人类多能干细胞（hPSCs），如胚胎干细胞（ESCs）1和诱导多能干细胞（iPSCs）2是再生治疗和人类疾病建模的重要细胞来源三-5.体外从hPSCs生成人类类器官为生成多细胞3D结构提供了前所未有的策略，该结构再现了上皮和间充质组织的重要特征6-9例如，人类肠道类有机物（HIO）技术为人类肠道发育中基因缺陷的功能建模和修复提供了强大的平台10,11以及慢性疾病模型的建立，如炎症性肠病12.
为了产生HIOs，在Matrigel™涂层的基质中使用生长因子培养和分化hPSCs，产生3D肠道球体，这些球体被收集并封装在Matrigel™中以扩展为HIOs13Matrigel™是由Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞分泌的ECM蛋白、蛋白多糖和生长因子的异质复杂混合物14这是HIO三维增长和扩展所必需的。然而，Matrigel™存在乐透到乐透的成分和结构变异性，重要的是，这种肿瘤衍生基质的临床转化潜力有限15事实上，最近有报道称，Matrigel™的合成替代品支持小鼠肠道干细胞扩张和类器官形成15.
这里，我们描述了一种完全合成的水凝胶在体外从未经Matrigel™封装的人类ESC和iPSC衍生的3D球体中生成肠道类有机物，并促进其植入和小鼠结肠粘膜伤口的愈合。水凝胶力学性能和粘附配体类型是工程合成ECM模拟物的关键参数，该模拟物支持HIO的生存能力、扩展和开发。此外，这种合成水凝胶作为一种可注射的载体，通过结肠镜将HIO输送到肠道伤口，从而实现器官存活、植入和伤口修复。该合成基质的模块化设计和通过内窥镜技术进行输送的能力支持了该输送平台用于再生医学的转化潜力，并克服了Matrigel™用于基于hPSC的类器官技术的相关限制。
工程水凝胶支持HIO生存能力我们选择了一种基于四臂聚乙二醇（PEG）大分子单体的水凝胶平台，每个末端都有马来酰亚胺基团（PEG-4MAL）(补充图1a)具有高细胞相容性，毒性和炎症最小体内16,17此外，这种水凝胶系统由于其明确的结构、生物功能基团的化学计量合并以及可调的反应时间尺度，具有显著的优势就地凝胶化体内应用16,17.
用粘附肽对PEG-4MAL大分子单体进行功能化，并在细胞存在下交联以生成PEG-4MA水凝胶(补充图1a、b). 通过改变聚合物密度调整水凝胶的机械性能(补充图1c、d). 我们研究了支持首次在Matrigel™中生成的ESC衍生HIO活性的水凝胶配方。在Matrigel™中培养HIO后，将其回收并封装在PEG-4MAL水凝胶配方中(补充图1e). 因为ECM的机械特性影响上皮细胞的行为18，我们研究了控制水凝胶机械性能的水凝胶聚合物密度（3.5-6.0%wt/vol）的影响(补充图1c、d)，封装后第7天HIO存活率(). 作为参考，Matrigel™的机械性能（G′=78 Pa，G〃=5.8 Pa）在3.5-4.0%PEG-4MAL配方的范围内。这些合成水凝胶被设计为呈现恒定的2.0 mM RGD粘附肽（GRGDSPC）密度，并与蛋白酶降解肽GPQ-W（GCRDGPQGIWGQDRCG）交联。选择这种粘附肽类型和密度是因为它们在PEG-4MAL水凝胶中支持高上皮细胞活性和囊肿形成18蛋白酶降解交联肽对细胞依赖性基质重塑、细胞迁移和生长是必需的18,19包埋在3.5%和4.0%PEG-4MAL凝胶中的HIO生长为带有上皮和中央管腔的囊肿，在培养基中保持至少7天的高活性，与Matrigel™中HIO的生长和活性相当(). 有机物活性区域的量化表明，3.5%或4.0%PEG-4MAL凝胶中嵌入的HIO与Matrigel™中的HIO之间没有显著差异(). 相比之下，与嵌入3.5%、4.0%PEG-4MAL凝胶或Matrigel™中的HIO相比，封装在5.0%或6.0%PEG-4-MAL水凝胶中的类有机物在封装后第7天的存活率显著降低(). 这些结果表明聚合物密度对PEG-4MAL水凝胶中HIO存活的影响。尽管3.5%的PEG-4MAL水凝胶支持高HIO活性，但与4.0%的PEG 4MAL水凝胶相比，该配方在培养7天后的机械稳定性较差。因此，我们选择4.0%PEG-MAL水凝胶进行后续研究。
