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美国心脏病杂志。作者手稿；2018年4月6日PMC发布。
以最终编辑形式发布为：
美国心脏病杂志。2016年4月5日；67(13): 1556–1568.
doi（操作界面）：2016年10月10日/j.jacc.2016.01.030
预防性维修识别码：项目编号5887128
NIHMSID公司：NIHMS834663
PMID：27150688

基质细胞蛋白CCN5逆转已确立的心肌纤维化

Dongtak Jeong先生，博士，一 李敏阿，理学硕士，b条 阎丽，理学硕士，b条 董权阳（Dong Kwon Yang）、DVM、博士，一 Changwon Kho公司，博士，一 Jae Gyun噢，博士，一 庆德港、理学学士、，b条 阿扬·李，博士，一 闵浩松、理学学士、，b条 托马斯·拉罗卡、医学博士、博士，c（c） 陈季秋，医学博士，一 梁丽凡，MD，一 三山信一、医学博士、博士，一 瓦伦蒂娜·德斯卡马尔，博士，一 杰森·科瓦西奇、医学博士、博士，一 大黄岛，理学硕士，d日 罗杰·哈贾尔，医学博士，一和Woo Jin公园，博士b条
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

背景

心脏纤维化（CF）与心室硬度增加和舒张功能障碍有关，是心力衰竭（HF）患者长期临床结果的独立预测因素。我们之前表明，基质细胞CCN5蛋白通过其抑制CF和保持心脏收缩力的能力具有心脏保护作用。

目标

本研究检测了CCN5在人类心力衰竭中的作用，并测试了CCN五是否能够逆转压力过载诱导的HF实验模型中建立的CF。

方法

人类心脏取自终末期心力衰竭患者。横行主动脉缩窄8周可诱导大范围CF，随后腺相关病毒介导CCN5转移至心脏。基因转移后八周，检测细胞和分子效应。

结果

与无病心脏相比，终末期心力衰竭患者衰竭心脏中CCN5的表达显著降低。三色染色和肌成纤维细胞含量测定表明，CCN5基因转移逆转了已建立的CF。CCN5的抗CF作用与抑制转化生长因子β信号通路有关。CCN5显著抑制内皮-间质转化和成纤维细胞-肌成纤维细胞转分化，这是体内外CF进展的两个关键过程。此外，无论在体内还是体外，CCN5均诱导肌成纤维细胞凋亡，但不诱导心肌细胞或成纤维细胞的凋亡。CCN5特异性地在肌成纤维细胞中激活了固有的凋亡途径，这可能是因为CCN5能够抑制抗凋亡分子NFκB的活性。

结论

CCN5可以通过抑制心肌中肌成纤维细胞的生成并促进其凋亡来逆转已建立的CF。CCN5可能为开发靶向抗CF疗法提供了一个新的平台。

关键词：细胞凋亡、基因治疗、心力衰竭、核因子κB

在美国，心力衰竭（HF）每年约造成450000人死亡，是大多数病理性心脏损伤的最终结果。心力衰竭的特点是心脏收缩力降低和心室重塑(1,2). 心脏纤维化（CF）与心室僵硬度增加、舒张功能障碍、收缩和舒张功能障碍相结合(三,4)，心律失常(5)、糖尿病心肌病(6)心衰患者的冠状动脉血流受损(7). 广泛纤维化检测是HF患者死亡率和长期HF治疗有效性的预测指标(7). 虽然CF通常被视为次要现象，但也有人建议它在HF的进展中起主要作用(8). 症状严重的主动脉瓣狭窄患者接受主动脉瓣置换术的临床结果与CF严重程度相关(9). 与这一发现一致，CF而非左心室射血分数与非缺血性扩张型心肌病患者的死亡率和心源性猝死相关(10). 因此，CF是治疗HF的有效靶点；然而，目前还没有有效的抗CF疗法(11).

