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植物生理学。2000年1月；122(1): 189–198.
数字对象标识：10.1104页/第122.1.189页
预防性维修识别码：项目编号58857
PMID：10631262

一种小的热休克蛋白与热休克蛋白70系统合作，使热变性蛋白重新活化1

加勒特·J·李2和伊丽莎白·维林*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

小分子热休克蛋白（sHsps）是一类广泛存在于原核生物和真核生物中的热诱导蛋白，在植物中尤为丰富。最近的体外数据表明，sHsps作为分子伴侣，通过结合非天然中间体来阻止蛋白质的热聚集，然后这些中间体可被其他伴侣以依赖ATP的方式折叠。我们使用与豌豆结合的热变性萤火虫荧光素酶（Luc）(豌豆)Hsp18.1是一个模型，用于定义sHsp-结合底物重折叠所需的最小伴侣系统。与Hsp18.1结合的热激活Luc可以用来自不同真核生物的Hsc/Hsp70以及DnaJ同源物Hdj1和Ydj1（最大值=97%Luc活化k个对象= 1.0 × 10−2/min），或原核生物大肠杆菌DnaK加上DnaJ和GrpE（100%Luc重新激活，k个对象= 11.3 × 10−2/最小值）。此外，我们还表明Hsp18.1在阻止Luc热聚集方面比Hsc70或DnaK系统更有效，并且Hsp18.提高了重折叠Luc的产量，即使在热失活期间存在其他伴侣。这些发现将sHsps的聚集-反应活性与Hsp70系统的蛋白折叠活性结合起来，并定义了一个体外系统，用于进一步研究sHsp的作用机制。

植物和其他生物通过热休克蛋白（Hsps）的诱导对高温胁迫作出反应(林奎斯特和克雷格，1988年;维林，1991年)，其中一些现在被认为是分子伴侣(乔治普洛斯和韦尔奇，1993年;亨德里克和哈特，1993年;Boston等人，1996年). 虽然分子伴侣在结构上是多样的，但它们具有结合其他非天然结构状态蛋白质的特性，从而促进许多基本的细胞过程，包括蛋白质折叠、靶向和降解。在高温应激期间，分子伴侣被认为可以防止不可逆的蛋白质变性，否则会对细胞有害(帕塞尔和林德奎斯特，1993年). 一些伴侣的结构和机制，如Hsp70和GroE（或Hsp60），已经被广泛研究(布考和霍维奇，1998年)，对其他Hsps的作用知之甚少，尤其是小Hsps（sHsps），它们是植物合成的最丰富多样的Hsps(Waters等人，1996年). 明确sHsps的功能对于理解植物对高温胁迫的反应显然至关重要。

植物sHsps是在真核生物和原核生物中都保守的一组不同蛋白质的成员(Gaestel等人，1997年;Vierling，1997年)并与特征氨基酸基序共享约100个残基的羧基末端结构域(Plesofsky-Vig等人，1992年;deJong等人，1993年;Waters等人，1996年;Gaestel等人，1997年). 虽然sHsps的单体分子量在15到40 kD之间，但它们通常在天然状态下形成9到32个亚基的低聚物，低聚物大小特定于单个sHsp。植物sHsps可分为至少五个基因家族，两个在细胞质中发现的蛋白质家族（I类和II类），以及三个细胞器定位的家族（线粒体、叶绿体和内质网）(Waters等人，1996年).

最近，我们和其他人提出了一个sHsps分子伴侣活性的模型(Waters等人，1996年;Ehrnsperger等人，1997年;Lee等人，1997年;Veinger等人，1998年). 该模型提出，sHsps作用于结合非天然蛋白质，阻止其聚集，并使其保持在能够被其他伴侣进行ATP依赖性重折叠的状态。多项研究支持该模型的第一部分。使用来自多种生物体的sHsps进行的体外实验表明，sHsps通过一种与ATP无关的机制，在防止其他蛋白质热聚集方面特别有效(霍维茨，1992年;Jakob等人，1993年;Jinn等人，1995年;Chang等人，1996年;Kim等人，1998年). 我们对豌豆的这种活性进行了表征(豌豆)Hsp18.1是一种十二烷基、细胞溶质、I类sHsp，使用一系列热敏模型蛋白作为底物(Lee等人，1995年,1997). 当苹果酸脱氢酶、柠檬酸合成酶、甘油醛-3-P脱氢酶或萤火虫荧光素酶（Luc）在Hsp18.1存在下被热失活时，它们结合sHsp并形成可溶性高-M（M）第页复合物。相反，在没有sHsps的情况下，这些热敏蛋白形成不溶性聚集体。

