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J签证费用。2014; (90): 51789.
2014年8月7日在线发布。 数字对象标识：10.3791/51789
预防性维修识别码：第578330页
PMID：25145492

水凝胶纳米粒子采集血浆或尿液用于检测低丰度蛋白质类

鲁本·马格尼,#1 本杰明·埃斯皮纳,#2 兰斯·利奥塔,1 亚历山德拉·卢奇尼,1和弗吉尼亚州埃斯皮纳1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

新的生物标志物发现在提供更灵敏和特定疾病检测。不幸的是，许多低丰度生物标志物存在于生物流体中的物质不能很容易地用质谱法检测，或者免疫分析，因为它们浓度很低，不稳定，并且通常被高丰度蛋白质如白蛋白或免疫球蛋白掩盖。含有诱饵的聚N-异丙基丙烯酰胺（NIPAm）基纳米粒子能够克服这些生理障碍。在一个步骤中，他们能够捕获，浓缩并保存体液中的生物标记物。低分子量分析物进入纳米颗粒的核心，被不同的有机化学染料，用作高亲和力蛋白质诱饵。这个纳米颗粒能够将感兴趣的蛋白质浓缩几个数量级数量级。这个浓度因子足以增加蛋白质使蛋白质处于当前质量的检测极限内光谱仪、western印迹和免疫分析。纳米颗粒可以与过多的生物液体一起培养，它们能够浓缩低分子量蛋白质和肽，同时不包括白蛋白和其他高分子量蛋白质。我们的数据表明特定分析物浓度的10000倍放大可以是实现了，使质谱和免疫分析能够检测到之前无法检测的生物标志物。

关键词：生物工程，第90期，生物标志物，水凝胶，低丰度，质谱，纳米粒子，血浆，蛋白质，尿液

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介绍

尽管人类基因组测序已经完成，但尚未取得重大进展用于识别预测早期疾病的生物标记物，或与治疗结果或预后相关1。原因之一缺乏进展是许多潜在的重要生物标志物存在于浓度低于常规质谱检测极限等生物标记物发现平台。质谱（MS）和多重反应监测（MRM）的检测灵敏度通常大于50 ng/ml，而临床实验室中通过免疫分析测定的大多数分析物在50 pg/ml和10 ng/ml之间。这意味着许多生物标志物，特别是在疾病的早期，不能用传统的MS检测到和MRM2此外，还存在高丰度蛋白质，如复杂生物流体中的白蛋白和免疫球蛋白通常掩盖十亿倍过量低丰度、低分子量蛋白质和肽3, 4。对于因此，在质谱分析之前需要几个样品制备步骤测序和鉴定。其中一个准备步骤是消耗商业上可买到的缺失柱高丰度蛋白质5-8.不幸的是，这一步骤导致候选生物标记物的产量降低因为它们通常与以下载体蛋白非共价结合正在删除。另一个挑战是候选人的稳定性生物标志物体外受精一旦采集到样本。蛋白质是易被内源性或外源性蛋白酶降解9.水凝胶纳米颗粒可以通过放大假设来超越这些关键挑战生物标志物浓度在检测范围内，同时保护降解后的蛋白质10-13.

值得注意的是，血液中的LMW蛋白是一种完整的小分子混合物蛋白质以及大蛋白质的片段。组织衍生蛋白质大于60kDa太大，无法被动地通过血管进入血流基底膜，但它们在血液中可以表现为肽或蛋白质碎片14我们的目标是测量新型循环生物标记物可以用于早期检测疾病、患者分层治疗，并监测治疗反应。我们的纳米颗粒是为了选择性地排除高丰度免疫球蛋白和白蛋白，同时捕获较小的蛋白质和肽并将其浓缩至100倍取决于起始音量。

我们小组确定了一组小有机染料，它们可以成功发挥高活性蛋白质和肽的亲和分子诱饵。人们认为蛋白质与眼睛结合这是由于疏水和静电相互作用的结合。这个染料上的芳香环通过疏水袋与蛋白质交织蛋白质表面11.