CF主要由成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞介导。与静止的成纤维细胞不同，肌成纤维细胞分泌大量细胞外基质蛋白，并因将α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）掺入应力纤维中而具有收缩特性(12). 病理条件下扩张的成纤维细胞来源多种多样(13). 常驻成纤维细胞增殖可能是肌成纤维细胞最重要的来源。此外，在小鼠压力超负荷和慢性同种异体排斥模型中进行的血统追踪研究表明，心脏内皮细胞通过一个称为内皮-间充质转化（EndMT）的过程参与CF(14). 在扩张型心肌病小鼠模型中，大量肌成纤维细胞被证明来源于造血细胞(15). 在分子水平上深入了解导致心肌成纤维细胞扩张的各种途径将有助于开发抗CF模式。

一组称为CCN家族（CCN1至CCN6）的基质细胞蛋白与多种细胞功能相关(16). 我们之前发现，在心肌肥厚的消退过程中，CCN2和CCN5的表达受到不同的调节。CCN2，也称为结缔组织生长因子，是纤维化的特征性标志物和介质(17). 正如预期的那样，CCN2转基因（Tg）小鼠心脏的肥厚反应和压力过载后的CF显著加剧。相反，在CCN5-Tg小鼠的心脏中，压力超负荷时的肥大反应和CF被显著抑制。CCN5还可在体外阻断CCN2诱导的心肌细胞肥大。这些观察结果表明，CCN2和CCN5在不利的心脏重塑中发挥相反的作用：CCN5是抗肥厚和抗纤维化的，而CCN2是促肥厚和促纤维化的(18).

在这项研究中，我们发现严重心衰患者的心肌中CCN5显著降低。我们评估了腺相关病毒（AAV）介导的CCN5过度表达对伴发心脏功能障碍的既定CF的影响。CCN5逆转了预先建立的CF，其对胶原蛋白含量和心肌成纤维细胞恢复到接近正常水平的比例有负面影响。CCN5在体内外抑制EndMT和成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞。此外，CCN5在体内外诱导肌成纤维细胞凋亡，但在心肌细胞或成纤维细胞中没有诱导凋亡。总之，这些数据表明CCN5可以用于开发新的抗CF疗法。

方法

所有实验程序的详细说明见在线附录.

结果

CCN5在心力衰竭中下调

为了评估CCN5在心衰患者中的临床相关性，对心脏移植时心衰患者心脏中CCN5蛋白的表达进行了测定，并与正常对照组进行了比较(在线表格1). Western blotting显示，CCN5在衰竭心脏中的表达降低至对照心脏中检测到的水平的~24%(图1A). 相比之下，CCN2在同样的衰竭心脏中的表达几乎是对照心脏的4倍(在线图1A). CCN5的表达也在由横主动脉收缩（TAC）8周诱导的HF小鼠心脏中进行了测量。在这些衰竭的心脏中，CCN5的表达降低到正常水平的~10%(图1B)而CCN2的表达是对照组的11倍(在线图1B). 这些结果表明，低CCN5水平与人类和小鼠的HF相关。这些数据也证实CCN2表达在HF期间增加(17).

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CCN5在心脏衰竭时被下调

通过Western blotting检测心衰患者和健康对照（正常）心脏组织样本中CCN5的水平（A），以及TAC诱导的HF小鼠和假手术小鼠（sham）（B）将蛋白质提取物（15µg）加载并用抗CCN5和抗GAPDH抗体探测**p<0.01。GAPDH=甘油醛-3-磷酸脱氢酶；HF=心力衰竭；TAC=主动脉横缩。

