人载脂蛋白E4“结构域的引入与小鼠载脂蛋白E的相互作用

摘要

载脂蛋白E（apoE）是一种参与多种生物的34-kDa血浆蛋白过程，包括血浆脂蛋白代谢(1)，细胞内胆固醇利用(2)，细胞生长(三)，免疫调节(4——6),以及神经元的生长和修复(7). 人类的三种常见亚型apoE-apoE2、apoE3和apoE4-differ位于两个位置(8). ApoE3具有半胱氨酸位于112位，精氨酸位于158位，而载脂蛋白E2两个位置都有半胱氨酸，apoE4有精氨酸。代谢在生理学上，最普遍的同种型apoE3被认为是才能正常。ApoE2降低了对低密度的亲和力脂蛋白（LDL）受体，与III型相关高脂蛋白血症(9). ApoE4与血浆升高有关胆固醇和低密度脂蛋白水平与心血管疾病的易感性和神经变性疾病，包括阿尔茨海默病(9——12). 载脂蛋白E4对脂蛋白代谢影响的机制而神经退化仍然难以捉摸。与apoE2和apoE3不同，apoE4优先与极低密度脂蛋白（VLDL）结合(13——15). 这种偏好有助于加速血浆中的apoE4，导致apoE4水平低于apoE3和载脂蛋白E2及其对血浆胆固醇和低密度脂蛋白水平的影响(13,15).

ApoE具有两个结构域(16,17). 氨基末端结构域（22kDa）包含LDL受体的结合位点，并且羧基末端结构域（12 kDa）包含脂蛋白结合区(8). 虽然这两个领域满足了不同的生物角色，并且可以独立工作在apoE4中相互作用(15,18,19). 定点突变和x射线结晶学研究表明，Arg-61在氨基末端apoE4的域被暴露，允许它与Glu-255在羧基末端结构域，导致结构紧凑。在apoE2和然而，apoE3，Arg-61没有暴露，因此apoE4结构域相互作用（Arg-61和Glu-255之间的相互作用）在这些亚型。人类apoE4中的结构域相互作用被认为是造成不良影响的主要潜在因素这种亚型的(19). 鼠标apoE包含等效的Arg-112和Glu-255，但缺少与Arg-61等效的物质，预计在脂蛋白结合偏好和新陈代谢。所检查的所有其他哺乳动物物种也具有Thr-61，因此，缺乏关键的Arg-61等效物(8).

在本研究中，我们试图将apoE4域相互作用引入到鼠标apoE，提供关键的Arg-61。我们的目标是一个体内适用于检验以下假设的模型电畴相互作用对血浆中apoE4的影响脂蛋白代谢和神经变性。这里，我们报告基因打靶在胚胎干细胞中的成功应用生成显示apoE4域相互作用的小鼠在里面活泼地.

材料和方法

Arg-61的产生阿波阿勒。

序列重组、基因靶向载体由8.3kb的子克隆生态RI片段跨越第1-4外显子老鼠阿波129/SvJae小鼠的基因分离基因组细菌人工染色体库（Research Genetics，亚利桑那州亨茨维尔）（图。​（图1）。1). 站点定向PCR诱变将最后一个核苷酸的C替换为G外显子3的位置，编码Thr-61以产生精氨酸密码子和独特的数据元素I限制站点。

在单独的窗口中打开

图1

Arg-61的生成和表征阿波等位基因。(A类)序列重组、基因定位战略。一个7-kb生态RI公司-BstB公司1个碎片插入包含外显子1、2、3和5′侧翼序列a的上游新磁带两侧液氧磷地点。包含外显子4和3′的1.3kb片段通过PCR扩增侧翼序列，并将其克隆到抗坏血酸1个站点位于新磁带。基因靶向载体与阿波ES细胞中的基因座在第61密码子的第二个位置位于外显子3′端并引入独一无二的数据元素我限制网站。A类新的磁带两侧液氧磷现场已关闭接近内含子3中新的Arg-61密码子以监测正确的整合点突变。靶向ES细胞克隆和小鼠通过基因组DNA消化鉴定生态RI公司和Southern印迹阿波外显子4探针，其中发现了一个10.3kb的扩增片段，而重量为8.3kb的片段。C介导切除新盒式磁带产生突变体阿波等位基因（指定为Arg-61阿波).