这些诱饵，取决于它们的化学性质，对选定的分析物类别。诱饵与载体蛋白如白蛋白竞争，用于蛋白质或肽。低分子量蛋白质/肽被困在粒子中。高分子量蛋白质，如白蛋白和由于筛分，免疫球蛋白无法进入颗粒水凝胶的限制性孔隙导致的性能11（图1).

水凝胶纳米粒子是由过硫酸铵11.N-异丙基丙烯酰胺（NIPAm），共单体丙烯酸（AAc）和烯丙胺（AA）以及交联剂N，N'-亚甲基双丙烯酰胺允许（BIS）在70°C的稀释条件下反应6小时11, 13.聚（N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸）的高蛋白结合亲和力通过共价结合实现（聚（NIPAm-co-AAc）纳米粒子含氨基染料(即.，磺化丹蒽醌三嗪染料）通过在水溶液或有机溶液中进行的酰胺化反应将其转化为纳米粒子溶剂取决于染料11, 13.中胺基的亲核取代利用含有蒽醌三嗪染料氯原子的纳米粒子创建含染料的聚（NIPAm-co-烯丙胺）（AA）纳米粒子11, 12.采用两步聚合工艺制备水凝胶纳米粒子含有乙烯基磺酸（VSA）外壳11, 13.

水凝胶纳米粒子可应用于各种生物流体，包括整体血液、血浆、血清、脑脊液、汗液和尿液。一步到位溶液中，纳米颗粒进行快速（几分钟内）隔离低分子量分析物的浓度10, 11, 13, 15-18.蛋白质随后从纳米颗粒中洗脱并使用western检测吸墨剂19-21，质谱法10, 11, 13, 15, 18, 22,23，免疫测定/ELISA10, 11, 15, 18或逆相蛋白微阵列16, 24分析。化学功能化纳米粒子诱饵，并呈现核心或核心外壳架构，捕获并集中注意力基于诱饵/外壳物理化学性质的蛋白质。不同的染料因此，加入纳米颗粒将捕获根据染料亲和力、溶液pH值和竞争性高丰度蛋白质的存在/缺失13此外，纳米粒子的数量与溶液体积的关系将影响纳米粒子中的蛋白质产量。水凝胶纳米粒子的这些方面收获演示了使用三种不同的纳米颗粒诱饵进行收获血浆样品和尿液中含有大量蛋白质的蛋白质通常不含大量蛋白质的样品。在本协议中，我们证明从使用聚（NIPAm-co-AAc）、聚（NIPAm/染料）和核壳的血浆样品纳米颗粒（Poly（NIPAm-co-VSA））。聚（NIPAm/染料）纳米粒子显示为集中分枝杆菌属添加到人类中的物种抗原尿液样本，以模拟结核分枝杆菌感染个人。

协议

收集健康志愿者的血浆和尿液乔治·梅森大学机构审查委员会（George Mason University Institutional Review Board）发布的知情同意书批准的协议。捐赠者在白人男性和年龄在25至42岁之间的女性。对样品进行单独分析未合并。

1.血清或血浆样品的纳米粒子处理

血浆中潜在的低丰度生物标记物在溶液中被捕获水凝胶纳米颗粒。粒子被添加到等离子体中，孵化，通过离心分离、洗涤，然后洗脱捕获的蛋白质。这个洗脱的蛋白质在氮气流下干燥，用于下游质谱分析测序和鉴定。