PEG-4MAL聚合物密度和粘附配体类型控制HIO活性（a） 在不同聚合物密度或Matrigel™的PEG-4MAL水凝胶中培养的HIO的透射光和荧光显微镜图像。在封装后7天评估HIO的生存能力。棒材，500μm。（b） 封装7天后，活或死的总类有机物面积染色百分比（平均值±SEM）（所有组分析的5种类有机物，4.0%组分析的6种类有机质除外）。（c） 在4.0%PEG-4MAL水凝胶中培养的HIO的透射光和荧光显微镜图像，该水凝胶具有不同的粘附肽或Matrigel™功能。封装后7天评估HIO存活率。棒材，500μm。（d） 封装7天后，活或死的总类有机物面积染色百分比（平均值±SEM）（除AG73和Matrigel组分析的6种类有机物外，所有组分析的5种类有机质）。（b，d）使用Tukey的多重比较测试进行的单因素方差分析显示，（b）4.0%PEG-4MAL或Matrigel™与5.0%或6.0%PEG-4 MAL之间，以及（d）PEG-4MAP-RGD或Matrigle™与PEG-4MAC-GFOGER或-IKVAV之间存在显著差异。(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001). （a-d）进行了三个独立的实验，并提供了其中一个实验的数据。每个独立实验均使用每个实验组6个凝胶样品（PEG-4MAL，Matrigel™）进行。源数据位于补充表1.
粘附受体和ECM之间的相互作用为细胞生存、增殖和分化提供关键信号20因此，我们检查了合成水凝胶中的粘附配体类型是否影响HIO活性。将有机物嵌入聚合物密度为4.0%、GPQ-W交联肽密度恒定但具有不同半胱氨酸端接的粘附肽（均为2.0 mM；)：RGD，层粘连蛋白α1链衍生AG73（CGGRKRLQVQLSIRT）21，I型胶原蛋白模拟三螺旋GFOGER（GYGGGP（GPP）5GFOGER（GPP）5GPC）22和层粘连蛋白α1链衍生IKVAV（CGGAASIKVAVSADR）23由于水凝胶的粘附肽功能化大分子单体构建块是对称的，并形成完全膨胀的规则网状结构，因此粘附肽在整个水凝胶网络中均匀分布在网状尺寸的“统计平均值”内（30-40 nm）。此外，由于PEG大分子单体臂的较小尺寸和凝胶的膨胀状态，粘附肽的流动性非常有限，并且粘附肽没有有效的聚集18然而，不能完全排除纳米级粘附肽密度的变化。RGD功能化水凝胶中封装的有机物在封装后至少7天内保持高活性(;)类似于Matrigel™中的生存能力。相比之下，用AG73、GFOGER或IKVAV功能化的PEG-4MAL水凝胶封装的类有机物在封装后7天的存活率降低(). 对RGD的粘附是HIO生存能力所必需的，因为包封在水凝胶中的类有机物在包封后7天表现出活性降低，呈现无活性的扰乱肽（RDG）(). 最后，在与非降解分子交联的水凝胶（DTT，)，证明HIO的长期存活需要可降解基质。综上所述，这些结果确定了一种工程水凝胶配方（4.0%聚合物密度，2.0 mM RGD粘附肽，GPQ-W交联肽），该配方支持既定HIO的高存活率，并用于所有后续实验。
工程PEG-4MAL支持HIO开发（a） 在用（a）RGD、（b）无活性、无序的RDG肽或（c）不可降解交联剂（DTT）官能化的4.0%PEG-4MAL水凝胶中培养的HIO的透射光和荧光显微镜图像。封装后7天评估HIO存活率。（d，e）在（d）4.0%PEG-4MAL-RGD水凝胶或（e）Matrigel™中培养的Matrigel-生成HIO的透射光学显微镜图像。棒材，500μm。（f，g）HIO在4.0%PEG-4MAL-RGD水凝胶或Matrigel™中封装后7天的荧光显微镜图像，并标记有（f）β-CATENIN、增殖细胞（KI67）和（g）上皮顶端极性（EZRIN）和紧密连接（ZO-1）。DAPI，复染色。“L”表示HIO流明。棒材，100μm。（a-g）进行了三个独立的实验，并提供了其中一个实验的数据。每个实验组使用（a-c）4、（f、g）6或（d、e）12个凝胶样品（PEG-4MAL、Matrigel™）进行每个实验。