CCN5反向建立CF

为了检测CCN5对衰竭心脏的影响，我们产生了重组AAV血清型9，以驱动CCN5在心脏中的表达（命名为AAV-CCN5），并与对照病毒（命名为AA V-VLP）一起。当通过尾静脉注射时，AAV-CCN5以剂量依赖的方式增加CCN5的表达，特别是在心脏。AAV-CCN5可预防TAC诱导的HF，这与CCN5 Tg小鼠获得的数据一致(在线图2). 小鼠接受TAC治疗8周以诱导HF。超声心动图显示这些小鼠的LV显著扩张，缩短分数减少，表明HF。心脏衰竭小鼠接受AAV（5×1010每只小鼠的病毒基因组），并在8周后进行分析。尽管接受AAV-VLP的小鼠的超声心动图参数进一步恶化，但接受AAV-CCN5的小鼠的超声心动图参数保存良好(在线图3). 这些结果表明CCN5具有心脏保护作用。

对前文所述实验中获得的心脏进行组织学分析。为了分析CF的成分，心脏切片用三色染色。在接受AAV-VLP治疗的小鼠中，TAC治疗8周后，间质和血管周围区域的纤维化都增加了，再接受8周TAC治疗后，纤维化进一步增加。然而，在相同条件下，在接受AAV-CCN5的小鼠中，相同区域的纤维化明显减轻(图2A). 心脏切片进一步用抗肌成纤维细胞标记物α-SMA抗体染色。在接受AAV-VLP的小鼠中，TAC 8周后α-SMA阳性肌成纤维细胞的比例增加，再接受8周TAC后进一步增加。同样，在相同条件下接受AAV-CCN5的小鼠中，α-SMA阳性细胞的比例显著降低(图2B). 荧光激活细胞分选（FACS）分析进一步证实了服用AAV-CCN5后α-SMA阳性细胞数量的减少(图2C). 这些数据表明，CCN5可诱导心脏内预制纤维原材料的降解。此外，CCN5降低了α-SMA阳性肌成纤维细胞的比例，该比例在TAC反应中已经扩张。

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CCN5降低既定CF

对小鼠进行为期8周的手术或TAC。AAV-VLP或AAV-CCN5（5×1010每只小鼠的病毒基因组）通过尾静脉注射。八周后，分析心脏CF的程度。（A）心脏切片并用三色染色。间隙的代表性图像（上排）和血管周围（下一行）显示区域。绘制了纤维化区域的百分比。（B）用抗α-SMA抗体对心脏切片进行免疫染色。间质的代表性图像（左侧面板）和血管周围（右侧面板）显示区域。显示了α-SMA阳性细胞的比例。（C）使用Langendorff灌注系统从心脏分离成纤维细胞，并使用FACS测定表达α-SMA的细胞组分（n=3）*p<0.05**p<0.01。AAV=腺相关病毒；CF=心脏纤维化；FACS=荧光激活的细胞分选；SMA=平滑肌肌动蛋白；中的其他缩写图1.

CCN5抑制TGF-β信号

转化生长因子（TGF）-β是CF的关键介质。通过Western blotting检测CCN5对TGF-β信号转导的影响(图3A). 与之前的报告一致，TAC增加了TGF-β信号传导，如激活SMAD的SMAD2磷酸化增加所示。在接受AAV-CCN5的小鼠中，TAC诱导的SMAD2磷酸化显著降低，而且SMAD7（一种抑制性SMAD）的水平增加。CCN2是TGF-β信号的下游靶点(19). 在接受AAV-CCN5的小鼠中，未观察到衰竭心脏中CCN2水平较高。赖氨酸氧化酶介导纤维化过程中胶原纤维的交联(20). TAC增加小鼠赖氨酰氧化酶的表达，但在AAV-CCN5治疗后其表达恢复正常。定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）还显示，TAC诱导TGF-β1和-β2的高表达，AAV-CCN5显著抑制CF相关基因的表达，包括CCN2、galectin 3、胶原蛋白1A、胶原蛋白3A1和纤维连接蛋白(图3B和在线表格2). 这些数据表明CCN5抑制TGF-β信号传导。

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CCN5抑制TGF-β信号传导

对小鼠进行为期8周的手术或TAC。注射AAV-VLP或AAV-CCN5。（A）八周后，对心脏提取物（50µg）进行Western blotting。（B）心脏提取物进行qRT-PCR*p<0.05**p<0.01。qRT-PCR=定量实时聚合酶链反应；TGF=转化生长因子；中的其他缩写图1和​和22.