  1. 用50 mM TrisHCl pH 7（500µl血清+500µlTrisHCl）在微型离心管中。
  2. 添加500µL聚（NIPAm/AAc）核纳米粒子。培养15分钟室温。
  3. 在16100 x g，25°C的条件下，在配备离心机的环境中旋转样品10分钟带固定角度转子。清除并丢弃上清液。
  4. 向颗粒中添加500µl硫氰酸钠（25 mM）。重新花销通过上下多次用力吸液来制备纳米颗粒。
  5. 在16100 x g，25°C的条件下，在离心机中用定角转子。清除并丢弃上清液。
  6. 向纳米颗粒中添加500µl MilliQ水。重新花销通过上下多次用力吸液来制备纳米颗粒。
  7. 在16100 x g，25°C的条件下，在离心机中用定角转子。清除并丢弃上清液。
  8. 制备新鲜洗脱缓冲液：向300µl铵中添加700µl乙腈在干净的管子中加入氢氧化物。警告：氢氧化铵具有腐蚀性。使用适当通风。注：必须准备洗脱缓冲液在使用之前。不要储存洗脱缓冲液。
  9. 向纳米颗粒颗粒中添加300µl洗脱缓冲液。重新使用通过上下多次用力吸液来制备纳米颗粒。室温下培养15分钟。
  10. 在带有定角转子。取出洗脱液并将其保存在清洁的、贴有标签的容器中微型离心管。
  11. 重复步骤1.9–1.10。将两种洗脱液合并成一台微型离心机管。
  12. 在氮气蒸发器歧管中的氮气流下干燥洗脱液42.1°C，空气流量设置为8(图2F).
  13. 将干燥的洗脱液在室温下储存，以便O/N储存，或在-20°C下长期储存质谱分析、western blotting或ELISA分析前的储存（可选）。

2.尿液样品的纳米粒子处理

正常尿液中蛋白质含量低于30 mg/dl，血液含量低于1+。然而，许多疾病可能会改变尿蛋白和血液的正常水平。帮助确定添加到尿液中的纳米粒子的最佳体积样品，在采集纳米颗粒之前进行尿液分析。尿液生物标记物可能以极低的浓度存在，这可能需要优化纳米粒子与尿量的比例。本程序描述尿液样品的纳米颗粒采集用于下游westernblot分析。

  1. 在干净、干燥的塑料杯中收集尿样。最小容量22 ml是必需的。将尿液样本储存在-80°C下，直到可以进行分析。
  2. 在RT或4°C O/N下解冻冷冻尿液。在涡流上短暂混合搅拌机。将至少22毫升尿液倒入50毫升锥形底部聚丙烯管。
  3. 在离心机中以3700 x g的转速旋转尿液15次分钟。将尿液倒入干净的50毫升尿液中，不要搅动颗粒锥形底部聚丙烯管。丢弃颗粒。
  4. 使用多分析“尿液量尺”试剂条进行尿液分析。注意：将试剂条存放在一个密闭的容器中，远离阳光直射和湿度17, 18.
    1. 将试剂条面朝上放在干净干燥的纸上毛巾。
    2. 使用一次性移液管吸出1毫升尿液在步骤2.3中准备。
    3. 设置计时器2分钟，但不要启动。快速分配1-在试剂条的每个测试垫上滴2滴尿液。立即启动计时器。注意：不要将试剂条直接放在尿液容器中。这个试剂条中的染料/化学指示剂可能从试剂条中浸出到尿液容器中。
    4. 在试剂条容器上指示的时间，记录各种分析物的定性结果通过比较个体的颜色来提取试剂条相应色码指示器的试剂条在试剂容器上。典型的正常尿结果是：血液、蛋白质、白细胞（正常或阴性），亚硝酸盐、葡萄糖、酮类、胆红素和尿胆原；尿液pH值（5.5-7.0）；比重（1.001-1.020）。注：高尿样中的蛋白质水平可能与对纳米粒子上结合位点感兴趣的蛋白质。为了最大限度地利用纳米粒子获取蛋白质纳米颗粒体积/尿液体积比可以调整为要么限制高丰度蛋白质的竞争，要么可以优化以获取存在于极低水平的蛋白质浓度。如果尿蛋白值大于等于1+，在下面的步骤2.5中添加2倍体积的纳米颗粒。如果感兴趣的分析物是一种含量很低的蛋白质，它可能有必要将纳米颗粒的体积增加到2毫升（图3）.
  5. 将步骤2.3中的20 ml澄清尿液转移到干净的50 ml尿液中锥形底部聚丙烯管。请勿干扰任何碎屑/颗粒可能在尿管的底部。将200µl纳米颗粒添加到20毫升尿液样本。在涡流混合器上短暂混合。注意：如果尿蛋白值为1+或更高，添加400µl纳米颗粒至20ml尿液。
  6. 在室温下培养尿液/纳米颗粒混合物30分钟，不需要摇摆/混合。
  7. 在配备有以3700 x g旋转转子10分钟。注意：如果颗粒不是离心后可见，再旋转样品2–7分钟。
  8. 清除并丢弃上清液。将500µl MilliQ水添加到纳米颗粒。
  9. 通过大力上下多次移液，重新悬浮纳米粒子次。将纳米颗粒溶液转移至干净的1.5 ml微型离心管。
  10. 在配备固定角度转子的离心机中旋转纳米颗粒在16100 x g的温度下放置10分钟。注意：如果看不到颗粒，请执行以下操作离心，将样品再旋转2-7分钟。
  11. 清除并丢弃上清液。
  12. 用200µl 18 MilliQ水重复步骤2.8和2.11（两次），以清洗纳米颗粒。
  13. 制备新鲜洗脱缓冲液：向30µl铵中添加970µl乙腈在干净的管子中加入氢氧化物。警告：氢氧化铵具有腐蚀性。使用适当通风。注：必须准备洗脱缓冲液在使用之前。不要储存洗脱缓冲液。
  14. 向纳米颗粒中添加20μl洗脱缓冲液。重新花销通过上下多次用力吸液来制备纳米颗粒。室温下培养15分钟。
  15. 以16100 x g的速度旋转纳米粒子样品10分钟。取出并保存将上清液置于一个干净的1.5ml微量离心管中。不要中断纳米颗粒颗粒。将颗粒丢弃在生物危害垃圾桶中。
  16. 将样品放在化学通风柜的架子上。打开盖子在室温下培养30分钟。或者，将样品置于氮气在40°C下流动直至干燥（1-2小时）。
  17. 向样品中添加15µl Tris-glycine SDS样品缓冲液（2x）。加热温度100°C，在干热块中放置5分钟，盖子打开或直到管中剩余的体积不超过20µl。注意：不要使用沸水浴。水浴的湿度会阻止缓冲液蒸发。
  18. 将盖子放在管子上。从加热块上拆下管子。这个样品可储存在-80°C下或立即用于下游western blot分析。