结果

将ApoE4结构域相互作用引入小鼠ApoE。

用定点突变取代精氨酸代替苏氨酸在人体apoE中相当于61的位置。The effect of the脂蛋白结合偏好突变在在体外人血浆分析。重组wt小鼠apoE，类似人类apoE3优先与HDL结合；相反，小鼠Arg-61与人类apoE4一样，apoE对VLDL也有偏好（图。​（图2），2)，表示域交互可以引入小鼠apoE。

在单独的窗口中打开

图2

人载脂蛋白E和小鼠载脂蛋白E的血浆脂蛋白结合偏好。对重组小鼠apoE和人类apoE亚型进行放射标记，与人血浆孵育，分馏成各种脂蛋白按大小分类-不包括FPLC。

Arg-61载脂蛋白基因靶向小鼠。

我们接下来试图扩展这一观察体内.老鼠在ES细胞中通过基因靶向产生表达Arg-61 apoE（图。​（图1），1)和纯合子基因靶向小鼠由Southern鉴定尾部DNA的印迹分析。基因组DNA消化生态RI透露阿波轨迹由于存在新暗盒（未显示）。A类数据元素我摘要显示第3外显子中的突变Arg-61密码子（数据未显示）。纯合Arg-61 apoE基因靶向小鼠与Cre-deleter交配转基因小鼠，其中Cre重组酶在生殖细胞中表达引起DNA在组织范围内的重组液氧磷地点(24). 拆卸新磁带导致正常水平在所有检查的组织中，Arg-61 apoE mRNA与wt的比较（图。​（图3）。三). 一个相同的Northern印迹是与β-actin探针杂交以控制总mRNA水平组织样本。所有配对的β-肌动蛋白mRNA水平相似组织（图。​（图3）。三).

在单独的窗口中打开

图3

不同组织器官载脂蛋白E mRNA水平的比较（+）小鼠和Arg-61靶向小鼠与Cre-deleter小鼠（R）杂交。(A类)从各种组织和器官中分离出总RNA来自wt和Agr-61小鼠，并使用阿波外显子4探针。组织和器官包括：B、，脑；李，肝脏；卢，肺；M、 肌肉；四、小肠；T、 睾丸；H、 心脏；St，胃；K、 肾脏；Sk，皮肤；Sp，脾脏；和E，眼睛。(B)显示了对照小鼠β-肌动蛋白杂交。

小鼠血浆中Arg-61载脂蛋白E的分析。

小鼠血浆的IEF–PAGE/蛋白质印迹分析表明Arg-61 apoE迁移了一个额外的相对正电荷单元到wt鼠标apoE（图。​（图4）。4). 这个发现与精氨酸替代Thr-61一致，并证实突变发生在表达的蛋白质中。如所示杂合子Arg-61/wt小鼠的血浆中，Arg-61载脂蛋白E水平为持续60-70%(n个=30）低于wt apoE（图。​（图4）。4). 这一发现表明Arg-61 apoE是血浆中分解代谢更快，因为纯合基因靶向小鼠的Arg-61 apoE mRNA水平与wt小鼠的apoE水平相同（图。​（图3）。三). 排除低水平Arg-61的可能性血浆中的apoE是由精氨酸-61 apoE分泌减少引起的肝脏，两个Arg-61/wt的原代肝细胞培养对杂合小鼠进行了检测。所含培养基两种apoE亚型的等效水平，表明Arg-61阿波等位基因保持完全转录和翻译活动（图。​（图5）。5).