CCN5禁止结束MT

心脏成纤维细胞来源于许多不同的细胞。内皮细胞通过EndMT显著促进CF(14). 因此，我们使用Scl-Cre-ER公司T型; R26R停止YFP双Tg小鼠。在这些双Tg小鼠中，Cre-ERT型在内皮细胞中特异表达。因此，无论随后的表型改变如何，三苯氧胺诱导的黄色荧光蛋白（YFP）在内皮源性细胞中持续表达。对这些双Tg小鼠连续5天给予他莫昔芬。首次给药后4周，小鼠接受TAC，同时注射AAV-CCN5或AAV-VLP。额外8周后，检查心脏功能和解剖(图4A). 严重的心脏功能障碍和纤维化在接受AAV-VLP的小鼠中很明显，而在接受AAV-CCN5的小鼠中不太明显（数据未显示）。然后制备心脏组织切片，并用抗YFP和抗波形蛋白抗体进行免疫染色(图4B). YFP和波形蛋白（一种纤维化标记物）阳性的细胞代表通过EndMT获得纤维化表型的内皮来源细胞。在接受AAV-VLP的小鼠中，约8.5%的波形蛋白阳性细胞也呈YFP阳性，而在接受AAV CCN5的小鼠中则<1%(图4C)表明CCN5在体内显著抑制EndMT。

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CCN5禁止EndMT

（A）实验方案如下所示B类和C类.（B）心脏切片与YFP抗体联合免疫染色（绿色）和波形蛋白（红色）YFP和波形蛋白阳性细胞（箭头）进行了EndMT。（C）绘制YFP阳性的波形蛋白阳性细胞分数（n=3）。（D）在存在或不存在TGF-β的情况下，在CM-Con或CM-CCN5中培养HCAECs。然后用VE-cadherin或vimentin对细胞进行联合染色。（E）HCAEC被刮伤，然后在相同的条件下培养，如E类48h后，细胞固定并用DAPI染色。显示了具有代表性的图像（左），并绘制偏移距离（右）（n=4）。（F）使用在相同条件下培养的细胞对α-SMA、I型胶原、III型胶原、Tie2和CD31进行qRT-PCR分析，如D类（n=6）*p<0.05**p<0.01。CM-CCN5＝含有CCN5的条件培养基；CM Con=对照条件培养基；DAPI=4'，6-二氨基-2-苯基吲哚；EndMT=内皮-间充质转化；YFP=黄色荧光蛋白；HCAEC=人冠状动脉内皮细胞；VE=血管内皮；中的其他缩写图2和​和3三.

使用由瞬时转染CCN5表达质粒的HEK293细胞培养物制备的含有CCN5的条件培养基在体外分析CCN5功能。经酶联免疫吸附试验（ELISA）测定，条件培养基含有约200 ng/ml CCN5（数据未显示）。当添加到新生儿心肌细胞培养物中时，含有CCN5的条件培养基（而非对照条件培养基）抑制了苯肾上腺素诱导的肥大(在线图4). 这表明含有CCN5的条件培养基，而不是对照条件培养基，含有功能活性的CCN5。TGF-β对人冠状动脉内皮细胞（HCAECs）的治疗导致波形蛋白的获得和血管内皮细胞标志物血管内皮细胞钙粘蛋白（VE）的丢失。通过与含有CCN5的条件培养基共同处理，TGF-β诱导的EndMT被完全阻止(图4D). 经历过渡期的内皮细胞的特征是迁移能力增强(21). 通过体外划痕试验评估，TGF-β治疗HCAECs可增加细胞迁移活性，而这可通过与含有CCN5的条件培养基孵育来阻止(图4E). qRT-PCR显示TGF-β治疗后HCAECs中成纤维细胞相关基因包括α-SMA、I型胶原和III型胶原上调，内皮相关基因包括Tie2和CD31下调，CCN5完全阻止了这些变化(图4F). 这些结果表明CCN5在体外抑制EndMT。

