–与OVA激发的WT小鼠相比（图。​（图4b）。4b） 。CD4的数量⁺小鼠淋巴组织中的T细胞和效应T细胞如图所示​图4c，d，4c、 分别为d。这些结果表明，ALCAM通过与T细胞上的CD6相互作用，影响免疫系统中T细胞的总数量和活化。

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图4

活化的白细胞粘附分子（ALCAM）影响活化的T细胞群。来自脾脏、肠系膜淋巴结（mLNs）和小肠（空肠）的单个细胞用CD3和CD4门控CD4⁺流式细胞术检测活化T细胞的T细胞群或CD4、CD44和CD62配体（CD62L）。（a） CD3⁺CD4细胞⁺卵清蛋白（OVA）激发野生型（WT）和ALCAM的脾细胞、mLN细胞和小肠固有层单核细胞中的T细胞群^–/–老鼠。（b） OVA激发的WT和ALCAM淋巴组织中的活化T细胞^–/–用CD4门控法测量小鼠⁺CD44细胞^高的CD62L型^低的.（c）CD4的数量⁺小鼠淋巴组织中的T细胞。（d） 小鼠淋巴组织中效应T细胞的数量。流式细胞术的数据在三个独立实验中具有再现性，并且三份小瓶的平均值±标准偏差，n个=每组4，代表（c）和（d）三个独立实验的数据**P<0·01（控制与WT/OVA）；^# P<0·05,^## P<0·01（WT/OVA）与美国资产负债管理委员会^–/–/OVA）。

CD6抗体处理的WT T细胞和DC的增殖减少

为了证实ALCAM影响T细胞反应，我们用抗CD6抗体阻断T细胞上的CD6体外用PBS或OVA对小鼠致敏两次（间隔2周）。从小鼠中取出脾脏，分离脾细胞。然后从WT和ALCAM的脾细胞中分离T细胞和DC^–/–老鼠。我们共同培养这些细胞并使用混合T细胞（WT T细胞和ALCAM^–/–T细胞）验证ALCAM^–/–T细胞没有增殖问题。混合T细胞和WT或ALCAM^–/–DC在96孔圆底板中共同培养，并用抗CD6抗体或异IgG抗体处理。用CCK‐8溶液测定细胞增殖，用ELISA测定培养液中Th2细胞因子水平。混合T细胞和WT DC的增殖高于混合T细胞及ALCAM^–/–DC缺乏抗体。无论DC的类型如何，用抗CD6抗体处理的共培养细胞都显示出较慢的增殖。然而，与混合T细胞和ALCAM相比，混合T细胞与WT DC的增殖减少更大^–/–DC（图。​（图5a）。5a） ●●●●。培养基中IL‐4、IL‐5和IL‐13的水平显示出类似的降低（图。​（图55b） ●●●●。

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图5

CD6缺乏会减少共培养细胞的增殖。野生型（WT）(n个=4）和活化白细胞粘附分子（ALCAM）^–/–(n个=4）小鼠用卵清蛋白（OVA）或磷酸盐缓冲盐水（PBS）致敏两次，间隔2周。从脾脏中分离单个细胞以获得T细胞和树突状细胞（DC）。接下来，混合T细胞和WT DC或ALCAM^–/–DC与抗CD6抗体（αCD6）或免疫球蛋白（Ig）G抗体作为对照，在96孔圆底培养板中共培养5天。（a） 通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定法测量共培养细胞的增殖。（b） –（d）通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定培养上清液中T辅助因子2型（Th2）细胞因子水平。数据为三口井的平均值±标准偏差**P<0·01（含WT DC的WT T细胞与含有WT DC和αCD6的WT T细胞）；^## P<0·01（含WT DC的WT T细胞与使用ALCAM的WT T细胞^–/–DC）。

用ALCAM重建WT小鼠的免疫应答减轻^–/–BMDC

OVA挑战ALCAM^–/–来自ALCAM的鼠标和DC^–/–在本研究中，小鼠的免疫反应和细胞增殖分别减弱。澄清这些ALCAM的影响^–/–来自ALCAM的单元格^–/–小鼠，我们将BMDC过继性转移给WT小鼠。WT小鼠接受来自WT或ALCAM的原始或OVA脉冲BMDC^–/–小鼠腹腔内注射两次，间隔2周进行CT检查。在最后一次转移后两周，小鼠每隔1天口服6次OVA。仅注射CT的WT小鼠没有出现食物过敏的迹象，但接受幼稚WT BMDC的小鼠出现轻微的过敏症状（图。​（图6a、b、f）。6a、 b、f）。接受OVA脉冲的野生型BMDCs的小鼠的食物过敏参数，包括Th2细胞因子mRNA的表达、OVA特异性IgE水平和小肠损伤，与未接受OVA脉冲的野生型BMDCs相比显著更高（图。​（图6c、d）。6c、 d）。此外，在用OVA脉冲WT BMDC重建的小鼠中，脾细胞和mLN细胞的增殖增加（图。​（图6e）。6e） ●●●●。在接受OVA脉冲WT BMDC的小鼠中，培养基中的Th2细胞因子水平也降低（数据未显示）。接受OVA脉冲ALCAM的小鼠^–/–与接受OVA脉冲WT BMDCs的小鼠相比，BMDCs表现出较弱的免疫反应（图。​（图6）。6). 此外，我们核实了ALCAM^–/–与接受OVA致敏WT细胞的WT小鼠相比，接受OVA增敏WT T细胞的小鼠产生较弱的免疫反应（支持信息，图S2）。

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图6

活化白细胞粘附分子（ALCAM）^–/–骨髓来源的树突状细胞（BMDC）减轻野生型（WT）小鼠的免疫反应。分离骨髓细胞，通过从WT和ALCAM中分化这些细胞获得DC^–/–老鼠(n个 = 4). WT小鼠接受幼稚或卵清蛋白（OVA）脉冲WT或ALCAM^–/–DC两次，间隔2周腹腔注射霍乱毒素（CT）。两周后，每隔一天用OVA或磷酸盐缓冲盐水（PBS）对小鼠进行六次口服激发。（a） 小鼠的腹泻评分。（b） 最后一次挑战时直接估计的堆芯温度。（c） 根据实时聚合酶链反应（PCR），小鼠小肠中辅助T细胞因子2型（Th2）mRNA的表达水平。（d） 通过酶联免疫吸附试验（ELISA）定量血清OVA特异性免疫球蛋白（IgE）。（e） 使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）溶液测量脾脏和肠系膜淋巴结（mLNs）的细胞增殖。（f） 小鼠小肠的组织学检查（苏木精和伊红染色）；n个=每组和总计3人N个 = 36. **P<0·01（原始WT BMDC与OVA‐脉冲WT BMDC）；^## P<0·01（OVA脉冲WT BMDC与OVA脉冲ALCAM^–/–BMDC）。放大倍数×200。[彩色图形可在以下位置查看http://wileyonlinelibrary.com]

本研究由韩国卫生与福利部（HI14C0234）资助的韩国健康产业发展研究院（KHIDI）韩国健康技术研发项目的拨款以及韩国国家研究基金会（NRF）基础科学研究计划的资助由教育部（2015R1D1A1A01057053）和科学、信息通信技术与未来规划部（NRF‐2017R1A2B2004043）资助。