美国科学院质谱杂志。2018; 29(2): 405–412.
无标记定量交联/质谱的重现性研究
,1,2 ,2 ,1,2 ,2和
1,2 梅勒神父
1德国柏林工业大学生物技术研究所生物分析系主任
2苏格兰爱丁堡爱丁堡大学生物科学学院Wellcome细胞生物学信托中心EH9 3BF UK
卢兹·菲舍尔
2苏格兰爱丁堡爱丁堡大学生物科学学院Wellcome细胞生物学信托中心EH9 3BF UK
卓安琪·陈
1德国柏林工业大学生物技术研究所生物分析系主任
2苏格兰爱丁堡爱丁堡大学生物科学学院Wellcome细胞生物学信托中心EH9 3BF UK
塔妮娅·奥琴尼卡娃
2苏格兰爱丁堡爱丁堡大学生物科学学院Wellcome细胞生物学信托中心EH9 3BF UK
尤里·拉普西尔伯
1德国柏林工业大学生物技术研究所生物分析系主任
2苏格兰爱丁堡爱丁堡大学生物科学学院Wellcome细胞生物学信托中心EH9 3BF UK
1德国柏林工业大学生物技术研究所生物分析系主任
2苏格兰爱丁堡爱丁堡大学生物科学学院Wellcome细胞生物学信托中心EH9 3BF UK
通讯作者。 2017年8月11日收到；2017年10月14日修订；2017年10月14日接受。
开放式访问本文根据Creative Commons Attribution 4.0 International License的条款分发(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)，它允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原始作者和来源给予适当的信任，提供知识共享许可的链接，并指明是否进行了更改。
摘要
定量交联/质谱（QCLMS）是一种新兴的研究蛋白质和多亚基复合物构象变化的方法。区分蛋白质构象需要可重复地识别和量化交联肽。在这里，我们分析了使用双[磺基琥珀酰亚胺]二酸盐（BS）的多重交联反应之间的变化三)-交联人血清白蛋白（HSA），并评估如何通过LC-MS分析鉴定和量化可重复的交联肽。为了让更广泛的研究团体能够访问QCLMS，我们开发了一个工作流，该工作流集成了用于光谱预处理的既定软件工具MaxQuant、用于交联肽识别的Xi以及用于量化的Skyline（MS1过滤）。在我们的样品中鉴定出的221对独特的残基对中，124对随后在10次分析中进行了量化，变异系数（CV）值为14%（注射复制品）和32%（反应复制品）。因此，我们的结果表明，QCLMS的再现性与一般定量蛋白质组学的再现性一致，并且我们建立了基于MS1的交联肽定量的稳健工作流程。
关键词：定量、交联、人血清白蛋白、无标记、质谱、再现性
介绍
交联/质谱（CLMS）已成为蛋白质及其复合物结构分析的有力工具[1–5]自从20年前开始[6,7]. 与交联剂的反应将氨基酸残基的三维邻近性转化为共价键。残基之间的桥接距离取决于所使用的交联剂。双[磺基琥珀酰亚胺]亚油酸盐（BS三)是最常用的试剂之一，连接残基的距离可达25–30º（Cα-Cα距离）[1]. 在蛋白质的蛋白水解消化之后，使用液相色谱-质谱（LC-MS）和数据库搜索来鉴定交联肽。
以前的研究使用CLMS来研究单个蛋白质的结构[8]，多蛋白复合物[9]和蛋白质-蛋白质相互作用网络[10,11]. 这些研究中的蛋白质经常发生动态构象变化，这很难通过只知道交联位点来确定和可视化。为此，需要通过对CLMS管道进行定量，通过某些交联残基对的相对丰度来了解动力学。在基于质谱的蛋白质组学中，有两种广泛的定量策略，无标签和标记方法，这两种方法都适用于CLMS。黄2006的前期研究[12]使用18基于O标记的QCLMS方法有几个缺点，妨碍了该方法的广泛使用，包括标记不完整和数据分析软件不充分。Fischer等人，2013年[13]通过使用同位素标记的交联剂和开发软件工具XiQ克服了这些障碍，XiQ结合了手动峰值验证的准确性和自动定量的便利性。从那时起，有几个软件包可用于分析QCLMS数据[14,15]. 尽管基于同位素标记的QCLMS已成功用于多项研究[14,16–19]它受到了标签方法实验设计中常见的限制：同位素标记试剂的成本（可能很昂贵）、复杂的样品制备以及数据覆盖率的降低[20,21]. 相反，无标签定量可以避免这些缺陷，并且可以比较的样品数量没有限制。最近使用Skyline基于MS2的QCLMS工作流介绍了无标签定量的优点[22]. 无标签方法的一个一般警告是样品是单独处理的，这可能会导致样品制备过程中的技术偏差[21]. 由于交联的样品制备程序比正常蛋白质组学中的更精细，人们可能会期望有更大的差异。
在此，我们研究了无标签QCLMS的再现性。我们确定了样品制备过程中引入的变化，并将其与LC-MS采集过程中多次进样之间的变化进行了对比。作为模型系统，我们使用双[磺基琥珀酰亚胺]琥珀酸（BS）交联人血清白蛋白（HSA）三)我们将Skyline修改为半自动化无标签QCLMS的工作流程。