CCN5抑制成纤维细胞向成肌细胞的转化

CF期间心脏成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞。肌成纤维纤维细胞以α-SMA的表达为特征。小鼠接受TAC并同时注射AAV-CCN5或AAV-VLP(图5A). 在该程序完成八周后，接受AAV-VLP的小鼠出现明显的心脏功能障碍和纤维化，而接受AAV-CCN5的小鼠则明显不明显（数据未显示）。然后制备心脏组织切片，并用抗波形蛋白和抗α-SMA抗体进行免疫染色(图5B). 波形蛋白和α-SMA阳性的细胞代表转分化为肌成纤维细胞的成纤维细胞来源的细胞。在接受AAV-VLP的小鼠中，约17%的波形蛋白阳性细胞也呈α-SMA阳性。在接受AAV-CCN5的小鼠中，这一比例降至约4%(图5C). 这些数据表明CCN5抑制体内成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化。

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CCN5抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化

（A）的实验模式B类和C类.（B）心脏切片用抗波形蛋白联合免疫染色（红色）和抗α-SMA（绿色）.波形蛋白和α-SMA阳性细胞（箭头）进行成纤维细胞-肌成纤维细胞转分化。（C）绘制了波形蛋白阳性的α-SMA阳性细胞的比例（n=3）。（D）成纤维细胞在存在或不存在TGF-β的情况下在CM-Con或CM-CCN5中培养。细胞与抗α-SMA或DAPI共同染色。（E）胶原蛋白凝胶晶格的制作和培养条件与D类48小时后，测量胶原蛋白晶格的面积。胶原凝胶晶格的代表性图像如图所示（左），并绘制胶原蛋白凝胶相对于对照凝胶的面积（右）（n=3）。（F）RNA是从与D类对α-SMA和I型胶原进行qRT-PCR分析（n=6）*p<0.05**p<0.01。中的缩写图2到​至44.

利用大鼠成年心脏成纤维细胞进行体外实验，再现成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化。免疫染色显示，用TGF-β治疗这些成纤维细胞可显著增加α-SMA的表达，而用含有CCN5的条件培养基联合治疗可完全阻断α-SMA表达(图5D). α-SMA表达增加显著增加肌成纤维细胞的收缩活性，这可以在胶原凝胶晶格分析中观察到(22). TGF-β治疗心脏成纤维细胞可显著诱导胶原凝胶收缩，而与含有CCN5的条件培养液联合治疗可使胶原凝胶收缩减弱(图5E). qRT-PCR显示TGF-β显著增加心脏成纤维细胞中α-SMA和I型胶原mRNA的表达，含有CCN5的条件培养基完全逆转了TGF-(图5F). 这些结果表明，CCN5在体外完全抑制TGF-β介导的成纤维细胞转分化。

CCN5诱导成肌细胞凋亡

上述数据表明，CCN5可防止纤维化条件下成纤维细胞的扩张和转分化。我们测试了增强肌成纤维细胞清除是否也有助于CCN5介导的CF逆转。小鼠接受TAC并同时注射AAV-CCN5或AAV-VLP(图6A). 两周后，用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记（TUNEL）染色检测心脏组织切片的凋亡。同时用抗α-SMA抗体进行免疫染色(图6B). TUNEL阳性或α-SMA阳性细胞在假手术小鼠中很少见，但在TAC手术小鼠中显著显著。在接受AAV-VLP的小鼠中，约9%的α-SMA阳性细胞也呈TUNEL阳性。在接受AAV-CCN5的小鼠中，该水平增加至~72%(图6C). 综上所述，这些数据表明CCN5在体内诱导肌成纤维细胞凋亡。在心肌细胞或成纤维细胞中均未观察到CCN5介导的凋亡（数据未显示）。