工程水凝胶支持HIO开发
接下来，我们检查了在工程水凝胶培养期间HIO的维持。在培养的几天里，已建立的HIO的大小增加，形状改变，保持中心管腔，并在与水凝胶的界面上显示出上皮萌芽(). 此外，观察到间充质细胞迁移到水凝胶中，类似于Matrigel™中维持的HIO(). 为了进一步表征HIO的肠上皮，我们检测了Matrigel™中产生的HIO和转移到工程PEG-4MAL水凝胶中的HIO的细胞增殖和根尖极性。培养7d后，HIO对KI67染色阳性，表明细胞增殖，显示顶端（EZRIN）和基底外侧（β-CATENIN）蛋白适当极化，上皮紧密连接蛋白（ZO-1）定位24(). 比较PEG-4MAL水凝胶和Matrigel™中维持的HIO时，染色模式相似()，证明工程PEG-4MAL水凝胶能够有力支持HIO维护。
使用Matrigel™生成HIO是类器官技术临床转化的基本障碍。因此，我们研究了工程PEG-4MAL水凝胶是否支持hESC衍生肠道球体的存活以及在不嵌入Matrigel™的情况下生长为HIO。在Matrigel™涂层基质上诱导肠道谱系4-5天后，小的3D肠道球体自组装并从培养的单层中萌芽出来，与Matrigel™失去接触。从培养基中收集分离的、漂浮的表达mCherry的肠道球体，并将其封装在聚合物密度范围（3.5%-12.0%）的PEG-4MAL水凝胶中(补充图1f)检查一系列机械性能(补充图1c、d). 所有这些水凝胶均被设计为呈现2.0 mM RGD粘附肽，并与GPQ-W交联。嵌入3.5%和4.0%PEG-4MAL中的球形物在封装后2 h保持活性，并在封装后5 d生长为类似于高活性有机物的较大结构(). 相反，与包埋在3.5%或4.0%PEG-4MAL中的球体相比，包埋在8.0%和12.0%PEG-4MAL水凝胶中的球体在包埋后2小时显示出显著较低的生存能力(). 在hESC和hiPSC衍生球体之间观察到一致的结果(补充图2). 封装在4.0%PEG-4MAL中的hiPSC衍生肠道球体在封装后5天生长为具有高活性的类有机物，并在3周后发展为类似于Matrigel™中封装的球体的HIO(补充图2a、b). 相比之下，8.0%PEG-4MAL水凝胶中包裹的hiPSC衍生球体在包裹后1天的存活率很低(补充图2c).
在无Matrigel的情况下，PEG-4MAL聚合物密度调节肠球体产生HIO™嵌入。不同聚合物密度或Matrigel™的PEG-4MAL水凝胶中培养的mCherry-球体的透射光和荧光显微镜图像。在封装后2小时（第0天）、PEG-4MAL条件下第5天和Matrigel™条件下第3天通过Calcein-AM标记评估球体的存活率。棒材，100μm。存活率量化为活体或死体染色的总球体或类器官面积的百分比（平均值±SEM；n=5个按条件/时间点分析的类器官）。Tukey多重比较测试的单因素方差分析显示，第0天3.5%或4.0%PEG-4MAL与8.0%或12.0%PEG-4ML之间存在显著差异(****P（P）< 0.0001). （b） 在4.0%PEG-4MAL-RGD水凝胶中封装后，HIO投影面积和（c）Feret直径在不同时间点归一化为第0天的值(
)或Matrigel™（■）（每个时间点，PEG-4MAL的n=6个有机物，Matrigel™的n=4个有机物）。重复测量的双向方差分析显示矩阵类型之间没有显著差异(P（P）> 0.05). 线表示每个时间点上各个数据点的平均值。（d，e）HIO在4.0%PEG-4MAL-RGD水凝胶或Matrigel™中封装后21天的荧光显微镜图像，标记有（d）β-CATENIN、增殖细胞（KI67）和（e）上皮顶端极性（EZRIN）和紧密连接（ZO-1）。DAPI，复染色。“L”表示HIO流明。棒材，100μm。进行了三个独立的实验，并提供了其中一个实验的数据。每个实验组使用6个凝胶样品（PEG-4MAL，Matrigel™）进行每个实验。源数据位于补充表1.