对模型第二部分的支持是非常有限的，即sHsp-结合蛋白是其他伴侣加ATP进行重折叠的有效底物。Ehrnsperger等人（1997年）据报道，与小鼠Hsp25结合的热失活柠檬酸合成酶在牛Hsp70和ATP存在下可以部分被激活。然而，需要2个多小时才能达到低于15%的再激活率，这意味着仅需2.5倍于自发复性的刺激。我们报告称，在ATP依赖反应中，完全网织红细胞裂解物可以迅速将已热变性并与豌豆Hsp18.1络合的Luc重新激活至初始活性的40%以上(Lee等人，1997年). 小麦胚芽裂解液对Luc复性也有效。然而，两种裂解物的活性成分均未定义。

由Forreiter等人（1997年），who显示，当原生质体首次用指导Hsp70和sHsp表达的质粒转染时，在拟南芥细胞中表达的Luc在体内保持更高的活性并从热变性中更快地恢复。Goloubinoff及其同事的实验(Veinger等人，1998年)将sHsp模型扩展到原核生物，并对其伴侣功能进行了研究大肠杆菌sHsp-IbpB。他们的实验表明，通过从IbpB传递到原核Hsp70系统（DnaK、DnaJ和GrpE系统），可以重新激活高达85%与IbpB结合的苹果酸脱氢酶(Liberek等人，1991年)然后进入GroE，执行ATP依赖性蛋白质折叠。

我们寻求进一步支持sHsp功能模型，并更精确地定义与真核sHsp结合的热变性蛋白质有效重折叠的伴侣要求。为此，我们使用热变性Luc与豌豆Hsp18.1复合物作为体外蛋白质折叠重建的底物。虽然Luc不是一种植物蛋白，但由于Luc活性的高灵敏度测定方法的可用性，Luc已被广泛用作体外蛋白质折叠的模型底物(舒马赫等人，1994年;Levy等人，1995年;Buchberger等人，1996年)，并已在原核生物体内进行了研究(Schröder等人，1993年)，只动物(Nguyen等人，1989年;Pinto等人，1991年;Prip-Buus等人，1996年)和，如上所述，在植物中(Forreiter等人，1997年). 这些数据，以及Luc在中等温度（39°C–42°C）下失活的事实，对应于植物中Hsp诱导的温度(维林，1991年)，使Luc成为伴侣研究的优秀模型蛋白。

我们的报告显示，在需要真核生物Hsc70/Hsp70、共伴侣蛋白的反应中，80%以上的热失活Hsp18.1结合的Luc可以被重新激活(卡普兰等人，1993年;《银与路》（Silver and Way），1993年)和ATP。原核Hsp70（DnaK）系统的再活化甚至更有效（100%产率），这表明重折叠机制不需要sHsps和Hsp70系统之间的特定相互作用。我们还定义了sHsps和Hsc70/Hsp70系统在防止蛋白质聚集和促进重折叠方面的功能差异。这些数据扩展了sHsp功能的模型，并定义了一个体外系统，用于进一步研究sHsp作用的机制。

材料和方法

材料

ATP二钠盐、牛血清白蛋白（BSA）（编号A-3803）、蛋白A琼脂糖（编号P-7786）、apyrase和试剂级牛或兔IgG购自Sigma（圣路易斯）。磷化氢烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶来自Boehringer Mannheim（巴塞尔）。重组萤火虫荧光素酶购自Promega（威斯康星州麦迪逊），兔网织红细胞裂解物购自Green Hectares（威斯康辛州俄勒冈州）。

伴侣蛋白质类

重组Hsp18.1表达于大肠杆菌细胞，如前所述进行纯化(Lee等人，1995年;Lee和Vierling，1998年). 重组人Hsc70和Hdj1的质粒构建物来自R.Morimoto博士（伊利诺伊州埃文斯顿西北大学），表达于大肠杆菌，以及如前所述纯化的蛋白质(Freeman等人，1995年). 人类啤酒花、Hsp90和酵母Ydj1由D.Toft博士（明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所）提供。酵母Ssa1由J.Glover博士和S.Lindquist博士（芝加哥大学霍华德·休斯医学研究所）提供。质粒构建用于大肠杆菌DnaK和DnaJ（日内瓦大学C.Georgopoulos博士的礼物）以大肠杆菌，以及如前所述纯化的蛋白质(塞吉尔斯卡和乔治波卢斯，1989年;Zylicz等人，1989年).大肠杆菌GrpE购自StressGen Biotechnologies（不列颠哥伦比亚省维多利亚市）。

小麦胚芽Hsp70是从一家杂货店购买的小麦胚芽中分离出来的，用研钵、杵和沙子将其碾碎25米米Tris，pH值7.5。澄清提取物在20%至50%（w/v）硫酸铵之间沉淀，再悬浮，并在25 m处透析米特里斯，50米米NaCl，pH 7.5，然后通过DEAE Sepharose快速流动色谱分离米NaCl梯度。如前所述，通过ATP-琼脂糖（C-8连锁，Fluka，Milwaukee，WI）色谱进一步纯化Hsp70(Freeman等人，1995年)，然后在强阴离子交换HPLC柱（美国马萨诸塞州沃本Rainin Instrument）上用0至0.4的米NaCl梯度。