方法
试剂
HSA购自Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。交联剂BS三购自Thermo Scientific Pierce（美国伊利诺伊州罗克福德）。
交叉链接反应
10个交联反应并行进行，如下所示：在交联缓冲液（20 mM HEPES-KOH，pH 7.5，20 mM NaCl，5 mM MgCl）中纯化人血清白蛋白（40μg；2μg/μL）2，）与BS混合三（交联缓冲液中160μg，30μg/μL）和交联缓冲液（14.6μL），总反应体积为40μL（1μg/微升蛋白质浓度），蛋白质与交联剂的质量比为1:4。在冰上孵育1.5小时后，使用5μL饱和碳酸氢铵（~2.5 M）在室温下停止反应30分钟。将来自每个反应的40μg交联HSA进行SDS-PAGE，并使用考马斯染色观察蛋白带。切除交联HSA单体条带进行消化。
质谱分析样品制备
每个含样品的凝胶条带分别消化[23]. 蛋白质用10 mM二硫苏糖醇还原，随后用55 mM碘乙酰胺烷基化，然后用胰蛋白酶（300 ng/μL）消化。消化后，使用80%v/v乙腈（ACN）在0.1%v/v三氟乙酸（TFA）中提取肽。用C脱盐色氨酸肽18-舞台提示[24]并在质谱分析之前用80%v/v ACN和0.1%v/v TFA洗脱。肽在Vacufuge浓缩器（德国Eppendorf）中浓缩，并在2%v/v ACN、0.1%v/v甲酸（FA）中重新悬浮，最终蛋白质浓度为0.75μg/μL；将每种反应样品的4/5（名义上为32μg）合并为注射复制品。每个反应样品的剩余1/5（标称8μg）用于反应复制实验。对于每次质谱采集，名义上注入1.5μg肽（图a） ●●●●。
无标签交联量化工作流程。(一)样品制备工作流程：橙色代表反应副本，蓝色代表注射副本。(b条)使用MaxQuant进行峰值拾取、Xi进行交联识别和量化以及使用Skyline进行量化的交联识别和定量工作流程
LC-Mass光谱分析
LC-MS/MS分析采用Orbitrap Fusion Lumos（Thermo Fisher Scientific，CA，USA）进行，采用“高/高”收购策略。肽分离在EASY-Sraph柱上进行（50 cm×75μm i.d.，PepMap C18，2μm颗粒，100μm孔径，Thermo Fisher Scientific，德国）。流动相A由水和0.1%v/v FA组成，流动相B由80%v/v ACN和0.1%v/v FA构成。将肽以0.3μL/min的流速用2%缓冲液B加载到色谱柱上，以0.25μL/min流速洗脱，洗脱梯度为：从2%到40%流动相B线性增加150 min，然后从40%到95%流动相B增加11 min。洗脱后的肽直接喷入质谱仪，并使用数据相关采集（DDA）模式进行分析。在每个3 s采集周期中，Orbitrap中检测到分辨率为120000和米/z范围400–1600。选择电荷状态为3+到7+的离子进行碎片化。选择优先级设置为首先是最低电荷，然后是最高强度。选择的离子在窗口大小为米/z2.通过高能碰撞解离（HCD）对分离离子进行碎片化，并在Orbitrap中以30.000的分辨率进行分析。启用动态排除，排除持续时间设置为60 s，排除质量容差设置为10 ppm。
交联肽的鉴定
使用MaxQuant将原始质谱数据文件处理为峰值列表[25]（1.5.0.0节）。“每100 Da的FTMS峰值”设置为20，“FTMS去极化”框未勾选，所有其他参数设置为默认值（图b） ●●●●。随后的数据库搜索使用Xi进行[26]针对HSA序列（UniProt ID：{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“P02768”，“term_id”：“113576”，“term_text”：“PO2768”}}P02768号)以反向HSA序列为诱饵。使用了以下搜索参数：MS准确度：6 ppm，MS/MS准确度：20 ppm，酶：胰蛋白酶，漏切：4，交联剂：BS三，固定修饰：半胱氨酸上的氨基甲酰化，可变修饰：蛋氨酸氧化和BS修饰三第二个NHS酯水解或胺化。英国标准三反应特异性假定为赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和蛋白质的N末端。数据已存入ProteomeXchange[27]通过荣誉联盟[28]具有数据集标识符PXD007250的合作伙伴存储库对于所有由Xi Software自动验证的已识别交联，在HSA（PDB:1AO6链A）的晶体结构中测量交联残基对之间的Cá-Cá距离。使用Skyline进行后续定量时，将距离≥30º的残基对和与诱饵匹配的交联物排除在外。
