半胱氨酸分解代谢：一种促进胶质母细胞瘤生长的新代谢途径

全球代谢组学和靶向代谢物定量

代谢组学研究是在Metabolon Inc.使用先前描述的方法进行的(9). 简言之，代谢谱分析结合了三个独立的平台：针对基本物种优化的超高效液相色谱/串联质谱（UHPLC/MS-MS）、针对酸性物种优化的UHPLC-MS-MS和气相色谱/质谱（GC/MS）。通过将实验样品中的离子特征与包括保留时间、分子量在内的化学标准条目参考库进行自动比较，确定代谢物(米/z)、首选加合物和源片段以及相关MS光谱，并使用Metabolon开发的软件通过目视检查进行质量控制(15). 使用“对” (16)和韦尔奇t吨进行测试以比较实验组之间的数据。通过使用q个值(17).

通过同位素稀释UHPLC/MS-MS分析CSA的绝对定量。在水中制备校准和内标溶液。用50μL内标溶液（10μg/mL CSA-D）加标组织（30±10 mg）₄根据Santhosh-Kumar及其同事编写(18)，70μL水和300μL乙腈，并在Geno-Grinder 2010中同时在珠状物存在下均质/提取。离心后，在配备Ascentis Express HPLC HILIC的Waters Acquity/Termo Quantum Ultra LC/MS-MS上分析5μL上清液，2.7μm，2.1×50 mm色谱柱（Supelco），使用0.5%甲酸水溶液/乙腈梯度。质谱条件为选择性反应监测、负电离模式和HESI源，监测的跃迁为CSA，米/z152 ≥ 88; CSA-D公司₄,米/z156 ≥ 92. 使用10个校准标准（0.01至10μg/mL）生成的加权线性最小二乘回归分析进行定量。

半胱氨酸双加氧酶1表达

通过Western blot分析和免疫组织化学（IHC）评估半胱氨酸双加氧酶1（CDO1）的表达。使用CDO1抗体（Abcam；ab53436）进行蛋白质印迹分析。使用ImageJ（NIH，Bethesda，MD）对印迹进行量化，并将单个样本的CDO1表达归一化为负荷对照（β-actin）。使用免疫组织化学染色来确定从US Biomax（GL 103a）购买的神经胶质瘤组织微阵列上CDO1的表达。按照制造商的方案，使用Ventana Discovery XT自动系统（Ventana-Medical Systems）对载玻片进行染色，并用苏木精进行反染色。使用Aperio ScanScope XT扫描幻灯片，并使用之前描述的Aperio Nuclear v9.1算法进行图像分析以量化CDO1表达(19).

细胞培养

人类胶质母细胞瘤细胞系U251、T98G和U87是从美国类型培养物收集中心（ATCC）获得的，并在RPMI-1640（U251；GIBCO）或补充10%灭活FBS的Eagle Minimum Essential Medium（U87和T98G；ATCC）中生长。Austin Smith（英国剑桥大学），由BioRep发行(20)，并在上述条件下生长(19). 作者在过去6个月内没有进行细胞系鉴定。

稳定的CDO1敲除细胞的建立

使用短发夹RNA（shRNA）慢病毒颗粒进行U251细胞克隆（sc-91642-v；Santa Cruz Biotechnology）。shRNA–对照组由对照shRNA慢病毒颗粒（LP-Neg-LV 105-0200；Genecopoeia Inc.）转染。根据制造商的方案，将细胞接种在12孔板中，生长到80%的汇合处，并在存在聚brene（5μg/mL；Santa Cruz Biotechnology）的情况下感染shRNA超过48小时。在存在嘌呤霉素（2μg/mL；Sigma）的情况下选择并分离稳定菌落。

氧气消耗率

使用海马细胞外通量分析仪（XF24；Seahorse Bioscience）测量实时耗氧率（OCR）。细胞接种在各自的培养基中过夜。实验前一小时，用Seahorse分析培养基清洗细胞并更换培养基。通过气动注入口，以规定的浓度将指示化合物或载体控制物直接注入油井。对于柳氮磺胺吡啶实验，在每次实验前6小时对细胞进行预处理（200μmol/L）。将读数标准化为总蛋白，并使用Seahorse软件分析数据，未配对t吨测试用于测试更改的重要性。

线粒体分离

约150×10⁶细胞被用来分离线粒体。细胞在冰镇的PBS中轻轻刮擦并以600×克在4°C下保持10分钟。弃去上清液，将细胞重悬于3 mL冰冷的分离缓冲液中（10 mL 0.1 mol/L Tris–MOPS，1 mL EGTA/Tris，20 mL 1 mol/L蔗糖，溶于69 mL蒸馏水中，pH 7.4）。然后用预冷的聚四氟乙烯杵在玻璃器皿中使细胞均匀化。然后以600×克在4°C下保持10分钟。将上清液转移到玻璃离心管中，并以7000×克在4°C下保持10分钟。丢弃上清液，将线粒体颗粒重新悬浮在冰镇隔离缓冲液中。用双缩脲法测量线粒体浓度，并将浓度调整至约50 mg/mL。