以BSA为标准，采用Bio-Rad蛋白质分析法（加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad实验室）测定蛋白质浓度。文本和图中的Hsp18.1浓度指的是12亚单位低聚物。Luc和所有其他伴侣蛋白的浓度指单体。

sHsp/荧光素酶复合物的形成

Hsp18.1/Luc复合物基本上如前所述形成(Lee等人，1997年;Lee和Vierling，1998年)加热1μ米1μLuc米25 m内的Hsp18.1（50μL）米4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），5 m米氯化镁2，150米米KCl和2 m米二硫苏糖醇，pH 7.5（变性缓冲液），在42°C的硅化0.65-mL试管中放置8分钟。加热后，立即将样品在冰上冷却30 s。当在ATP存在下形成复合物时，向样品补充2 m米ATP和加热时间延长至30分钟。根据尺寸排除色谱法测定，在这些反应中，只有不到5%的Luc保持自由状态(Lee等人，1997年). 如有指示，Hsp18.1替换为2μ米DnaK，0.4μ米DnaJ和0.8μ米组E。

Luc折叠实验

如上所述制备Hsp18.1/Luc复合物或在DnaK、DnaJ和GrpE存在下加热的Luc。通过添加复合物（25 n米Luc）至50%（v/v）兔网织红细胞裂解物或在50 m变性缓冲液中指示浓度的各种伴侣组合米KCl（而不是150 m米)加上2米米30°C时，在0.65-mL硅化试管中加入ATP（总浓度为40-μL）。当用纯化的伴侣取代网织红细胞裂解物时，样品中补充新鲜制备的0.5 mg/mL BSA以防止Luc吸附到试管中，Hsc70/Hsp70/Ssa1、Hop或Hsp90的浓度分别为1.5、0.3或1.5μ米Hdj1或Ydj1的浓度分别为0.15或0.30μ米如图所示。IgG的浓度为1.25 mg/mL。使用DnaK系统时，DnaK、DnaJ和GrpE的浓度分别为1.5、0.3和0.6μ米KCl浓度为150 m米Luc活性通过向50μL荧光素酶测定混合物（Promega）中添加2.5μL重折叠反应并在TD-20/20光度计（加利福尼亚州桑尼维尔特纳）中监测发光来测定。Luc活性表示为相对于在形成Hsp18.1/Luc复合物的加热步骤之前测得的等量天然Luc的百分比。

对于图中所示的实验​图4A，4A、 1μ米将Luc与50%（v/v）兔网织红细胞裂解液混合，加入或不加入0.5μ米50 m变性缓冲液中的Hsp18.1米KCl包含由2 m组成的ATP再生系统米ATP，10米米磷烯醇丙酮酸和0.2单位的丙酮酸激酶。将50μL样品在42°C下加热15分钟，然后转移到30°C。在测量Luc活性之前，首先将等分样品以1:50的比例在20m的1mg/mL BSA中稀释米HEPES和50 m米氯化钠，pH值7.5。对于图中所示的实验​图4B，4B、 网织红细胞裂解物被2μ米DnaK/0.4μ米DnaJ/0.8μ米GrpE或1μ米Hsp18.1，或DnaK和sHsp系统相结合，KCl浓度为150 m米.

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Hsp18.1增强网织红细胞裂解物和DnaK系统重折叠Luc的能力。A、 1μ米在ATP存在的情况下，将Luc与50%（v/v）网织红细胞裂解物（RL，？）或0.5μ米Hsp18.1/50%（v/v）网织红细胞裂解物（Hsp18.1+RL，●），在42°C下加热15分钟，然后移至30°C以允许复性。B、 将含有ATP的Luc与Hsp18.1（○）、DnaK/DnaJ/GrpE（KJE，▴）或Hsp18.1/DnaK/DnaJ/GerpE（Hsp18.1+KJE）混合，变性30分钟，然后转移到30°C以允许复性。B中的浓度为1μ米Luc，1μ米Hsp18.1，2μ米DnaK，0.4μ米DnaJ和0.8μ米组E。

数据点和相关误差条表示平均值和标准偏差至少重复三次。通过使用最小二乘法将数据点拟合到单指数方程，确定表观最终Luc复性产率和速率常数。相关误差反映了最小二乘分析中得出的误差。所有分析中的Luc再活化率均遵循伪一级动力学(R（右）≥ 0.988).