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CCN5诱导肌成纤维细胞凋亡

（A）的实验模式B类和C类.（B）心脏切片用TUNEL共同染色（红色）和α-SMA（绿色）TUNEL和α-SMA阳性细胞（箭头）发生肌成纤维细胞凋亡。（C）绘制了α-SMA阳性的TUNEL阳性细胞的比例（n=3）。（D）心肌细胞（Myo）、成纤维细胞（FB）和肌纤维细胞（MyoFB）在CM-Con或CM-CCN5中培养48 h，然后用DAPI染色。箭头显示细胞核固缩的细胞。计算并绘制致密核（n=3）。（E）细胞培养条件与（D）并进行TUNEL染色。箭头表示TUNEL阳性细胞核。对TUNEL阳性细胞核进行计数和绘图（n=3）。（F）成纤维细胞和肌成纤维细胞在CM-con或CM-CCN5中培养，48h后收获细胞，用FACS分析细胞；n=3**p<0.01。TUNEL=末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记；其他缩写，如图2到​到44.

从大鼠心脏中分别获得心肌细胞和成纤维细胞（非肌细胞）组分。通过TGF-β治疗，部分成纤维细胞组分在体外进一步分化为肌成纤维细胞(23). 用抗α-肌动蛋白、波形蛋白和α-SMA抗体对组分进行Western blotting，以确认细胞类型和分化状态(在线图5)在用对照或含有CCN5的条件培养基处理之前。细胞坏死或凋亡的特征是细胞核收缩，这种现象称为固缩。荧光显微镜显示CCN5增加了肌成纤维细胞的固缩，但不增加心肌细胞或成纤维细胞中的固缩(图6D). CCN5也增加了肌成纤维细胞中的TUNEL阳性细胞核，但心肌细胞或成纤维细胞不增加(图6E). 成纤维细胞和肌成纤维细胞接受FACS分析，以量化细胞膜联蛋白V（凋亡标记物）的表面表达。CCN5显著增加annexin V阳性肌成纤维细胞的数量，但对成纤维细胞无影响(图6F). 我们无法获得与心肌细胞一致的FACS数据，可能是因为它们呈杆状（数据未显示）。综上所述，这些结果表明CCN5特异性诱导肌成纤维细胞凋亡。

CCN5触发成肌细胞凋亡的内在途径

为了进一步表征CCN5诱导的肌成纤维细胞凋亡，按照上述方法制备细胞，并用含有CCN5的条件培养基培养1或2天。Western blotting显示CCN5治疗后，抗凋亡分子Bcl-2的表达较低，促凋亡分子BAX的表达较高。执行者半胱天冬酶3和7被CCN5激活，如其裂解所示。这些数据进一步支持了CCN5诱导肌成纤维细胞凋亡的说法。虽然caspase 8参与外源性途径，但caspase 9参与内源性凋亡途径。CCN5诱导了caspase 9的激活，但没有激活caspase 8，表明CCN5可诱导细胞凋亡的内在途径(图7A). 线粒体释放细胞色素c是凋亡细胞死亡内在途径的另一个标志(24). 肌成纤维细胞免疫染色显示CCN5治疗后细胞色素c释放增加(图7B).

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CCN5触发内在凋亡途径

（A）用抗凋亡标记蛋白抗体对培养在CM-Con或CM-CCN5中的肌成纤维细胞的总细胞裂解物进行免疫印迹。（B）肌成纤维细胞在与A类并用抗细胞色素c和抗VDAC染色。箭头表明细胞色素c释放。（C）使用NFκB、波形蛋白和α-SMA抗体对成纤维细胞和肌成纤维细胞进行Western印迹。（D）用NFκB报告质粒pBIIx和pRenilla与pcDNA（空质粒）或pcDNA-hCCN5（CCN5质粒）共同转染成纤维细胞和肌成纤维细胞。启动子活性通过测量双核糖核酸酶活性来确定（n=4）。（E）肌成纤维细胞在与B类并用NFκB抗体染色**p<0.01。VDAC=电压依赖性阴离子通道；中的其他缩写图1,​,2,2，以及​和44.