使用天际线创建用于自动验证交叉链路和定量的光谱库
使用Skyline（3.5版）对MS1水平进行定量[29]. 交联肽的识别信息以.ssl文件的形式引入，遵循Skyline中自定义库的标准格式[30]. .ssl文件是使用内部脚本构造的[31]基于已识别交联的肽谱匹配列表（PSM）。在.ssl文件中，为每个交叉链接功能生成一个条目。交联特征被定义为具有电荷状态、连接位点或修饰差异的交联肽的独特PSM。由于Skyline本身不支持交联数据，因此根据Chen等人2016和Maiolica等人2007中描述的原理，将交联肽序列转换为线性形式[19,23]（图d和e）。Skyline使用.ssl文件和指定的mzML文件（使用MSconvert从原始文件创建[32])通过BiblioSpec创建光谱库。肽设置如下：酶：胰蛋白酶KR/P，最大缺失裂解：9，肽最小长度：6，最大长度：60，修饰：半胱氨酸上的氨基甲酰化，蛋氨酸上的氧化，交联剂（赖氨酸+27.983 Da），BS三-俄亥俄州（156.078 Da），英国标准三-NH2（155.094 Da）和BS三-回路（138.068 Da）。过渡设置设置为：前体电荷：3-7；离子类型：p（前体）；质量范围：米/z400–1600; 公差：米/z0.055; 同位素峰包括：计数3；质量分析仪：轨道探测器；分辨率：120000米/z对于其余设置，使用默认值。MS1过滤按照Skyline教程（2.5版）中的描述进行[33]). Skyline使用光谱库检测已识别前兆的所谓跃迁。单个前体的跃迁包括前体选定同位素峰的多个MS1光谱的强度测量。对于每个前驱体，跃迁的峰值区域被整合并解释为量化信号。在天际线的自动峰值拾取和保留时间校准后，对错误的峰边界进行手动校正。Skyline中的数据已导出到.csv文件中以进行进一步处理。关于峰面积，Skyline能够计算变异系数（CV），用于比较实验中定量的再现性。CV表示10个复制品内峰面积的平均变化，以确定通过质谱法或并行进行实验引入的变化。分别比较了10个注射副本和10个反应副本的CV。对于其中的每一个特征，交叉链接特征的CV值由Skyline计算得出。此外，交联残基对的CV值被计算为与该残基对对应的所有交联特征的CV中值。
天际线上的交联肽。(一)线性化交联肽的色谱图视图，显示前体同位素离子M（蓝色）、M+1（紫色）、M+2（红色）的MS1提取离子色谱图。(b条)整合和归一化后，每个复制品（1–10）的峰面积以及总同位素峰。(c（c）)呈现肽的所有10个复制品与峰尖（黑色中线）之间的保留时间[分钟]比较。(d日)显示转换BS序列方案的示例三以Skyline输入格式将交联肽转换成线性形式。(e（电子）)交联肽序列线性化的质量计算方案
结果和讨论
数据质量
为了在无标签实验中评估定量CLMS的再现性，我们测量了交联HSA，一种研究充分的CLMS模型蛋白[13]，以监测同一样品的10个交联反应和10个LC-MS进样的再现性。使用BS在溶液中交联HSA三用胰蛋白酶在凝胶中消化。使用“高-高”（Orbitrap MS1和MS2）采集策略和数据相关采集（DDA）通过LC-MS分析未分馏肽。
如果交联肽通过了在Xi中实施的自动验证，而没有进行任何进一步的手动验证，则认为该交联肽已被鉴定。结合所有注射和反应实验，得到242个经鉴定的独特交联残基对（图a） ●●●●。与晶体结构相比，242个交联距离中有21个超过了BS的理论30º极限三[13]并从进一步分析中删除，以增加我们数据的可信度（图b） ●●●●。因此，我们的最终交联组包括221对独特的HSA交联残基对。这与之前使用相同化学物质交联HSA的研究相比较，发现43[13]和101[34]蛋白质内链接的FDR为5%。
使用Xi中的自动验证确定的唯一残基对的数据质量（n=242，包括五个诱饵，即<2%FDR）。(一)HSA（PDB:1AO6，链A）的晶体结构包含已识别的交联（黄色：BS交联极限内的交联三n=221，绿色：长距离交联（≥30Å）n=21，包括五个诱饵）。(b条)观测链路的Cα距离分布（黄色、绿色）和随机距离分布（灰色）
Xi鉴定交联肽
10个反应副本（RR）共产生196个唯一残基对，而注射副本（IR）产生180个唯一残基对，这两个数据集共有155个（RR:80%，IR:86%）（图a） ●●●●。与单次分析相比，平均而言，三次分析产生了51%的RR和47%的IR交联残基对。这与最近线性肽研究中的观察结果大致相符[35–37]. 已识别残基对的额外增益随着复制品数量的增加而下降。在最初的三个复制品中添加三个反应复制品，可进一步增加22%（IR:25%），在最初的六个复制品中添加三个额外的复制品，可增加11%（IR:13%）（图b） ●●●●。10个复制品的识别总数的50%可以通过两个复制品实现。对于10份副本，三份副本的回报率为总数的2/3（RR:72%，IR:69%），这可能是覆盖率和测量时间之间的良好折衷。与此一致的是，在所有10个副本中发现的链接很少（RR:43个链接，20%；IR:45个链接，23%），并且相当大一部分的链接只出现过一次（RR:53，25%；IR:58，30%）（图c） 。这些结果与DDA实验中的随机抽样一致[37]. 注意，定量残基对的数量更大，这是由于运行之间的匹配。
