预测新佐剂反应的基因表达途径分析多西他赛联合卡培他滨治疗乳腺癌

摘要

介绍

过去几十年来，乳腺癌死亡率可能有所下降由于乳房X光检查和系统治疗的改进[1]. 实质性的在美国，被诊断患有乳腺癌的女性比例辅助化疗[2]，但是我们能够先验地预测哪些患者最有可能受益化疗是有限的。肿瘤组织分子图谱研究进展建议可能采用更个性化的方法治疗乳腺癌[三,4]. 使用术前或新佐剂的试验化疗在评估以下因素的分子相关性方面具有独特的地位化疗敏感性，因为肿瘤对治疗的反应可以实时评估。这些研究还有一个额外的优点，即允许评估成对的化疗前后肿瘤标本，以便更好地了解生物学以及乳腺癌的遗传异质性。这反过来会导致更多个体化治疗方法——允许特定选择一种或多种特定肿瘤的化疗药物易受影响。

表达改变的基因很可能是对化疗在那些对治疗有反应的人（即基因）中是不同的赋予敏感性）和不赋予敏感性（即赋予抗性的基因）。在这项研究中，我们试图确定与化疗敏感性相关的基因和阻力。我们利用了第二阶段研究中的治疗前和治疗后活检新辅助多西紫杉醇和卡培他滨化疗的相关性评估在基线基因表达和肿瘤治疗反应之间与治疗相关的基因表达变化。我们还试图评估其他研究中确定的基因表达谱预测数据集中的响应。

材料和方法

这项II期新辅助治疗研究的设计之前描述[5]. 简单地说，女人们新诊断的2或3期乳腺癌，肿瘤大小≥2cm，正常的实验室参数和Zubrod性能状态从0到2为符合条件。如果患者有出血障碍、心脏病，或怀孕或哺乳。对方案进行了审查并经国家癌症研究所机构审查委员会批准。

所有患者均接受了四个周期的多西他赛和卡培他滨治疗每21天。患者最初接受多西他赛（75 mg/m²静脉注射）和卡培他滨（1000 mg/m²p.o.）每天两次每21天2–15次，共四个周期。由于第一阶段毒性过大10名按方案治疗的患者，两种药物的剂量均减少（多西紫杉醇降至60毫克/米²卡培他滨至937.5 mg/m²每天两次）。之后在完成四个周期的多西他赛/卡培他滨（TX）治疗后，所有患者都接受了四次阿霉素循环（60 mg/m²)和环磷酰胺（600毫克/米²)第1天和每21天；6名反应不佳的患者首次化疗前接受阿霉素和环磷酰胺（AC）手术后，其余患者在手术后接受了额外的治疗。所有肿瘤本分析中使用的样本是在AC化疗前采集的用于评估反应的测量也在AC放射治疗之前进行根据手术类型、肿瘤大小和淋巴结受累情况进行个体化治疗。激素受体阳性疾病患者接受他莫昔芬和/或芳香化酶抑制剂完成化疗、手术和放射治疗后。本研究中没有患者接受佐剂或新佐剂曲妥珠单抗。

我们使用双向和最长维度测量记录肿瘤大小在基线检查时、完成TX后和手术前进行体检。我们根据以下方面的变化将患者分为有应答者和无应答者临床检查和病理反应的肿瘤大小（参见表1). 对于术前接受AC治疗的患者，在完成TX时评估反应。简言之完全缓解（三名患者）、手术时的微创疾病（两名患者），或在四个TX周期（三名患者）后出现临床完全反应被视为响应者。所有归类为应答者的患者均接受AC治疗术后。13名患者被视为无应答者；11，带部分缓解（TX四个周期后17–75%残留疾病）四年后，两人患有进展性疾病（基线的110-154%）TX周期。其中，进展性疾病患者和4名患者部分缓解的患者接受了阿霉素的额外术前治疗然而，肿瘤测量用于确定反应在进行额外治疗之前进行分类。包括所有21名患者基线分析中，14名患者的基线和周期1后配对成对分析中包括可评估样本（详细描述（见下文）。