在单独的窗口中打开

图4

小鼠血浆和CSF apoE的IEF和Western印迹。小鼠apoE亚型用IEF和Western blot检测血浆和脑脊液。小鼠在出血前禁食4小时。

在单独的窗口中打开

图5

原代肝细胞分泌apoE的IEF和Western blot培养基。从wt和Arg-61/wt杂合小鼠，置于培养基中培养2天，以及收集培养基。培养基中的小鼠wt和Arg-61 apoE分别为通过IEF和Western blot检测进行评估。

Arg-61和Wt-ApoE在血浆脂蛋白中的分布。

在饮食中小鼠通常具有低水平的循环VLDL，反映了肝脏apoB100表达水平较低。为了研究血浆脂蛋白中Arg-61载脂蛋白E相对于wt-apoE的分布体内，Arg-61/wt小鼠血浆VLDL水平为通过喂食富含胆固醇（Paigen）的饮食来饲养它们（ICN，Costa加利福尼亚州梅萨）6天（图。​（图6）。6). 这个然后对Arg-61和wt-apoE的脂蛋白结合偏好进行研究通过体积排除FPLC分离小鼠血浆进行检测色谱法和IEF–PAGE。相对于wt apoE，Arg-61 apoE结合优先于低密度脂蛋白（图。​（图6），6)如果在HDL组分中发现了任何Arg-61 apoE。这一发现证实了观察到脂蛋白结合偏好的改变在里面体外（图。​（图2）。2).

在单独的窗口中打开

图6

杂合子血浆中wt和Arg-61载脂蛋白E的分布，高胆固醇饮食的基因靶向小鼠。Arg-61/wt载脂蛋白E杂合小鼠喂食Paigen饮食6天以增加VLDL水平。非禁食血浆通过尺寸排除FPLC进行分级。(上部)对应于不同的分数脂蛋白分类由IEF决定，载脂蛋白E由蛋白质印迹。

这些结果与以下概念一致：与wt-apoE相比，Arg-61 apoE增强，因为它结合优先与密度较低的脂蛋白结合，后者的转化率更高在血浆中快速。Arg-61和wt-apoE水平相似CSF（图。​（图4），4)，这表明脑脊液中的两种载脂蛋白E亚型。

讨论

这项研究表明，apoE4域相互作用可以是通过提供关键等效项引入鼠标apoE氩-61。两者都有在体外和体内，Arg-61小鼠与人类apoE4一样，apoE优先与VLDL结合。相反，wt小鼠apoE（Thr-61）对HDL表现出类似apoE3的偏好。因此，虽然它与apoE4中发现的Arg-112相当，但wt小鼠apoE（大概还有所有其他哺乳动物形式的apoEThr-61）的功能类似于apoE3，反映了apoE4域相互作用。与人类apoE4平行将apoE4结构域相互作用引入小鼠apoE可能涉及Arg-61和Glu-255等效物之间的相互作用。然而，可能在Glu-255等效参和物附近。建立此这将需要额外的诱变研究。Arg-61小鼠本文报道的apoE模型将有助于研究apoE4的作用脂蛋白代谢、动脉粥样硬化和神经退行性变。

杂合Arg-61/wt载脂蛋白E小鼠显示脂蛋白代谢表型与人类apoE4/3受试者相似。喜欢apoE4/3受试者，其apoE4水平低于apoE3水平(15),Arg-61/wt小鼠的Arg-61 apoE水平低于wt apoE。事实上，小鼠apoE亚型的相对水平反映了apoE4/3受试者(15). 这一发现与更快的apoE4的分解代谢和血浆水平低于apoE3或apoE2(13,27). 其他发现为增强Arg-61 apoE的分解代谢。体内，Arg-61 apoE的水平肝脏（血浆apoE的主要来源）中的mRNA正常。体外，杂合子Arg-61/wt的原代肝细胞小鼠分泌等量的每种亚型。与的另一个相似之处人类apoE4是Arg-61 apoE对低密度的偏好含有载脂蛋白B的脂蛋白，在血浆。在缺乏载脂蛋白B的脑脊液中Arg-61和wt-apoE相等。综合来看，这些结果证明引入了apoE4域相互作用在里面活泼地Arg-61 apoE小鼠。