线粒体膜电位

JC-1分析试剂盒（Cayman Chemical Company）是根据制造商的协议使用的。使用徕卡TCS SP5 AOBS激光扫描共聚焦显微镜，通过63X/1.4NA Plan Apochro油浸物镜（徕卡微系统CMS GmbH）拍摄显微图像。值得注意的是，使用405二极管、氩488和HeNe 543激光线来激励样品，并使用可调谐发射来最小化荧光色素之间的串扰。使用光电倍增管探测器捕获每个样品的图像，并使用LAS AF软件版本2.6（徕卡微系统）进行准备。

丙酮酸脱氢酶活性

使用丙酮酸脱氢酶（PDH）酶活性微孔板检测试剂盒（Abcam；ab109902）。细胞在100毫米培养皿中生长至80%汇合。处理后，将细胞放入冰镇PBS中，并遵循制造商的方案。

ATP量化

使用ATP测定试剂盒（Invitrogen）。细胞在100 mm培养皿中生长到80%的汇合处。分别处理后，将细胞放入冰镇PBS中，并遵循制造商的方案。

细胞凋亡

使用caspase-3凋亡试剂盒（BD Biosciences），遵循制造商的方案，并通过荧光激活细胞分选（FACS）进行分析。

氧化还原应激

安·H₂-使用Invitrogen公司的DCFDA（二氯荧光素，双乙酸酯）试剂盒，并根据制造商的方案通过FACS进行分析。

动物处理

全部体内实验根据机构指南进行，并由机构动物护理和使用委员会（4031R）批准。使用先前描述的方法在无胸腺nu/nu小鼠（Charles River Laboratories）中建立异种移植瘤(19). 对于颅内肿瘤，小鼠被麻醉，显示细胞悬液（10⁶用立体定向仪注射细胞（10μL），并在神经症状明显时处死。使用Kaplan–Meier曲线并计算对数-秩和值来分析生存率。

CSA调节线粒体功能

由于CSA在胶质瘤发生中的作用尚未被探索，我们的初步研究集中于使用Seahorse XF细胞外通量分析仪的一般细胞代谢。在胶质母细胞瘤神经干细胞系G179的不同治疗条件下，CSA的外源性暴露持续导致细胞耗氧量降低(图2A和补充图S3A;参考20). 这一观察在添加丙酮酸以促进有氧呼吸的治疗条件下尤其显著。当我们将研究扩展到已建立的胶质母细胞瘤细胞系U251和T98G时，也观察到类似的结果(补充图S3B). 在CSA减弱细胞呼吸的初步观察基础上，我们试图确定用CSA预处理细胞是否可以调节丙酮酸诱导的耗氧量。如中所示图2BCSA暴露于葡萄糖和丙酮酸缺乏的细胞中，线粒体耗氧量减少36%±1%。正如预期的那样，丙酮酸的添加增加了耗氧量（54%±3%）；然而，这种增加在暴露于CSA的细胞中减弱，仅表明耗氧量增加了25%±3%(P（P）<0.001），进一步支持CSA在调节线粒体呼吸中的作用。接下来，我们试图通过激活参与CSA生物合成的代谢途径来重述观察到的细胞呼吸变化。我们首先评估了CDO1在一组胶质母细胞瘤细胞系中的表达，即参与CSA合成的酶。与组织样本一致，CDO1在细胞系中有差异表达，在U251和G179细胞中表达相对较高，在T98G和U87中几乎没有表达(补充图S4A). 然后，我们试图确定负责CSA生物合成的上游代谢产物，我-胱氨酸在星形胶质细胞和神经元之间的串扰中有着公认的作用，它可以通过此途径代谢，对细胞呼吸产生与CSA相似的影响。因为我-胱氨酸需要2.0的pH才能溶解，这些研究中使用了pH控制。如所示图2C,我-胱氨酸（100μmol/L）对CDO1表达细胞株U251的细胞呼吸的抑制作用与CSA相似。为了更明确地将CSA积累相关的代谢途径归因于观察到的细胞呼吸变化，我们使用基于慢病毒的shRNA（shCDO；补充图S4B). 添加我-胱氨酸对shCDO细胞不再调节细胞呼吸，而CSA在该细胞系中继续保持其活性(图2D和补充图S5A). 确定是否我-胱氨酸诱导的呼吸变化归因于细胞通过系统x的摄取_c（c）⁻运输者，我们用系统x预处理细胞_c（c）⁻抑制剂柳氮磺胺吡啶(13)彻底消除了我-胱氨酸对耗氧量的影响(图2E). 此外，添加CSA下游代谢物次黄嘌呤后，未观察到CSA诱导的OCR变化(补充图S3C). 总之，这些发现支持半胱氨酸分解代谢通过CDO调节轴减弱胶质母细胞瘤细胞的细胞呼吸的概念。