评估肿瘤的雌激素（ER）和孕激素受体（PgR）免疫组化6F11抗体对ER和克隆的阳性反应PgR为16（美国新墨西哥州）。如果出现以下情况，则认为肿瘤ER或PgR阳性>1%的细胞呈阳性。如果出现以下情况，则认为肿瘤HER2阳性他们或者被阅读病理学家归类为3+免疫组织化学（DAKO HercepTest）或如果HER2:CEP17比值通过荧光原位杂交（FISH）>2.0。

结果

患者和肿瘤特征

患者在2001年1月至2003年8月期间累积到研究中。30名患者参与了本研究；人口统计学和肿瘤特征之前已经描述了整个研究人群[5]. 一名患者在第一个化疗周期，并从所有分析中排除。21岁患者进行了含有恶性细胞的基线肿瘤活检纳入应答者与对照组的基线基因表达分析。无响应者（参见表1). 其中，14名患者在基线检查时和一个周期后接受了可评估的肿瘤样本化疗，并纳入后续分析。

获得的所有肿瘤样本的聚类树状图如所示图1一般来说，来自同一个不同时间点的患者聚集在一起。此外，三阴性肿瘤倾向于聚集在一起，激素受体阳性肿瘤也聚集在一起。

在单独的窗口中打开

图1

患者标本的聚类树状图。使用对样本进行聚类凝聚层次聚类与以平均值为中心的24224个基因传递以中心相关为距离度量的基于方差的筛选平均值作为联动函数。“ID”列中的数字对应患者ID号；每个病人最多有三个样本

生物亚型和ROR评分

生物亚型分析结果和ROR评分如所示表1基线检查时，21人中的38%分析的肿瘤分类为基底样，29%为管腔B，19%为管腔A，9%为正常，5%为富含HER2。基线检查时，内脏A肿瘤的ROR得分最低。平均值有应答者和无应答者的ROR相似，但在在无应答者中记录到基线ROR（应答者的平均ROR=47，四分位范围=3；无应答者的平均ROR=48，四分位范围=51）。在配对分析中，来自患者的肿瘤根据临床标准分类为应答者往往有很大的从基线检查到第1周期后ROR得分下降[第1周期平均值6名患者的ROR=4.5（四分位间距=8.5）包含在配对分析中]；相反，较小的减少或无应答者的ROR评分增加[第1周期后平均值八个样本中的ROR=44（四分位范围=27.25）配对分析中的无应答者]。每个项目的ROR变化单个患者如所示图2.有趣的是，在配对分析中，11/14名患者的生物亚型化疗一个周期后发生变化；最常见的变化是从管腔B至管腔A亚型。在应答者中，所有化疗后标本都映射到管腔A组或正常样组。在无应答者中化疗一个周期后，亚型变化较大。热图显示对所有患者样本（A组）和仅基线样本（B组）进行聚类如所示图3.

在单独的窗口中打开

图2

有应答者化疗后ROR评分的变化(面板一)和无应答者(面板b)

在单独的窗口中打开

在单独的窗口中打开

图3

来自PAM50的热图使用（a）所有患者的层次聚类分析标本（b）仅基线标本。示例密钥：蓝色管腔的A中，浅蓝色管腔B，粉红色富含HER2，红色类基底，绿色像正常人一样

讨论

在本研究中，通过cDNA微阵列分析乳腺中的基因表达接受新辅助多西他赛和卡培他滨治疗的癌症患者，我们发现在表征反应方面似乎很重要的生物途径的数量对化疗，包括纺锤体调节和微管解聚，DNA修复和细胞增殖。此外，我们发现之前发表的与治疗反应相关的基因集对我们的样品。

多西紫杉醇是一种紫杉烷，用于治疗转移性和辅助设置。紫杉烷与微管蛋白结合并抑制微管解聚，破坏有丝分裂细胞分裂从而导致细胞死亡[9]. 微管相关蛋白，MAP2、MAP4和MAP-tau通过与微管蛋白结合来稳定微管，并增加微管动力学与MAP表达改变有关紫杉烷抗性[10,11]. 在我们的研究中，无应答者显著提高地图2而不是回应者，建议MAP2蛋白升高可能与患者的耐药性有关。地图4也是GO途径中显示在我们的分析中倾向于差异表达，但在应答者和非应答者之间的基因表达<2，并且P（P）单个基因探针集的值对应于该基因无统计学意义。