具有代表性的结果

水凝胶纳米粒子尺寸和均匀性

聚（NIPAm-AAc）粒子产量极高批次之间和批次内的再现性。这些粒子具有很好的胶体捕获、储存和洗脱所需时间内RT的稳定性蛋白质（至少48小时），未观察到纳米颗粒沉淀(图1)11.胶体稳定性可能非常高对于纳米粒子快速吸收蛋白质/肽非常重要。

从血浆中采集的潜在低含量生物标记物

染料诱饵的加入推动了溶液中分子的吸收确保捕获的分子不会降解13, 15, 18,25因此，在采样期间不需要蛋白酶抑制剂预处理。纳米颗粒的这一特性使其适合作为现场样品采集和装运的保存技术RT的生物流体。

诱饵分子可以通过共聚或与纳米颗粒中存在的官能团共价结合。例如，用含氨基染料通过零长度交联酰胺化反应，而纳米粒子具有外层含壳乙烯基磺酸（VSA）共聚物由第二个聚合反应10-13不同类型的纳米颗粒可以是通过在纳米颗粒中加入不同的化学染料加强特定类别蛋白质的采集。我们的一个重要概念技术是不同的诱饵可以对不同的蛋白质，因为染料与蛋白质的相互作用主要依赖于疏水相互作用、三维相互作用和静电力。我们有观察到一些分析物可以通过化学方法以高亲和力捕获不同的染料由于结合力的复杂性。参见坦布罗等。有关此的详细解释和示例原理13例如，四种不同类型的诱饵使用200µl颗粒和每种纳米颗粒200µl等离子体。在所有情况下，使用通过SDS-PAGE和银检测，上清液中未检测到纳米粒子TNFα染色，而在纳米粒子洗脱液中可检测到TNFα(图1摄氏度). （车道1=重组TNFα（MW 17000 Da），车道2和3，4&5、6&7和8&9代表四种不同类型的纳米粒子诱饵；C=对照，S=上清液，P=纳米粒子洗脱液）。

不同类型N阳极的剂量反应

为了执行校准曲线，从而评估产量和精度，实验需要用已知浓度的加标蛋白进行。各种体液和分析物的已发表结果表明纳米粒子预处理保持了分析的线性，并建立了提高有效检测限的校准曲线10, 16,26。我们还发表了使用用于进行多反应监测质谱的纳米粒子提高灵敏度27.