反应和注射复制品中交联鉴定的再现性。(一)维恩图显示了反应（橙色）和注射复制品（蓝色）中确定的残基对的重叠。(b条)根据LC-MS运行次数绘制已识别唯一残基对的数量，显示已识别残基对数量随运行次数增加而饱和（橙色：反应副本，蓝色：注射副本，灰色：标准偏差）。(c（c）)唯一残基对的数量与副本的数量对比，显示在多少副本中观察到给定的唯一残基配对（橙色：反应副本，蓝色：注射副本）
Skyline法对交联肽的无标签定量
对于无标签量化，我们使用了Skyline[29]. 简而言之，我们制备了一个光谱库，其中包括反应复制实验中所有196个识别的残基对（1064个光谱）和注射复制实验中的所有180个识别的残留物对（885个光谱）。对于每个实验，原则上，每一个已识别的交联肽都可以在10个复制品中进行定量，即使DDA没有在所有复制品中识别出它。
在Skyline中进行量化之前，我们使用内部脚本为每个实验创建了一个Skyline输入文件（.ssl文件）。.ssl文件包含每个已识别交联肽的以下信息：指定的mzML文件、扫描号、电荷状态、序列（包括修改）、分数类型和分数。在本文件中，每个交联肽的序列都被转换为线性表示，并带有连接两个连接肽a和B（K）的附加修饰赖氨酸残基xlink（链接），图d）[19]产生与原始交联形式相同的质量（图e） ●●●●。Skyline使用.ssl文件和指定的mzML文件使用BiblioSpec创建光谱库。必须定义肽和过渡设置，以探索库并将与过滤器设置或库匹配的肽导入定量工作表。
为了提高定量结果的可信度，我们从我们的数据集中排除了使用替代残基对观察到的肽对，如果这些肽对在LC维度上没有完全分离（IR:18，RR:10残基对）。为了简化评估任务，我们只包括在所有10个复制品中量化的交联残基对。这导致反应和注射实验分别有106和111个量化的唯一残基对。在一组复制品中发现并量化的大多数交联也被另一组（93个残基对）发现，这表明这些链接是最丰富的（图a） ●●●●。许多蛋白质组学研究都是从三反应复制品开始设计的。在这里，使用三个反应复制品而不是10个复制品，将量化与鉴定的交联的比率从196个中的106个（54%）提高到146个中的92个（63%）（图b） ●●●●。请注意，减少复制品的数量会将已识别的残基对的数量从196个减少到146个。这与处理定量交联的其他研究相当[14].
残基对定量的再现性。(一)维恩图显示了来自反应复制品（橙色）和注射复制品（蓝色）的定量残基对的数量。(b条)已识别（浅色）和定量（深色）残留物对的数量（橙色：反应副本，蓝色：注射副本）。(c（c）)量化后每个实验的中位峰面积的变异系数（CV）（%），显示了使用交联肽进行无标签量化的再现性。(d日)装箱日志的CV2峰面积以%表示，显示残基对峰面积和CV值之间的反相关。橙色反应复制品和蓝色注射复制品
为了评估对唯一残基对进行定量后峰面积的再现性，我们计算了残基对的变异系数（CV），作为所有相应交联肽特征的中值CV值。量化特征的CV值在Skyline中计算，表示所有副本峰面积之间的平均变化。该值越高，所有副本的峰值区域之间的差异越大。正如预期的那样，注射复制品的再现性（CV 14%）高于反应复制品（CV 32%）（图c） 。从同一试管中简单注射10次比平行启动10个交联反应具有更高的再现性。对于什么样的简历是定量陈述的良好基础，目前还没有达成共识。然而，结果符合其他研究中观察到的变化[35,37–43]. 佩林等人，2013年[41]根据注射重复性和诱导间变异，评估了使用脑脊液的线性肽定量无标签方法。大多数定量蛋白质的注射复制品的变异系数很低（<5%），非常低，不同个体的样品之间的变异系数要高得多（48%）。我们较低的注射再现性可能是因为有许多改性交联肽（蛋氨酸氧化和替代交联产物）和早期洗脱肽，所有这些都是技术差异的来源。Kramer等人，2015年[42]使用蛋白质无标签定量和数据依赖性采集（DIA），报告了10%的注射方差和16%的组间变异。Lai等人，2015年[43]建议使用30%的变异系数作为注射复制品的阈值，以使用无标签方法和数据相关采集（DDA）策略获得可重复的定量。