肌成纤维细胞的抗凋亡分子NFκB的表达水平高于成纤维细胞(图7C). 我们推断需要更高水平的NFκB来维持易凋亡的肌成纤维细胞的生存能力。与此假设一致，CCN5显著降低了肌成纤维细胞中NFκB的高转录活性(图7D). NFκB在细胞核中发挥抗凋亡作用。CCN5治疗后，NFκB在肌成纤维细胞中的核定位完全逆转(图7E). 这些数据表明，CCN5可能通过抑制NFκB的核定位而诱导肌成纤维细胞凋亡。

讨论

CCN家族由6种分泌的基质细胞蛋白组成，其中CCN2最具特征，在包括肝脏和肾脏在内的多种组织中具有显著的促纤维化活性(25). 我们之前报道过CCN2在心脏中是促肥大和促纤维化的，而CCN5是抗肥大和抗纤维化的。CCN2和CCN5在心肌肥厚的进展和消退过程中以相反的方式调节，表明CCN2与CCN5对病理条件下的心脏重塑起“拖船”作用。

在这项研究中，我们专注于特定的抗纤维化机制，并表明AAV介导的CCN5递送使压力过载诱导的HF小鼠模型中的既定CF回归。该观察结果与以前的报告一致，该报告显示CF在某些情况下是可逆的(26,27). 然而，在这些先前的研究中，尚不清楚CF是仅仅防止了进一步恶化，还是真正逆转了。在目前的研究中，我们清楚地表明，CCN5通过三色染色和CCN5基因转移前后肌成纤维细胞含量的分析逆转了已建立的CF(图2).

内皮细胞通过EndMT为衰竭心脏和其他成人纤维化条件下扩张的成纤维细胞群提供了重要的细胞来源(14,28). 此外，成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞在CF的进展中起着重要作用。我们的数据表明，CCN5在体内外均能抑制EndMT和成纤维细胞向肌纤维细胞的转分化(图4和​和5）。5). 以前的研究表明TGF-β信号通路参与EndMT和成纤维细胞转分化。我们发现CCN5抑制这一途径(图3)表明CCN5通过抑制TGF-β信号通路阻断EndMT和成纤维细胞转分化。此外，CCN5诱导肌成纤维细胞凋亡(图6和​和7）。7). 据我们所知，这项研究是第一份显示肌成纤维细胞在CF回归过程中丢失的报告。TGF-β在保护大鼠肺成纤维细胞免受白细胞介素-1β诱导的凋亡中的作用以前有报道(29). 因此，CCN5可能通过抑制TGF-β信号间接诱导肌成纤维细胞凋亡(中央插图). 除了抑制TGF-β信号通路的功能外，CCN5还被认为通过其他机制发挥其功能。

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CCN5逆转既定心肌纤维化：对心肌的影响

CCN5通过抑制EndMT和成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化来发挥其抗CF作用。此外，CCN5在肌成纤维细胞中特异性地诱导细胞凋亡。CCN5通过抑制TGF-β信号通路至少部分地调节这些功能。CF=心脏纤维化；EndMT=内皮-间充质转化；TGF=转化生长因子。