球体和HIO活性对水凝胶聚合物密度的强烈依赖性表明，这些合成基质的机械性能调节类有机物的存活。然而，不同的聚合物密度也会改变这些网络的网格大小，这可能会影响水凝胶的扩散特性。在本研究中检测的整个聚合物密度范围内（3.5%-12.0%），不可能将机械性能与扩散性能分离。然而，我们比较了不同大分子单体尺寸（20 kDa vs.40 kDa）但不同聚合物密度（4.0%vs.8.0%）的RGD功能化水凝胶中的类有机物活性和尺寸，并设计成具有等效交联密度(补充图3a-c). 由于大分子单体臂长的差异，这些水凝胶表现出不同的扩散特性/渗透性，但由于等效的交联密度，它们具有等效的机械性能18ESC衍生的球体在两种水凝胶配方中封装5天后正常发育为HIO，HIO活性无差异(补充图3a、b)，投影面积和沿投影面积的两点之间的最长距离没有差异（费雷特直径；补充图3c). 这些结果表明，聚合物密度依赖性球体的存活和发展为HIOs与水凝胶的力学性能有关。此外，我们评估了已知机械传导途径对球体存活的作用。抑制yes-associated protein（YAP）的核转位，这与肠干细胞自我更新的机械转导和调节有关15与溶媒对照组相比，使用维替泊芬导致包裹在PEG-4MAL水凝胶中的球体显著细胞死亡(补充图3d-f). 用抑制肌球蛋白II和Rho相关激酶的布利司他丁或Y-27632治疗25,26分别导致封装后第1天细胞凋亡和球形死亡的剂量依赖性增加(补充图3d-f). 这些结果初步表明，YAP和细胞收缩力在人类肠道球体存活和发育为HIO的初始阶段非常重要。
接下来，我们分析了工程合成基质（4.0%聚合物密度，2.0 mM RGD，GPQ-W交联剂）中培养的ESC衍生球体产生的HIO。PEG-4MAL水凝胶中培养的肠球状体在7天内增大，投影面积增加2倍()Feret直径增加1.4倍()与封装当天（第0天；). 在PEG-4MAL水凝胶和Matrigel™中培养的球体在球体面积、直径或生长速度方面没有差异(). 与我们对已建立的HIO的观察结果类似，球状体在膨胀过程中改变了形状，并在水凝胶和细胞外生物迁移到水凝胶的界面处显示出上皮萌芽(补充图2d). 在HIO发育期间，PEG-4MAL水凝胶中培养的球体以与之前描述的Matrigel相似的方式传代13,27包封后21天的免疫染色分析表明，如KI67标记所示，工程PEG-4MAL水凝胶中生成的类有机物正在增殖，顶端EZRIN和基底侧β-CATENIN呈极化分布，ZO-1在顶端连接复合体中表达(). 这些染色模式与Matrigel™中生成的类有机物相同。定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）证实多能性（OCT4）、内胚层（FOXA2）和上皮连接（ZO1、ECAD和CLDN2）的表达水平水凝胶包裹球体中的标记物与Matrigel™中的标记相似，并且在发展为HIO的早期时间点具有相似的行为(补充图4). 最后，为了测试这些合成基质是否适合培养其他人类有机物，我们植入了人类肺部有机物（HLO）28,29工程PEG-4MAL水凝胶(补充图5). 在PEG-4MAL水凝胶中培养的HLO在封装7天后保持高活性(补充图5a)，并通过免疫染色分析证明了组织化肺上皮（ECAD）、管腔形成以及肺上皮（NKX2.1）和气道基底细胞（P63）的特异标记物(补充图5b)28,29综上所述，这些结果表明，这种完全合成的水凝胶支持在不使用Matrigel™的情况下，从肠球状阶段生成ESC-和iPSC-衍生的HIO，并有可能适应不同人类有机物的生成。