为了比较不同类型纳米颗粒对IL-17的收集效率，将重组IL-17（17.5kDa）添加到血浆样品中随后添加聚（NIPAm-co-AAc）或聚（NIPAm-co-VSA）纳米粒子。两个在100µl中制备四组100 ng重组IL-17的连续稀释液血浆（100纳克/100µl、50纳克/100µl、25纳克/100µl和12.5纳克/100µl）。将聚（NIPAm-co-AAc）或聚（NIPAm-co-VSA）粒子添加到各自的以1:1（v/v）的颗粒：等离子体比例的等离子体样品。分光光度计总计对上清液样品进行蛋白质分析。蛋白质印迹之后，在20μg血浆上清（S）上进行抗兔多克隆IL-17试验纳米粒子采集和纳米粒子洗脱液（P）(图4).两种纳米颗粒类型均能充分收集并浓缩IL-17稀释。western blot上的其他条带代表人血清白蛋白和与二级抗体交叉反应的免疫球蛋白。（AAc颗粒：车道1&2=1 ng/µl IL-17，3号和4号通道=0.50 ng/¦Μl，5号和6号通道=0.25 ng/¦于Μl，车道7和8=0.125 ng/µl，车道9=IL-17；VSA粒子：车道1和2=1ng/µl IL-17，3号和4号车道=0.50 ng/μl，5号和6号车道=0.25 ng/μl，7号车道&8=0.125纳克/微升）。

尿中潜在诊断蛋白的检测

从健康志愿捐赠者处获取的人类尿液样本，并书面告知同意书中添加了重组分枝杆菌属物种抗原早期分泌靶向结核分枝杆菌蛋白（ESAT-6）以模拟结核分枝杆菌感染者。每个1微克将ESAT-6（15 kDa）和IL-2（15.5 kDa从健康志愿者那里收集。对样本进行尿液分析使用尿液试剂条确定纳米粒子与尿液的最佳比例，这是基于尿蛋白的存在/缺失。聚乙烯（NIPAm/染料）纳米粒子被用来从处理过的和未处理过的尿液中获取蛋白质样品。纳米颗粒洗脱液的一维凝胶电泳然后进行银染。U4和U6车道中的样本表示来自ESAT-6和IL-2处理的尿液样本的纳米粒子洗脱液，清楚地显示15 kDa时的显著带(图5). 洗脱液的质谱分析鉴定的ESAT-6（UniProt登录POA567，84.0覆盖率，9个肽）和IL-2（UniProt加入第60568页，38.56覆盖率，3肽）。不含纳米颗粒的尿液收割显示在标有“未加工”的车道上。

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图1。纳米粒子收获并浓缩低丰度蛋白质来自复杂的生物流体。 （A）收割工作流蛋白质。总处理时间约为1.5小时。溶液中的蛋白质为浓缩自血液、血清、血浆、尿液、汗液、唾液或其他体液（所示浓度为1000倍）。（B）批次间比较显示纳米粒子大小均匀。云母的原子力显微镜显示两批纳米颗粒。（C）1-D凝胶电泳，含后续银血浆中分离的肿瘤坏死因子α（TNFα）染色。请单击此处查看此图的放大版本。

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图2。血浆/血清中的纳米颗粒采集程序下游质谱分析。 （A）纳米粒子保持悬浮在溶液中（所示为聚乙烯（NIPAm/染料））。（B）纳米粒子添加到稀释的血浆样品中。（C）纳米颗粒塑料悬浮液在离心机中旋转，将纳米粒子从上清液。（D）离心后，纳米粒子形成一种独特的管底部有颗粒。（E）清洗纳米粒子后，含有收获的蛋白质的洗脱液被移除并保存用于下游分析。（F）洗脱液在蒸发器中的氮气流下干燥在42.1°C下，空气流量8，在质谱分析之前持续1-2小时。请单击此处查看此图的放大版本。