肌成纤维细胞是一种天生不稳定的细胞，在病理条件下会瞬间生成，一旦病理刺激消除，它们必须迅速被破坏。我们认为，在肌成纤维细胞的激活状态下，生存和死亡信号通路微妙地平衡，这种平衡的紊乱可能导致肌成纤维纤维细胞的凋亡。我们发现促凋亡分子p53在肌成纤维细胞中的表达升高（数据未显示）。抗凋亡分子NFκB水平升高可抵消与p53水平升高相关的凋亡。CCN5不影响p53的表达或活性（数据未显示），但抑制NFκB信号传导(图7). CCN5介导的肌成纤维细胞凋亡可能涉及更多促凋亡和抗凋亡分子。需要进一步深入研究，以更详细地解决这一问题。

除了减少肌成纤维细胞的数量外，CCN5还降低了胶原蛋白和相关细胞外基质蛋白的水平。这可以用基质金属蛋白酶（MMPs）活性增加和/或金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）活性降低来解释(30). 我们发现CCN5上调MMP-2、MMP-3和MMP-9，而CCN5下调TIMP2、TIMP3和TIMP4(在线图6). CCN5还使心脏成纤维细胞中TGF-β诱导的Akt和雷帕霉素哺乳动物靶点（mTOR）的过度磷酸化正常化，这与肺成纤维细胞的观察结果一致(在线图7).

研究限制

本研究中使用的小鼠模型涉及一种广泛用于HF临床前研究的手术过程。尽管该模型显示了一系列典型的HF表型，但它可能仅代表HF的急性模型。在临床场景中，CF（尤其是非分离性CF）通常与长期发展的HF有关。因此，可能有必要测试CCN5在更多慢性心衰模型中的疗效。例如，一项为期4-6个月的低强度TAC方案可能会提供这样的慢性模型。值得注意的是，CCN5提高了受TAC影响长达4.5个月的小鼠的存活率(在线图8).

结论

我们的数据表明，CCN5可能通过抑制EndMT和成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞的能力，以及其特异性增加肌纤维细胞凋亡的能力，逆转HF小鼠模型中建立的CF。总之，CCN5的这些作用导致心肌中肌成纤维细胞数量减少，导致CF逆转。尽管需要进一步研究以充分了解分子机制，但我们认为CCN5通过抑制TGF-β信号通路发挥这些作用，至少部分是这样的(中央插图). CCN5可能是CF新疗法开发的新靶点。

​

视角

医学知识能力

CF在几种心脏病中发展，包括HF、室性心律失常和心房颤动。基质细胞蛋白CCN5可以逆转临床前模型中的纤维化。

翻译展望

需要进行临床研究来评估CCN5对HF和其他与进行性纤维化相关的心脏病患者的疗效和安全性。

补充材料

在线数据

单击此处查看。（180万，docx）

致谢

Kho博士得到了国家卫生研究院拨款R00116645的支持。D’Escamard博士得到了美国国立卫生研究院T32HL007824的资助。科瓦契奇博士得到了美国国立卫生研究院K08HL111330的资助和阿斯利康的资助。Hajjar博士由NIH拨款R01 HL117505、HL093183和P50 HL112324以及国家心脏、肺和血液研究所纳米技术卓越项目HHSN268201000045C资助。Park博士获得了美国国家研究基金会生物与医疗技术发展项目拨款NRF-2015 M3A9E6028951和全球研究实验室项目拨款M6-0605-00-0001的支持；由韩国政府资助，并由光州科学技术研究所（GIST）提供的系统生物学基础设施研究所拨款。

缩写和缩略语

AAV公司腺相关病毒
穿越火线心脏纤维化
结束MT内皮-间充质转化
FACS公司荧光激活细胞分选
HCAEC公司人冠状动脉内皮细胞
高频心力衰竭
低压左心室/心室
节气门执行器控制主动脉横缩
隧道末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记

附录

对于展开的“材质”部分和补充表格和图表，请参阅本文的在线版本。

脚注

哈贾尔博士拥有Celladon和Nanocor的所有权。哈贾尔博士和帕克博士在贝思哈根拥有共同所有权。所有其他作者都报告称，他们与本文要披露的内容无关。

工具书类

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