除了这些基线差异外，我们还发现比较肿瘤标本时微管和纺锤体相关基因的数量化疗一个周期前后。这些包括主轴组件检查点基因BUB1（业务单元1）和业务单元3和MAD2L1型以及一些微管蛋白亚型。这些基因可能起作用在确定对含有紫杉烷的反应中也起着重要作用化疗。

我们还注意到一些基因的表达显著增加参与一个化疗周期后的DNA修复途径，包括巴西航空公司1,第2部分、和CHEK1（检查1）.DNA损伤是许多具有活性的化疗药物的作用机制乳腺癌和DNA修复途径的改变在乳腺癌的发病机制巴西航空公司1和巴西航空公司2突变[12]. 此外，一类新的靶向药物，PARP目前正在对抑制一种参与DNA修复的关键酶的抑制剂进行评估两者都是针对BRCA公司-相关癌症及其合并症DNA破坏剂[13,14]. 已知两者之间的重叠BRCA1突变和三阴性肿瘤，这些药物也在三阴性疾病的设置(http://www.cancer.gov/search/ResultsClinicalTrialsAdvanced.aspx？protocolsearchid=5122624).大约三分之一的患者患有三重阴性肿瘤在我们的研究中，应答者的百分比患有三阴性疾病。数据来自大型新辅助化疗研究表明，患有三阴性肿瘤的女性与荷尔蒙组相比，更有可能实现病理性完全反应敏感肿瘤，但那些没有反应的患者预后较差[15]. 因此，如果DNA修复在这些肿瘤的发病机制以及对如我们的数据所示，治疗后这些基因在诊断时间和化疗早期可能都是预后因素和预测。

FGF途径中的基因最近被显示为全基因组关联与乳腺癌风险相关的研究[16,17],FGF的肿瘤表达被认为是导致化疗耐药的原因，特别是对紫杉醇的耐药性[18,19]. 在我们的分析中，的表达式FGFR1OP公司一个周期后显著增加化疗。该基因的产物是一种中心体蛋白，涉及在微管的锚定中，并被认为是一种预后指标非小细胞肺癌[20]. 也与这个假设一致，FGFR1号机组在我们的分析中，应答者的基因表达下降。

被认为参与决定对卡培他滨的反应性的基因，例如胸苷合成酶、胸苷磷酸化酶和二氢嘧啶脱氢酶[21]没有在我们的研究中发挥着关键作用。Pusztai等人最近建议第二阶段的研究不太可能识别出显著的单个基因与对个别治疗药物的反应有关[22]. 一个明显的挑战是缺乏权力在小型研究中，再加上多重比较的问题很难区分真正差异表达的基因和噪声。另外，在这些小型研究中，肿瘤之间的显著异质性可能导致稀释可能明显的基因表达的真正差异如果对更均匀的肿瘤进行研究。我们的患者人数相当多肿瘤的分子和组织学特征的异质性。越来越明显的是，乳腺癌的不同亚类具有非常不同的预测，并且可能对特定类别有不同的反应治疗药物。因此，对DNA修复表达变化的分析仅限于三阴性肿瘤的基因可能与确定结果比涉及混合肿瘤组的结果要好。

对我们基线标本的PAM50分析显示ER和PgR表达和亚型分类之间的一致性IHC表达ER或PgR的样本往往属于管腔类型，而三阴性肿瘤表达基本表型。此外，尽管根据PAM50对化疗前后患者的分析，这些数字非常小标本引发了几个有趣的问题。首先，我们发现ROR得分化疗一个周期后总体下降。这可能反映了细胞周期因化疗而被捕。此外，我们还看到，经过一个循环化疗后，我们大多数标本的指定表型发生了变化最常见的变化是从管腔B型变为管腔A型。这些数据可以反映了肿瘤细胞增殖的减缓，使其与管腔A亚型。或者，我们的数据可以反映选择性杀戮对化疗敏感的肿瘤细胞，会留下亚群激素敏感、化疗反应较低的肿瘤细胞。虽然我们的结果是从生物学角度来看，这些数据必须谨慎解释，因为样本量和确定亚型成员的方法学挑战新数据集。在解释分析数据时必须谨慎，这意味着使用基因中心化，特别是在小样本和以下情况下研究人群中的亚型流行率与最初用于创建算法的示例[23]. 重申我们使用RT-PCR的样品可能已经产生了不同的结果，并可能对未来的研究有所帮助。因此，更大需要对可用于RT-PCR的样品进行研究，以确定化疗的分子亚型是临床上的真实现象启示。