Luc聚合

Luc（1μ米）加热0.7μ米Hsp18.1，2μ米DnaK/0.4μ米DnaJ/0.8μ米GrpE，2μ米Hsc70/0.2μ米Hdj1/0.2μ米Ydj1或0.80mg/mL IgG，在2 m米ATP在42°C下保持30分钟，如复合物形成所述。加热后，样品（50μL）在16250下离心15分钟克并去除上清液部分。上清液和颗粒组分均用SDS样品缓冲液处理，并通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色进行分析。

免疫沉淀

在免疫沉淀之前，样品用0.5单位的apyrase耗尽ATP。样品用蛋白A琼脂糖与兔抗Luc IgG（加州圣莱安德罗Cortex Biochem）或同等重量的非特异性兔IgG在冰上沉淀30分钟。样品用25m水洗三次米HEPES，200米米NaCl和0.5%（v/v）Triton X-100，pH 7.5。样品用SDS样品缓冲液处理，用SDS-PAGE分离，然后用化学发光法（Amersham-Pharmacia Biotech，Uppsala）检测到的抗-Luc、抗-Hsp18.1或抗-Hsc70（StressGen Biotechologies）抗体进行western-blot分析。

结果

真核或原核Hsp70和辅酶肽支持Hsp18.1/Luc复合物的高复性产率

为了确定sHsps促进变性蛋白质复性的基本机制，我们试图利用其他已知的真核生物分子伴侣结合豌豆Hsp18.1重建复性系统。由于我们之前的实验表明，网织红细胞裂解物可以有效地完成Luc重折叠(Lee等人，1997年)，我们首先测试了裂解物中存在的Hsc/Hsp70是否对复性活性至关重要。免疫耗竭实验证实，在裂解物支持的反应中，Hsp18.1/Luc复合体的Luc活化需要Hsc/Hsp70（数据未显示）。

然后，我们评估纯化的Hsc70是否能够重新激活与Hsp18.1结合的Luc。当Hsp18.1/Luc复合物被添加到过量的人类Hsc70和ATP中时，基本上没有观察到Luc再活化（图。​（图1）。1). 相反，当1.5μ米Hsc70补充0.3μ米Hsc/Hsp70-DnaJ共同伴侣人类Hdj1或酵母Ydj1，这是Hsp70-ATP酶最大活性所必需的(卡普兰等人，1993年;《银与路》（Silver and Way），1993年)，可以恢复显著的Luc活性。曲线拟合表明最终收率为64%或50%，速率常数为0.4×10−2或1.5×10−2最小值−1分别添加Ydj1的Hdj1（表​（表一）。我). 令人惊讶的是，当两个DnaJ同源物与Hsc70结合时，观察到重折叠产率显著提高（图。​（图1）。1). Hdj1和Ydj1的组合（均为0.15μ米)支持97%Luc活性的外推终点产率（表​（表一）。我). Luc复性的增强并不是由于Hsc70与Hdj1或Ydj1的比值增加，因为在0.15或0.3μ米Hdj1或Ydj1分别添加至1.5μ米Hsc70（数据未显示）。

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网织红细胞裂解物和真核伴侣对Hsp18.1结合的Luc的复性。Hsc70（▵）中添加了Hsp18.1/Luc，Hsc70/Hdj1(♦), Hsc70/Ydj1（□）、Hsc70/Hdj1/Ydja（▴）或50%（v/v）网织红细胞裂解物（○），并允许在30°C下折叠。浓度为：25 n米Hsp18.1/Luc，1.5μ米Hsc70，0.30μ米Hdj1，0.30μ米Ydj1或0.15μ米组合使用时，每个Hdj1和Ydj1。

表一

真核生物折叠组分存在下的表观Luc重折叠产率和速率常数

折叠部件%收益率k个对象(× 10−2最小值−1)
网织红细胞裂解物79±27.1 ± 0.9
免疫球蛋白G7 ± 1ND（无损检测）
Hsc70型9 ± 1ND（无损检测）
Hsc70、Hdj164 ± 80.4 ± 0.2
Hsc70、Ydj150 ± 11.5 ± 0.1
Hsc70、Hdj1、Ydj197 ± 101.0 ± 0.2
wHsp70、Hdj1、Ydj192 ± 100.8 ± 0.1
Ssa1、Hdj1、Ydj174 ± 31.4 ± 0.2
Hsc70、Hdj1、Ydj1和Hop86 ± 31.7 ± 0.2
Hsc70、Hdj1、Ydj1，啤酒花，Hsp9093 ± 31.7±0.2

Luc（1μ米)加热1μ米Hsp18.1在42°C下无ATP持续8分钟。将加热样品稀释至25 n米将Luc转化为含有所示折叠成分和ATP的复性反应，然后监测Luc的复性，如图所示​图1。1数据点拟合为单指数方程，从中得出终点和观察到的速率常数(k个对象)进行了计算。ND，未确定。折叠成分的浓度为50%（v/v）网织红细胞裂解物，1.5μ米Hsc70、小麦胚芽Hsp70（wHsp70）或酵母Ssa1，0.3μ米Hdj1或Ydj1，或0.15μ米每个Hdj1和Ydj1组合时，0.3μ米啤酒花和1.5μ米Hsp90。