ApoE4与血浆LDL水平升高和动脉粥样硬化倾向(28). 最近，载脂蛋白E4的影响测定了apoB48和apoB100的代谢人类同位素方法(29). 一个人的存在APOE公司4由于分数较低，等位基因与较高的LDL水平相关低密度脂蛋白的分解代谢，VLDL向低密度脂素的转化增加33%。

因为Arg-61小鼠在血浆，对于了解apoE4结构域相互作用有助于提高血浆低密度脂蛋白水平人类动脉粥样硬化。然而，在小鼠中，血浆胆固醇是主要通过高密度脂蛋白转运，血浆低密度脂蛋白水平本质上很低因为apoB100表达低。相反，人类血浆胆固醇主要通过含有载脂蛋白B100的低密度脂蛋白运输。这个小鼠血浆载脂蛋白B水平较低可能解释了Arg-61小鼠血浆和VLDL脂质水平的可检测差异，尽管apoE分解代谢发生了显著变化。要复制更多与人类脂蛋白代谢中的人类载脂蛋白E4表型密切相关，我们将Arg-61小鼠与表达高水平人类apoB100(30).

这个APOE公司4等位基因是一个主要的易感基因患有神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病(31),头部创伤和中风后临床结局不佳(32,33).载脂蛋白E在人类神经系统中的异构体特异性作用如下考虑包括对脂质转运的影响(34)，关于新陈代谢tau蛋白和淀粉样β肽，以及对氧化(35,36). 载脂蛋白E4在神经退行性变中的确切作用疾病尚不清楚；然而，apoE4的能力不如apoE2或apoE3促进神经元损伤后的生长和修复(7,37).在神经元中表达载脂蛋白E亚型的转基因小鼠的研究提供的证据表明，相对于apoE3，apoE4易导致tau蛋白的神经元丢失和过度磷酸化，并发挥a神经退行性变的显性负效应(38——40). 这些老鼠也认知功能丧失(41). Arg-61小鼠apoE模型将允许确定上述哪种影响直接来自apoE4结构域相互作用。

Arg-61 apoE小鼠模型具有独特的功能，可以避免人类apoE亚型其他小鼠模型的潜在并发症。首先，“人性化”Arg-61小鼠阿波基因是在内源性的控制下表达，组织特异性控制元件。因此，整合位置对蛋白质表达水平、物种效应和非天然药物的使用消除apoE启动子。载脂蛋白E亚型的最新小鼠模型在ES细胞中通过基因靶向产生，以取代小鼠阿波与人类的轨迹APOE公司等位基因(42——45)，以及一些品系表现出意想不到的脂蛋白代谢表型。对于例如，表达人类apoE3的基因靶向小鼠表现出增加饮食诱导的高脂血症，证明在小鼠中，人类apoE3清除脂蛋白的效率低于wt小鼠apoE(42).类似地，一系列表达人类apoE4的基因靶向小鼠，与人类apoE4受试者不同，其血浆胆固醇水平正常低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白清除延迟(44). 然而，升高的水平在人类apoE4基因靶向小鼠中发现血浆胆固醇通过使用不同的基因定位策略创建(45). 这些观察表明，几个因素使人类蛋白质（包括载脂蛋白E）忠实小鼠模型的开发亚型。此外新盒式磁带敲除等位基因可导致表型独立于靶向等位基因的拟议贡献(46).

总之，我们报告了体内模型旨在测试载脂蛋白E4结构域相互作用在脂蛋白中的作用代谢、动脉粥样硬化和神经变性。基因靶向小鼠表达Arg-61 apoE显示了与apoE4相关的两个关键表型在人类中。Arg-61 apoE偏好低密度脂蛋白，血浆中apoE含量低于wt小鼠，可能是因为更快的分解代谢。综上所述，这些结果表明Arg-61基因靶向小鼠将作为研究载脂蛋白E4的结构域相互作用作为人类疾病的原因开发同种型特异性治疗策略的可能性。

致谢

缩写

脚注

工具书类