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图2

CSA调节胶质母细胞瘤细胞的线粒体功能。A、 CSA（1mmol/L）在所述条件下减弱G179细胞中的OCR。G公司⁺/P（P）⁻(P（P）= 0.003); G公司⁺/P（P）⁺(P（P）< 0.001). B、 CSA预处理减弱丙酮酸诱导的OCR(P（P）= 0.001). C、，我-胱氨酸减弱U251 shControl细胞中的OCR(P（P）= 0.008); 然而，在CDO1稳定敲除细胞（shCDO；P（P）= 0.72). E、 用xc系统预处理细胞⁻抑制剂柳氮磺胺吡啶（200 mmol/L）减弱我-胱氨酸诱导OCR降低(P（P）< 0.001). F和G、CSA（1 mmol/L）和我-胱氨酸（100μmol/L）抑制ATP合成(P（P）< 0.001; F） 并增加U251的线粒体电位（由JC-1分析中红绿比的增加决定；G）(P（P）= 0.012). 结果代表了至少三个独立实验。G、 葡萄糖；P、 丙酮酸；C、，我-胱氨酸；H、 盐酸；S、 柳氮磺胺吡啶。

我们继续确定CSA诱导的细胞呼吸减弱是否转化为影响线粒体功能的其他方面。丙酮酸进入线粒体允许ATP通过电子传递链生成，从而导致H流出⁺导致线粒体膜电位降低(22,23). 如所示图2F，丙酮酸的添加导致了ATP生成的预期增加，这被CSA和我-胱氨酸。为了研究线粒体电位，我们使用JC-1分析(24)，这是一种荧光染料，随着线粒体膜电位的降低从红色变为绿色，表明氧化磷酸化增加。最初的研究使用代谢调节剂二氯乙酸作为概念证明。先前研究表明，二氯乙酸可抑制PDH激酶（PDK），PDK是PDH的内源性抑制剂。通过抑制PDK，二氯乙酸反过来激活PDH，从而增加进入线粒体的糖酵解通量并降低线粒体膜电位(23). 添加二氯乙酸导致耗氧量预期增加(补充图S5B)红绿比下降(图2G和补充图S5C)与线粒体膜电位降低和氧化磷酸化增加相对应，这与之前描述的作用机制一致(23). 接下来，我们评估了CSA在调节丙酮酸诱导的线粒体电位变化中的作用。与代谢结果类似，丙酮酸的添加导致氧化磷酸化的预期增加，导致线粒体膜电位降低。在这些条件下添加CSA增加了红绿比，与膜电位增加和氧化磷酸化降低一致(图2G和补充图S5C).

CSA抑制PDH活性

我们继续确定CSA在我们描述的模型中抑制细胞呼吸的机制。氧化磷酸化涉及丙酮酸进入线粒体，线粒体通过柠檬酸循环代谢。这导致NADH和FADH2的生成，它们被电子传输链氧化，导致质子梯度。氧作为终端电子受体并还原为H₂细胞色素C氧化酶。电子传递链产生的质子梯度驱动ATP合成酶形成ATP。作为初步研究，我们分离了U251细胞中的线粒体，以确定CSA对耗氧量的影响是否涉及抑制线粒体内氧化磷酸化的其中一个步骤。如所示补充图S5D添加丙酮酸（而非葡萄糖）会增加分离线粒体的耗氧量。与全细胞相比，添加CSA不会影响分离线粒体的OCR。这表明CSA通过抑制丙酮酸进入线粒体来调节OCR。因此，我们评估了CSA抑制PDH活性的潜力，PDH活性是一种调节线粒体糖酵解通量的门控酶图3A在U251中添加CSA导致PDH的剂量依赖性抑制，最大抑制约为64%±4%。与上述涉及细胞呼吸的发现类似，上游代谢物的添加我-胱氨酸对CDO1表达细胞株U251的PDH活性也有类似的抑制作用。在T98G细胞中也观察到CSA对PDH活性的抑制；然而，我-胱氨酸在这个不表达CDO1的细胞系中没有抑制PDH活性(图3B)，进一步支持了该代谢途径在观察到的PDH活性抑制中所起的作用。作为事实证明，我们使用二氯乙酸进行了类似的研究。正如预期的那样，在这些条件下添加二氯乙酸导致PDH活性增加约23%±2%(图3C). 有趣的是，当二氯乙酸与CSA结合时，观察到的PDH活性增加被消除，进一步支持了该代谢物通过调节PDH活性抑制氧化磷酸化的作用。

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图3

CSA抑制胶质母细胞瘤细胞中的PDH活性。A、 CSA和我-胱氨酸导致U251中PDH活性的剂量依赖性抑制(P（P）< 0.007). B、 加拿大标准协会(P（P）<0.005），但不是我-胱氨酸(P（P）=0.67）抑制非CDO表达细胞系T98G中的PDH活性。C、 二氯乙酸（DCA；1 mmol/L）增加U251的PDH活性(P（P）=0.003），通过CSA（1 mmol/L；P（P）= 0.117). 结果代表了至少三个独立实验。

赠款支持：这项研究得到了美国陆军医学研究与装备司令部国家功能基因组中心项目的支持，授予编号为W81XWH-08-2-0101。美国癌症协会（RSG-11-029-01-CSM；P.钦奈扬）和东南脑肿瘤基金会（P.钦奈扬）提供了额外资金。