如前所述，使用高通量分析的小型II期研究技术可能受到两个重要问题的限制：高错误发现率对大量基因的询问，以及基因表达导致识别重要个体的能力不足基因。在我们的分析中，我们试图通过寻找与生物相关的基因路径和类别，而不是单个基因，并使用之前设计的基于已证明与结果相关的多个基因[8]. 我们的GO途径分析确定39个GO类别区分应答者和非应答者，71个一个化疗周期后表达差异显著的类别在1666个类别中，包含符合阈值的基因条件。使用P（P）显著性小于0.005，我们预计只有八个类别会对每个类别产生显著差异这些分析纯属偶然。

对小型第二阶段研究的识别能力持怀疑态度化疗反应的药物基因组标记[22]当然是有保证的。然而，我们相信使用生物相关途径而非个体进行分析基因是一种可行的策略，尤其是对于有限的研究检测单个基因表达显著差异的敏感性。因此，通路方法代表了基因领域的一个重要进展表达分析。

总的来说，我们的研究有几个明显的优势。新鲜的可用性在治疗过程中的多个时间点收集的冷冻组织是一种稀有而宝贵的资源。虽然在所有研究中我们没有配对样本参与者，我们不认为我们的研究样本有偏见。似乎没有化疗前后标本与肿瘤是否相关大小、肿瘤特征或治疗反应。

然而，应注意几个重要的限制，包括样本量和我们的发现缺乏验证集。因此，数据这里的介绍必须被认为是探索性的。当我们进入个性化时代肿瘤治疗，获得高质量肿瘤样本的研究，以及储存用于研究，特别是用于分子诊断至关重要。在此外，在新辅助化疗研究中化疗后可以使用新的分子技术进行检查至关重要促进我们对乳腺癌生物学和个体肿瘤对治疗的反应。

总之，我们得出结论，一些生物学上似乎合理的途径，包括微管和细胞纺锤体的结构和功能，DNA修复，以及生长因子受体可能在确定敏感性和对以紫杉醇为基础的化疗。我们肿瘤标本中的PAM50分析显示合理IHC分类和分子亚型之间的一致性，如其他研究。此外，我们的数据表明，肿瘤ROR评分随着化疗，尤其是对反应性肿瘤的化疗，尽管有更大的研究有必要确认这一发现。使用GO类别进行基因通路分析应该作为限制基因错误发现率的一种手段表达谱研究。我们的发现与来自其他研究人员检查了基因表达与对治疗的反应对于确定哪些特定基因是最有价值的重要。在现有肿瘤的大型研究中证实了这些发现标本有望使我们更接近实现个性化的目标乳腺癌的治疗。

补充材料

致谢

脚注

参与者信息

拉里萨·科尔德，美国医科大学肿瘤医学系华盛顿/西雅图癌症护理联盟，G3639，825 Eastlake Ave，E，西雅图，WA 98109，美国。

劳拉·卢萨，美国大学生物统计与医学信息研究所卢布尔雅那，卢布尔雅那，斯洛文尼亚。

丽莎·麦克谢恩，癌症治疗和美国贝塞斯达NCI诊断（DCTD）。

Peter F.Lebowitz，葛兰素史克公司（Glaxo Smith Kline），美国Collegeville。

LuAnne Lukes，美国贝塞斯达NCI人口遗传学实验室。

凯文·坎普豪森，NCI癌症研究中心放射肿瘤科，美国贝塞斯达。

乔尔·帕克，Lineberger综合癌症中心遗传学系，美国北卡罗来纳大学教堂山分校。

桑德拉·斯温，华盛顿医院中心，美国华盛顿。

肯特·亨特，美国贝塞斯达NCI人口遗传学实验室。

乔·安妮·祖耶夫斯基，癌症治疗评估项目临床调查处，美国贝塞斯达NCI DCTD。

工具书类