最后，我们研究了与残基对中位峰面积相关的再现性（CV）（图d） ●●●●。正如人们所料，定量再现性与峰值强度成反比。反应复制品的再现性低于注射复制品，但再现性的强度依赖性仍然存在。丰度降低会增加变化并降低定量的再现性。因此，应尽可能多地注入材料。总之，定量CLMS和线性肽研究的再现性非常相似。
结论
在本研究中，我们证明交联残基对具有重复性和饱和度特征，类似于标准鸟枪蛋白质组学中的随机取样[37]. 额外的注射提高了识别的数量，但也增加了随机采样引起的运行之间的可变性。因此，在寻求定量信息时需要可靠的定量程序。我们描述了一个基于DDA和Skyline中无标签定量的定量交联工作流。由于运行之间的匹配特征和标识，这允许利用多次注入的信息。我们观察到，交联中的无标签定量与使用线性肽的研究的再现性一致。定量交联已经证明了其在蛋白质结构和机理研究中的潜力，并且交联残基对的可靠无标签定量现在提供了一套新的途径和实验设计。
致谢
这项工作得到了Wellcome Trust（103139108504）和DFG（RA 2365/4-1）的支持。威康信托细胞生物学中心由威康信托基金的核心资金支持（203149）。
工具书类
1Rappsilber J.美好友谊的开始：蛋白质和多蛋白复合物的交联/质谱和建模。J.结构。生物。2011;173:530–540. doi:10.1016/j.jsb.2010.1014。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 2体内蛋白质复合物拓扑：通过交联透镜观察。蛋白质组学。2012;12:1565–1575. doi:10.1002/pmic.201100516。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 三。结构蛋白质组学的化学交联和质谱进展：从单一蛋白质到蛋白质相互作用网络。专家Rev.Proteom。2014;11:733–743. doi:10.1586/14789450.2014.960852。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 4Liu F，Heck AJR。通过交联质谱法查询蛋白质组装和蛋白质相互作用网络的结构。货币。操作。结构。生物。2015年；35:100–108. doi:10.1016/j.sbi.2015.10.006。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5Leitner A、Faini M、Stengel F、Aebersold R.交叉链接和质谱：理解分子机器结构和功能的集成技术。趋势生物化学。科学。2016;41:20–32. doi:10.1016/j.tibs.2015.10.008。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 6Rappsilber J，Siniossoglou S，Hurt EC，Mann M.通过交联和质谱分析多蛋白复合物空间组织的通用策略。分析。化学。2000;72:267–275. doi:10.1021/ac991081o。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 7Young MM，Tang N，Hempel JC，Oshiro CM，Taylor EW，Kuntz ID，Gibson BW，Dollinger G.通过使用来自分子内交联和质谱的实验约束进行高通量蛋白质折叠鉴定。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2000;97:5802–5806. doi:10.1073/pnas.090099097。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 8Belsom A、Schneider M、Fischer L、Brock O、Rappsilber J.通过质谱和计算生物学研究人类血清中的血清白蛋白结构域。分子细胞。Proteom公司。2015年；25:663–682. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Chen ZA、Jawhari A、Fischer L、Buchen C、Tahir S、Kamenski T、Rasmussen M、Lariviere L、Bukowski-Wells J-C、Nilges M、Cramer P、Rappsilber J.通过交联和质谱揭示的RNA聚合酶II-TFIIF复合物的结构。EMBO J。2010;29：717–726。doi:10.1038/embj.2009.401。