当用等量的小麦胚芽Hsp70取代人类Hsc70时，基本上没有观察到重折叠方面的差异，而酵母Hsp70同源物Ssa1的最终产量较低，但速率常数稍高（表​（表一）。我). 因此，一个高功能的真核生物复性系统可以与植物、人类和酵母伴侣同源物组合而成，而没有明显的物种特异性。这一结果与异源DnaJ蛋白与多种Hsp70蛋白相互作用并刺激ATP水解的能力一致(Kroczynska等人，1996年;Takayama等人，1999年).

我们认为，为了与Hsc70/Hdj1/Ydj1结合进行最佳复性，可能需要添加其他真核伴侣或共同伴侣。在一些细胞过程中，如类固醇激素受体的激活，已知Hsp70在涉及Hsp90和多种共伴侣的大伴侣复合体中起作用，包括Hop（Hsp70–Hsp90组织蛋白）(Frydman和Höhfeld，1997年;普拉特和托夫特，1997年). Hsp90和Hop存在于植物中(Hernandez Torres等人，1995年;Boston等人，1996年)在类固醇受体激活反应中，用小麦胚芽裂解液代替网织红细胞裂解液，证明了植物中也存在同样的伴侣化合物(Stancato等人，1996年). 然而，添加人Hsp90对重折叠的产量或速度没有影响，添加啤酒花和Hsp90的系统只会适度增加重折叠的表观速度常数（表​（表一我).

接下来，我们确定是否可以使用由DnaK、DnaJ和GrpE组成的原核Hsp70系统从这种高等植物sHsp进行复性。有趣的是，与网织红细胞裂解物相比，Hsp18.1/Luc复合物支持DnaK系统更快、更高的复性；100%的原始Luc活性被恢复，观察到的速率常数为k个对象= 11.3 × 10−2/最小值（图。​（图2A）。2A） ●●●●。

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DnaK系统对Hsp18.1-bound Luc的折叠。勒克（1μ米）在1μ的存在下加热米Hsp18.1（Hsp18.1/Luc，●），2μ米DnaK/0.4μ米DnaJ/0.8μ米GrpE（KJE+Luc，▴）或0.21 mg/mL牛IgG（IgG+Luc），在42°C下，在无ATP（A）的情况下保持8分钟，或在有ATP（B）的条件下保持30分钟。含有25 n的样品米然后将Luc添加到1.5μ米DnaK/0.3μ米DnaJ/0.6μ米GrpE和ATP，并允许在30°C下折叠。

Hsp70体系在保持折叠能力和底物溶解度方面不能替代sHsp活性

与sHsps一样，DnaK系统先前已被证明可以防止Luc的热聚集(Schröder等人，1993年). 由于这种明显的活动重叠，我们想确定哪些功能属性将sHsps与DnaK和Hsp70系统区分开来。为了研究这一点，首先使用DnaK系统（DnaK/DnaJ/GrpE，2.0:0.4:0.8μ米)使用了，而不是1μ米Luc失活期间的Hsp18.1（42°C持续8分钟，减去ATP）。在稀释到过量的DnaK系统中后，在没有ATP的情况下用DnaK/DnaJ/GrpE加热Luc，使其重新折叠到相对于在有sHsps的情况下加热的Luc活性的三分之一以下（100%对29%）（图。​（图22A） ●●●●。

由于DnaK的伴侣活性依赖于ATP(Wawrzynów等人，1995年)，使用添加了ATP的加热反应重复实验（图。​（图2B）。2B） ●●●●。研究发现，ATP是一种Luc底物，在加热过程中可以稳定Luc，因此，需要在42°C下30分钟才能使Luc失活，达到与没有ATP时相似的程度（约为原始活性的5%）。当添加ATP的样品用过量的DnaK/DnaJ/GrpE复折时，在sHsp存在下加热的Luc产生的Luc活性至少是在DnaK/DnaJ/GerpE存在下加热Luc活性的两倍（84%对37%）（图。​（图22B） ●●●●。

因为保护底物免受聚集是另一种检测sHsps伴侣活性的方法(Lee等人，1997年)，我们分析了Hsp18.1和Hsp70系统在这类检测中的相对有效性。比较了与Hsp18.1、Hsc70/Hdj1/Ydj1或DnaK/DnaJ/GrpE等重相关的聚集保护程度。Luc首先在Hsp18.1或其中一个Hsp70系统存在的情况下用ATP加热（与图中使用的条件相同）。​图2B），2B） 然后将样品离心至颗粒不溶性Luc，并用SDS-PAGE进行分析。几乎所有在Hsp18.1存在下加热的Luc都保持可溶（图。​（图3）。三). 相比之下，几乎所有在Hsc70/Hdj1/Ydj1存在下加热的Luc都被分割成球团部分，而在DnaK/DnaJ/GrpE存在下加热后的Luc在上清液和球团部分之间的分割大致相同（图。​（图3）。三). 因此，复性的产量反映了不同伴侣系统对Luc聚集的保护作用。