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图3。使用多分析试剂条进行尿液分析质量控制。（A）试剂条上的每个衬垫都浸有与不同尿液分析物反应的化学品、酶和/或指示染料(例如.，葡萄糖，胆红素，酮，比重，血液，pH，蛋白质、尿胆原、亚硝酸盐和/或白细胞酯酶）。尿液由离心。将一滴尿液添加到试剂条上的每个垫上。（B）将每个焊盘的颜色与色块进行视觉比较在容器上，在指定的时间。请单击此处查看此图的放大版本。

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图4。 从血浆中采集IL-17核（AAc）或核壳（VSA）纳米粒子。1-D凝胶抗IL-17的电泳和western blotting表明丙烯酸（AAc）和VSA核壳纳米粒子用于收集各种血浆中IL-17的浓度。（S=纳米粒子采集后的上清液，P=纳米粒子洗脱液。AAc颗粒：通道1和2=1 ng/µl IL-17，通道3&4=0.50 ng/µl，第5和第6道=0.25 ng/μl，第7和第8道=0.125 ng/μl，车道9=IL-17；VSA颗粒：通道1和2=1 ng/µl IL-17，通道3和4=0.50 ng/µl，车道5和6=0.25 ng/µ）请单击此处查看此图的放大版本。

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图5.的恢复结核分枝杆菌使用水凝胶从尿液中提取抗原和细胞因子IL-2纳米颗粒。1-D凝胶后的银染色尿液样品的电泳。通道U4和U6中的样品代表来自含有重组ESAT-6和IL-2的尿液样本，明显显示15 kDa的条带。ESAT-6（UniProt）洗脱液的质谱分析登录POA567，84.0覆盖率，9个肽）和IL-2（UniProt登录第60568页,38.56覆盖，3肽）。（RAW=未采集纳米颗粒的尿液；U1、U2、U3、，U5、U7、U8=纳米颗粒后缺乏重组ESAT-6和IL-2的尿液收割）。请单击此处查看此图的放大版本。

蛋白质名称胃肠道蛋白数血清/血浆浓度[ng/ml]参考
abl-interactor 1亚型a61743942未知
AMP活化蛋白激酶γ2亚基亚型a33186925未知
Cas-Br-M（小鼠）嗜生态逆转录病毒转化序列52426745未知
趋化因子（C-C基序）配体18（肺和激活-调节）45068313034
趋化因子（C-C基序）配体5225388141.531
软骨蛋白153251229未知
16号染色体开放阅读框808392875未知
Consortin公司213021160未知
防御素、α4、皮质他汀4503303未知
EF-hand域家族，成员D220149675未知
糖蛋白Ib（血小板），β多肽4504073未知
鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G蛋白），q多肽40254462未知
乙酰肝素酶148746204未知
胰岛素样生长因子2（生长激素A）18908384610030
催乳素15187164未知
白细胞衍生趋化因子259806345200,00033
lipocalin 2（癌基因24p3）384554020.0528
单甘油脂肪酶，亚型CRA_b6005786未知
N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白47933379未知
单切口同源盒2119220564未知
精子尾部外密纤维4171184433未知
腭、肺和鼻上皮相关18765705未知
肽聚糖识别蛋白2156616294未知
血小板衍生生长因子α多肽77695917429
蛋白质CASC315721939未知
RAB27B，RAS癌基因家族成员5729997未知
Ras关联（RalGDS/AF-6）域家族6亚型29789443未知
ras相关GTP-结合蛋白RAB1033695095未知
无名指蛋白16630520320未知
血清剥夺反应（磷脂酰丝氨酸结合蛋白）4759082未知
溶质载体家族33（乙酰辅酶A转运蛋白），成员14757708未知
ST6β-氨基半乳糖α-2,6-唾液酸转移酶1亚型a277650911532
胸腺肽样334013530未知
分裂3（E（sp135）同源物的转导蛋白样增强子，果蝇）157384982未知
转谷氨酰胺酶14507475未知
WD重复域19257257未知
WD重复域91222080092未知
新肌动蛋白结合重复序列含2119372317未知