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 10Herzog F、Kahraman A、Boehringer D、Mak R、Bracher A、Walzthoeni T、Leitner A、Beck M、Hartl F-U、Ban N、Malmstrom L、Aebersold R。通过化学交联和质谱法对蛋白质磷酸酶2A网络进行结构探测。科学。2012;337:1348–1352. doi:10.1126/science.1221483。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 11Tanaka Y、Bond MR、Kohler J.光交联剂阐明活细胞中的相互作用。分子生物晶体。2008年；4:473–480. doi:10.1039/b803218a。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 12黄BX。化学交联和串联质谱显示Akt活化中的结构域间构象变化。分子细胞。Proteom公司。2006;5:1045–1053. doi:10.1074/mcp。M600026-MCP200。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 13Fischer L，Chen ZA，Rappsilber J.使用同位素标记交联剂的定量交联/质谱法。《保护学杂志》。2013;88:120–128. doi:10.1016/j.jprot.2013.03.005。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 14Walzthoeni T、Joachimiak LA、Rosenberger G、Röst HL、Malmström L、Leitner A、Frydman J、Aebersold R.xTract：通过定量交联质谱表征蛋白质复合物构象变化的软件。自然方法。2015年；12:1185–1190. doi:10.1038/nmeth.3631。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 16Tomko RJ、Taylor DW、Chen ZA、Wang HW、Rappsilber J、Hochstrasser M.单个α螺旋驱动蛋白酶体盖的广泛重塑和调控颗粒组装的完成。单元格。2015年；163:432–444. doi:10.1016/j.cell.2015.09.022。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 17Kukacka Z、Rosulek M、Strohalm M、Kavan D、Novak P。通过定量交联绘制蛋白质结构变化图。方法。2015年；89:112–120. doi:10.1016/j.meth.2015.05.027。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 18Ioannou，M.S.，McPherson，P.S.：Rab13和癌细胞行为的调节。生物学杂志。化学。三，jbc。R116.715193（2016）[PMC免费文章][公共医学] 19Chen Z、Fischer L、Tahir S、Bukowski-Wells J-C、Barlow P、Rappsilber J。定量交联/质谱揭示了细微的蛋白质构象变化。Wellcome开放研究。2016;1：5.doi:10.12688/wellcomeopeners.9896.1。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 20Li Z，Adams RM，Chourey K，Hurst GB，Hettich RL，Pan C.LTQ Orbitrap Velos定量蛋白质组学的无标签、代谢标记和等压化学标记的系统比较。蛋白质组研究杂志。2012;11：1582–1590。doi:10.1021/200748小时。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 21Megger DA、Pott LL、Ahrens M、Padden J、Bracht T、Kuhlmann K、Eisenacher M、Meyer HE、Sitek B。肝癌细胞系蛋白质组分析中无标签和基于标签策略的比较。比奥。生物物理学。Acta–蛋白质和蛋白质组学。2014;1844:967–976. doi:10.1016/j.bbapap.2013.07.017。