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Hsp18.1保持了比Hsp70系统更高的Luc溶解度。Luc（1μm）在有ATP和0.7μ米Hsp18.1，2μ米Hsc70/0.15μ米Hdj1/0.15μ米Ydj1（70J），2μ米DnaK/0.4μ米DnaJ/0.8μ米GrpE（KJE）或0.21 mg/mL牛IgG在42°C下保持30分钟。样品在16250下离心15分钟克，分离成上清液（S）或沉淀（P）级分，然后通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色进行分析。Hsp18.1带看起来很窄，因为它们在缓冲区前沿被压缩。

Hsp18.1在加热过程中与网织红细胞裂解物或DnaK系统结合也能增强复折叠

接下来，我们询问，在与细胞中发现的情况更为相似的条件下，即当加热过程中存在Hsp70系统和sHsp，并且在不稀释和添加多余伴侣的情况下进行复性时，sHsps是否也能增强Luc的复性。尽管网织红细胞裂解物中存在广泛的内源性伴侣网络，但0.5μ米Hsp18.1还增强了在50%（v/v）网织红细胞裂解液中直接热变性的Luc的复性（图。​（图4A）。4A） ●●●●。考虑到热变性15分钟后5%的残余Luc活性，添加Hsp18.1使Luc活化量比单独使用裂解物时增加了一倍。

我们也在原核系统中解决了这个问题。Luc（1μ米)在42°C下，在1μ米Hsp18.1加上DnaK/DnaJ/GrpE（2.0:0.4:0.8μ米)和ATP，然后冷却到30°C以启动Luc复性。在这些条件下，Hsp18.1的加入显著提高了反应产率；与仅含有DnaK系统的样品相比，含有Hsp18.1的样品中Luc活性的回收率高出2倍以上（图。​（图44B） ●●●●。

加热步骤后立即用抗Luc IgG进行免疫沉淀，以评估当网织红细胞裂解物或纯化的DnaK组分和ATP在加热过程中也存在时与Hsp18.1结合的Luc的相对量（图。​（图5）。5). 在网织红细胞裂解物中，内源性Hsc70和Hsp18.1在加热后立即与Luc相关（图。​（图5A），5A） 表明这两种伴侣都参与了热变性Luc的稳定。将来自免疫沉淀物的western blot信号与纯化蛋白标准品的western-blot信号进行比较表明，Luc、Hsp18.1和Hsc70的重量大致相等（未显示）。在DnaK系统存在的情况下，还发现Hsp18.1与Luc相关（图。​（图5B）5B） 而且，与没有DnaK系统的情况相比，DnaK的存在并没有显著减少发现的与Luc相关的Hsp18.1的数量。无法确定与DnaK相关的Luc量，因为DnaK与IgG-偶联蛋白A树脂非特异性结合（未显示）。

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Hsp18.1在其他伴侣存在下结合热变性Luc。A、 与图中相似的示例​图4A4将含有Luc和网织红细胞裂解物（RL）并添加或不添加Hsp18.1的A在42°C和ATP存在下加热15分钟。B、 与图中相似的示例​图4B4将含有Luc和Hsp18.1的B（无论是否含有DnaK系统（KJE））在有ATP的情况下在42°C下加热30分钟。加热后，用抗-Luc-IgG（α-Luc）或非特异性兔IgG（模拟）免疫沉淀Luc。免疫沉淀物通过western blot分析是否存在Luc、Hsp18.1或Hsc70。Luc和Hsp70以下的带是IgG重链。

讨论

目前从体外研究中得出的模型表明，sHsps通过结合热变性底物防止不可逆底物聚集，然后将底物呈现给其他细胞成分进行ATP依赖性复性(Waters等人，1996年;Ehrnsperger等人，1997年;Lee等人，1997年;Veinger等人，1998年). 我们的数据在几个重要方面扩展了sHsp伴侣活性的模型。首先，我们确定Hsp18.1结合Luc的高水平复性所需的伴侣是Hsp/Hsc70加DnaJ同源物。添加Hsp90和Hop对复性的促进作用很小，甚至没有进一步增强。尽管Hsp18.1来源于真核细胞，但当Hsp18.1在原核DnaK系统存在下重新激活时，观察到最高的Luc重折叠率。这些发现表明，sHsp与Hsp70系统协同作用的机制在真核生物和原核生物中普遍存在，并表明sHsp可能不会与Hsp70-系统发生物理相互作用。此外，本研究还阐明了在热变性过程中，sHsps和Hsp70系统在保护底物方面的活性之间的区别。sHsps明显增强了底物活性的恢复，即使存在其他伴侣，这也是细胞内的典型情况。此外，与Hsp70系统相比，sHsps具有更高的表观底物容量，并且与Hsp七十系统不同，底物保护与ATP无关。