表1。例子低丰度蛋白质由血清/血浆中的纳米粒子。（肽Atlas肽球团光谱法）28-34.适应参考许可13（丹伯罗，D。et（等）阿尔。多功能核壳纳米粒子：先前的发现无形生物标记物。美国化学会志,133, 19178-19188,(2011).) 2011美国化学学会版权所有。

讨论

临床相关性

血清或血浆样本被认为含有低丰度循环蛋白和能够提供有关有机体作为一个整体。尽管血清蛋白质组学前景看好，但有三种阻碍生物标记物发现的基本和严重生理障碍转化为临床效益10, 11, 16, 25.

1.重要的诊断生物标志物可能以极低的丰度存在（浓度）在血液中。早期病变组织，如转移前癌症病变，可能构成小于几毫米三.生物标记物流入如此小的组织体积的循环将在整个组织中被高度稀释血容量。相关分析物可能存在于质量检测极限以下光谱分析和常规免疫分析。

2.高丰度的存在掩盖了低丰度生物标志物/蛋白质蛋白质，如白蛋白和免疫球蛋白，占血浆的90%蛋白质组14.

3.蛋白质和肽容易被内源性和外源性降解静脉穿刺和样品运输/储存后的蛋白酶。蛋白质降解可能导致假阳性或假阴性结果35.

水凝胶纳米粒子是一种多孔、有浮力的聚合物，含有用于蛋白质和肽的蒽醌三嗪染料和/或乙烯基磺酸壳体液的采集和保存11, 13.我们小组合成了并测试了使用过多有机染料功能化的水凝胶纳米粒子(即磺化和非磺化蒽醌三嗪染料）并显示了几种蛋白质分析物的优先亲和力11,13我们还制定了使用水凝胶的生物标记物发现方案含有淋巴、唾液、脑脊液、汗液、尿液、血浆、血液、，或血清样本11, 13, 23, 24, 26.

在从中获取蛋白质之前，优化纳米粒子采集参数理想的结果需要宝贵的临床/研究标本。金额应量化样品中的蛋白质，以确定纳米颗粒与样品体积之比。对于未知浓度的分析物，a使用重组蛋白的剂量-反应曲线提供了有关检测极限。如果有足够的样品，各种类型的纳米颗粒可以用于确定分析物和样品的理想纳米粒子。

纳米颗粒采集前的尿液分析提供尿液样本质量控制检查。纳米粒子染料诱饵的亲和力取决于感兴趣的蛋白质和周围培养基的pH值。尿液pH值在5.5之间7.0对于用聚（NIPAm/染料）纳米颗粒收获蛋白质是最佳的。存在溶血或完整的红细胞（试剂条上有1+血）不会干扰纳米颗粒的收获。

在本方案中，我们重点研究了水凝胶纳米粒子在以下方面的应用：从血浆和尿液中提取蛋白质。未来的应用可能包括其他体液，如眼睛的玻璃体或滑液。潜力在里面活泼地可以预见未来的应用程序纳米颗粒被注射到病变组织中以收集生物分子。未来的工作还将重点开发用于捕获和保存生物标记物，例如纳米颗粒皮肤贴片，用于分析皮肤渗出液蛋白质组。

披露

本杰明·埃斯皮纳是Ceres Nanosciences，Inc.的员工，该公司生产试剂在本文中使用。Lance Liotta、Alessandra Luchini和Virginia Espina控股所用纳米技术的专利（美国专利7935518和/或8497137）在本条中。作为大学雇员，他们有权从这些专利符合大学政策。兰斯·利奥塔和亚历山德拉·卢奇尼Ceres Nanosciences的股东，并在科学咨询委员会任职。

致谢

都柏林城市大学的迈克尔·亨利（Michael Henry）在数据收集和分析如所示图5这项工作得到了（1）的部分支持乔治·梅森大学，（2）意大利卫生高级研究所美国国务院意大利/美国合作协议框架乔治·梅森大学和意大利卫生与公共服务部公共卫生，（3）NIH，IMAT项目授予1R21CA137706-01和1R33CA173359-01LAL和（4）Ceres纳米科学公司。

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