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 22Chavez JD、Eng JK、Schweppe DK、Cilia M、Rivera K、Zhong X、Wu X、Allen T、Khurgel M、Kumar A、Lampropoulos A、Larsson M、Maity S、Morozov Y、Pathmasiri W、Perez-Neut M、Pineryro-Ruiz C、Polina E、Post S、Rider M、Tokmina-Roszyk D、Tyson K、Vieira Parrine Sant'Ana D、Bruce JE。一种靶向定量交联质谱的通用方法。公共科学图书馆一号。2016;11：e0167547.doi:10.1371/journal.pone.0167547。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 23Maiolica A、Cittaro D、Borsotti D、Sennels L、Ciferri C、Tarricone C、Musacchio A、Rappsilber J.通过交联、质谱和数据库搜索对多蛋白复合物进行结构分析。分子细胞。Proteom公司。2007;6:2200–2211. doi:10.1074/mcp。M700274-MCP200。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 24Rappsilber J，Mann M，Ishihama Y。使用StageTips进行蛋白质组学肽的微纯化、富集、预分离和储存的方案。自然原型。2007;2:1896–1906. doi:10.1038/nprot.2007.261。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 25Cox J，Mann M.MaxQuant实现了高肽识别率、个体化p.p.b.范围质量精确度和蛋白质全蛋白定量。自然生物技术。2008年；26:1367–1372. doi:10.1038/nbt.1511。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 27维兹卡尼诺JA、德意志EW、Wang R、Csordas A、Reisinger F、Ríos D、Dianes JA、Sun Z、Farrah T、Bandeira N、Binz P-A、Xenarios I、Eisenacher M、Mayer G、Gatto L、Campos A、Chalkley RJ、Kraus H-J、Albar JP、Martinez-BartoloméS、Apweiler R、Omenn GS、Martens L、Jones AR、Hermjakob H。ProteomeXchange提供全球协调的蛋白质组学数据提交和传播。自然生物技术。2014;32:223–226. doi:10.1038/nbt.2839。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 28Vizcaíno JA、Csordas A、Del-Toro N、Dianes JA、Griss J、Lavidas I、Mayer G、Perez-Riverol Y、Reisinger F、Ternter T、Xu QW、Wang R、Hermjakob H。2016年PRIDE数据库及其相关工具的更新。核酸研究。2016;44：D447–D456。doi:10.1093/nar/gkv1145。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 29MacLean B、Tomazela DM、Shulman N、Chambers M、Finney GL、Frewen B、Kern R、Tabb DL、Liebler DC、MacCoss MJ。Skyline：用于创建和分析目标蛋白质组学实验的开源文档编辑器。生物信息学。2010;26:966–968. doi:10.1093/bioinformatics/btq054。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 32Holman，J.D.、Tabb，D.L.、Mallick，P.：使用ProteoWizard转换原始质谱数据。货币。协议。生物信息学1-9（2014）[PMC免费文章][公共医学] 34Walzthoeni T、Claassen M、Leitner A、Herzog F、Bohn S、Förster F、Beck M、Aebersold R。