在定义sHsp-binded Luc重折叠的最小成分时，我们发现DnaJ同源物与真核生物Hsp70有严格的要求。Ehrnsperger等人（1997年）在没有DnaJ同源物的情况下，将小鼠Hsp25/柠檬酸合成酶复合物与牛Hsp70孵育时，观察到少量柠檬酸合酶重新激活。DnaJ同源要求的差异可能反映了所用底物和/或sHsps本身的差异，也可能是这些研究人员报告的低复性产率的原因。其他几项研究报告了DnaJ同源物刺激真核生物Hsp70介导的化学和热变性蛋白质的重折叠的绝对需求(Freeman和Morimoto，1996年;舒马赫等人，1996年;约翰逊等人，1998年). 我们还发现，与单独使用DnaJ蛋白相比，Hdj1和Ydj1这两个DnaJ同源物的存在显著提高了Luc复性的速度和产量。不同DnaJ蛋白对Hsp70功能的加性活性以前还没有报道。这种效应可能是由两种DnaJ蛋白之间的结构差异引起的。Ydj1、Hdj2和DnaJ都具有富含Cys的区域，在DnaJ中形成锌指基序，能够与非天然底物相互作用(Szabo等人，1994年). 相比之下，Hdj1缺少此域。Hdj1和Ydj1可能与Hsc/Hsp70结合，稳定不同的Luc中间体或以不同的方式调节Hsc/Hsp70 ATP酶，以便能够重新激活更广泛的非天然Luc中间体。

我们的重组Hsc70/Hdj1/Ydj1系统与完全网织红细胞裂解液的最终Luc产量相匹配，但操作速度低7倍。我们预计，添加其他伴侣或共同伴侣将增加该纯化系统的复性率；约翰逊等人（1998）发现热变性Luc经Hsc70和Ydj1的复性受到Hop和Hsp90的刺激。然而，在我们的系统中，添加Hop或Hsp90几乎没有影响。此外，我们发现Hsp90特异性抑制剂格尔达霉素(Whitesell等人，1994年)不影响网织红细胞裂解物中Hsp18.1/Luc复合物的复性（G.J.Lee和E.Vierling，未发表的观察结果），进一步支持了我们系统中对Hsp90的需求不足。底物的特性或性质可能决定折叠是否需要Hop和Hsp90。例如，在我们的研究中，Luc以Hsp18.1/Luc复合物的形式添加到复性成分中，而在约翰逊等人（1998），Luc以热变性、聚集-脯氨酸形式添加。对于后一种形式的Luc，Hop和Hsp90可能有助于稳定初始折叠中间体以及在随后的复性步骤中协助Hsc70。总之，我们的结果表明，需要其他未经鉴定的成分才能使结合sHsp-Luc的真核Hsp70达到最佳的复性速率。鉴于调节真核细胞Hsp70活性的新蛋白质的不断发现，这并不奇怪(Takayama等人，1999年). 或者，Hsp70/Hdj1/Ydj1-Luc复性的反应条件尚未优化，或者可能需要一个完全同源的真核生物系统才能达到最大速率。

尽管sHsps和Hsp70系统在防止蛋白质热聚集方面具有共同的能力，但Hsp18.1似乎比单纯的Hsp70体系更有效。Luc的等摩尔Hsp18.1低聚物足以几乎完全阻止Luc在热变性过程中的聚集。先前单独使用Hsp70系统的研究仅在大摩尔过量的Hsc70/Hdj1（分别为47倍和32倍）的情况下实现了Luc保护(Minami等人，1996年)或DnaK/DnaJ（分别为5倍和2倍）(Schröder等人，1993年). 这些观察结果与我们之前的研究结果一致，即Hsp18.1的结合能力非常大，在苹果酸脱氢酶的情况下，每个Hsp18.亚单位最多可以结合一个苹果酸脱氢亚单位(Lee等人，1997年)，相当于基质质量的两倍于sHsp。其他研究也观察到各种不同生物体中sHsps和相关α-晶体蛋白的高底物结合能力(霍维茨，1992年;Chang等人，1996年;Ehrnsperger等人，1997年;Leroux等人，1997年). 这种高底物容量与仅结合单一底物多肽的Hsp70结合底物形成鲜明对比(Palleros等人，1991年)或GroEL，每个低聚物最多可结合两个多肽(Hartl，1996年).