通过质谱鉴定交联肽的错误发现率估计。自然方法。2012;9:901–903. doi:10.1038/nmeth.2103。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 35Tabb DDL、Vega-Montoto L、Rudnick PA、Variyath AM、Ham A-JL、Bunk DM、Kilpatrick LE、Billheimer DD、Blackman RK、Cardasis HL、Carr SA、Clauser KR、Jaffe JD、Kowalski KA、Neubert TA、Regnier FE、Schilling B、Tegeler TJ、Wang M、Wang P、Whiteaker JR、Zimmerman LJ、Fisher SJ、Gibson BW、Kinsinger CR、Mesri M、Rodriguez H、Stein SE、Tempst P、，Paulovich AG、Liebler DC、Spiegelman C.液相色谱-串联质谱法蛋白质组鉴定的重复性和再现性。蛋白质组研究杂志。2010;9:761–776. doi:10.1021/pr9006365。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 36Bateman NW、Goulding SP、Shulman NJ、Gadok AK、Szumlinski KK、MacCoss MJ、Wu C.使用数据依赖性采集（DDA）最大化蛋白质组工作流中的肽识别事件分子细胞。Proteom公司。2014;13:329–338. doi:10.1074/mcp。M112.026500。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 37Liu H，Sadygov RG，Yates JR.，III鸟枪蛋白质组学中随机取样和相对蛋白质丰度估计的模型。分析。化学。2004;76:4193–4201. doi:10.1021/ac0498563。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 38Zhang S，Wu Q，Shan Y，Zhao Q，ZhaoB，Weng Y，Sui Z，Zhang L，ZhangY。无动态排除的快速MS/MS采集可通过MS/MS片段强度精确定量蛋白质组。科学。代表。2016;6：26392.doi:10.1038/srep26392。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 39Yeom J，Kabir MH，Lee C.基于数据依赖排除列表的质谱对无标签蛋白质组定量的影响。快速通讯。质谱。2014;29:128–134. doi:10.1002/rcm.7081。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 40Oberg AL，Vitek O.基于定量质谱的蛋白质组实验的统计设计。蛋白质组研究杂志。2009;8:2144–2156. doi:10.1021/pr8010099。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 41Perrin，R.J.，Payton，J.E.，Malone，J.P.，Gilmore，P.，Davis，A.E.，Xiong，C.，Fagan，A.M.，Townsend，R.R.，Holtzman，D.M.：用于脑脊液中生物标记物发现的定量无标签蛋白质组学：技术和诱导间变异评估。公共科学图书馆一号。8, (2013). 10.1371/journal.pone.0064314[PMC免费文章][公共医学] 42Kramer G、Woolerton Y、Van Straalen JP、Vissers JPC、Dekker N、Langridge JI、Beynon RJ、Speijer D、Sturk A、Aerts JMFG。在不使用同位素标准的情况下，通过质谱法定量血浆蛋白浓度的准确性和再现性。公共科学图书馆一号。2015年；10:1–22. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 43Lai X，Wang L，Tang H，Witzmann FA。一种新的比对方法和多重过滤器，用于排除不合格的肽，以增强LC-MS/MS中使用肽强度的无标记定量。蛋白质组研究杂志。2015年；19:161–169. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