在热变性和复性期间将Luc、Hsp18.1和网织红细胞裂解物或DnaK系统放在一起的实验中，也观察到Hsp18.对Luc再激活的积极作用。这些实验消除了特定的预先形成的配合物有序添加到过度复性系统中。在这些实验中，我们发现DnaK单独能够稳定和折叠LucSchröder等人（1993）然而，Hsp18.1显著增强了DnaK介导的Luc复性，产率大于80%。当网织红细胞裂解物补充Hsp18.1时，也观察到类似的效果。虽然我们还没有直接测定热变性Luc对这些混合物中的sHsps和Hsp70的相对亲和力，但Hsp18.1和Hsc70在加热后直接与Luc共沉淀，表明底物与两种蛋白质的结合量相似。

现在可以根据此处提供的数据开发更全面的sHsp活动模型。我们认为，在高温胁迫期间，即使存在其他伴侣，sHsps也会以ATP无关的方式结合底物蛋白，并且特定底物可能优先与sHsps.结合。与Hsc70（或DnaK）系统相比，sHsps对底物的高能力，以及sHsps可以积累到植物总蛋白的1%以上(Waters等人，1996年)和其他单元格(Arrigo和Landry，1994年)，表明sHsps可能是折叠相容性变性蛋白质的重要储存库，正如之前所建议的那样(Waters等人，1996年;Ehrnsperger等人，1997年;Lee等人，1997年).

在真核生物中，底物然后传递给Hsc70和共同伴侣进行ATP依赖性折叠，并且可以与Hsc70系统进行多轮相互作用，以达到最终的自然状态。目前尚不清楚基板转移到折叠系统是否是一个主动过程。然而，原核和真核成分的不同组合能够影响Hsp18.1结合Luc的折叠，尽管效率不同，这表明不需要sHsps本身与折叠系统成分的高度特异性直接相互作用。总之，通过结合sHsps和Hsc70系统的功能特化，可以实现热变性蛋白质的最佳再活化。的数据Forreiter等人（1997年）表明拟南芥原生质体中Hsp70和sHsp的瞬时表达可以增强Luc对热的保护，现在可以用这个模型来解释。我们的重组系统用于sHsp-促进的底物复性，将允许进一步研究这一过程中涉及的机制。

大量数据支持sHsps在获得高温耐热性方面的作用(维林，1991年,1997;Arrigo和Landry，1994年)尽管在某些生物体或某些环境条件下，它们的功能可能与其他细胞成分冗余(佩特科和林德奎斯特，1985年;Servant和Mazodier，1995年;Wotton等人，1996年). 哺乳动物和动物的功能获得实验果蝇属细胞表明，sHsps的组成性表达具有一定的耐热性(Arrigo和Landry，1994年)，以及植物sHsps在大肠杆菌也有报道称可增强耐高温能力(Yeh等人，1997年;Soto等人，1999年). 直接的基因证据来自蓝藻协同孢子虫sp.PCC6803，当其单个sHsp被删除时，其耐热性降低(Lee等人，1998年)、和来自粗糙脉孢菌当Hsp30基因被破坏时，在碳水化合物限制的条件下降低了耐热性(Plesofsky-Vig和Brambl，1995年). 我们的模型可以很容易地解释sHsps在耐热性中的作用，即sHsps阻止其他蛋白质的不可逆热失活。基于体外证据证明，sHsps能够与多种模型底物相互作用(霍维茨，1992年;Jakob等人，1993年;Lee等人，1995年;Chang等人，1996年;Lee等人，1997年;Veinger等人，1998年)sHsp/Hsc70系统可以为许多不同的不耐热蛋白的活化提供一条通用途径。

Hsp18.1仅代表在植物中发现的一类sHsps，即胞体定位的I类蛋白(Waters等人，1996年). 因此，尽管有很好的证据表明Hsp18.1以及来自其他生物体的许多胞质sHsps具有伴侣活性，但缺乏探索其他胞质和细胞器定位类植物sHsps的伴侣活性的数据。豌豆细胞溶质II类蛋白也被证明可以阻止底物聚集，尽管其效果不如Hsp18.1(Lee等人，1995年). 我们的模型能在多大程度上外推到这些其他的sHsps上还有待研究。鉴定关键的体内sHsp底物并确定不同sHsp类别之间的功能差异是解决sHsp在植物耐热性中的作用的重要下一步。

致谢

我们感谢Costa Georgopoulos博士、John Glover博士、Susan Lindquist博士、Richard Morimoto博士和David Toft博士提供质粒构建物和蛋白质。我们感谢Kim Giese博士、Luke Whitesell博士和Bruce Patterson博士对这份手稿的批判性阅读。

脚注

1这项工作得到了美国国立卫生研究院（E.V.批准号：RO1 GM42762，G.J.L.博士后奖学金号：5F32–GM16748）和美国癌症学会教师研究奖（E.V..批准号：FRA–420）的支持。

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文章来自植物生理学由以下人员提供牛津大学出版社