水凝胶生成的HIO在体内分化接下来，我们研究了水凝胶生长HIO分化为成熟肠组织的潜力体内如前所述24,30将嵌入工程PEG-4MAL水凝胶或Matrigel™中并生长3周的.mCherry-expressing球体从其各自基质中回收，并植入免疫受损NSG小鼠的肾包膜下(). 此外，将在Matrigel™中生长2周，然后在PEG-4MAL水凝胶中转移和培养1周（维持水凝胶）的HIO植入肾包膜下(). 12周后，植入的肾脏含有表达mCherry的HIO，其面积是植入时的10到40倍()，与之前的报告一致。解剖的PEG-4MAL生成的HIO显示出分化的肠上皮，类似于成熟的人类肠道，具有隐窝绒毛结构和下面的固有层、粘膜肌层和粘膜下层24具有结构胶原纤维（三色）和分化杯状细胞（阿尔西安蓝），与Matrigel™生成的和水凝胶维护的类有机物相当(). β-CATENIN、EZRIN、ZO-1和ECAD的免疫染色证实了PEG-4MAL水凝胶产生的HIOs的极化上皮分化(). 此外，PEG-4MAL生成的器官样上皮在肠干细胞所在的隐窝底部显示局部细胞增殖（KI67），并表达肠上皮蛋白CDX2、肠内分泌细胞（CHGA）、杯状细胞（MUC2）和簇状细胞（DCLK1）的特征标记31此外，PEG-4MAL生成的HIO表达PDX1，表明十二指肠区域性一致()13表达与Matrigel™生成的类有机物和水凝胶维护类有机物相当(). 这些结果表明，工程合成基质中产生的HIO可以分化为成熟的肠组织体内与Matrigel™中生成的HIO相同的环境。这些发现确立了工程合成PEG-4MAL水凝胶作为Matrigel™的强劲替代品，对转化医学具有重要意义。
PEG-4MAL生成的HIO形成成熟的肠道组织结构体内（a） 含有在PEG-4MAL水凝胶Matrigel™中生成或在Matrigel™中生成并保存在PEG-4 MAL（水凝胶维护）中的HIO的解剖肾脏的显微照片。（b） 采集的有机物的透射光和荧光显微镜（mCherry）图像。Bar，0.5 cm。（c，d）H&E染色显示成熟的人类肠隐窝绒毛结构，Alcian蓝和三色染色显示存在分化的杯状细胞和有组织的胶原纤维。棒材，100μm。每个实验组使用3只小鼠进行一项实验。
PEG-4MAL生成的HIO分化为成熟肠组织体内（a，b）HIO在（a）PEG-4MAL水凝胶，（b）Matrigel™内生成，或在Matrigel™内生成并维持在PEG-4MAC内（水凝胶-维护），并标记有β-CATENIN、增殖细胞（KI67）、上皮顶端极性（EZRIN）和连接（ZO-1和ECAD）、肠上皮蛋白CDX2的荧光显微镜图像，肠内分泌细胞（CHGA）、杯状细胞（MUC2）、簇状细胞（DCLK1）和小肠标记物（十二指肠；PDX1）。DAPI，复染色。“L”表示HIO流明。白色箭头显示肠内分泌细胞或簇状细胞。棒材，50μm。每个实验组使用3只小鼠进行一项实验。
PEG-4MAL水凝胶系统的一个关键优点是控制凝胶时间，以便水凝胶成分可以作为凝胶溶液注入就地17因此，我们探索了利用小鼠结肠镜将工程水凝胶作为HIO的运载工具导入小鼠肠粘膜伤口。PEG-4MAL水凝胶或Matrigel™中产生的HIO从其基质中回收，与水凝胶前体溶液混合，并注射在免疫低下小鼠远端结肠机械诱导粘膜伤口的部位(,补充图6a)32使用结肠镜评估伤口闭合情况，荧光成像显示注射后5天伤口部位mCherry阳性组织的局部表达(). 注射后4周的免疫染色表明，HIO通过合成水凝胶输送导致HIO植入宿主肠上皮组织，如人类细胞核（NUMA）阳性染色所示，以检测PEG-4MAL水凝胶或Matrigel™中产生的HIO(). 重要的是，对于非注射控制，只有水凝胶和注射在盐水中的HIO没有明显的染色()证明HIO植入和伤口修复需要水凝胶输送载体。对伤口边缘HIO植入物的检查表明，宿主组织附近的人类细胞染色，人类标志物染色呈阴性。人类线粒体（HUMIT；补充图6b). 此外，用水凝胶输送的HIO治疗的结肠伤口显示阳性染色OLFM4型位于类隐窝结构域基底的人类细胞特异性探针(;补充图6c)，与正常成人结肠染色一致(补充图6c)这也与之前关于人类OLFM4蛋白和/或mRNA定位的报道一致33-35此外，一些阴性染色的人类隐窝样结构域与小鼠肠道隐窝相邻，这些隐窝对小鼠特异性染色呈阳性Lgr5级探针(补充图6d)通过就地杂交36将这些观察结果与未遭受结肠损伤或接受HIO注射的免疫缺陷小鼠的对照组织切片进行比较(;补充图6d).
我们还研究了HIO是否促进结肠粘膜伤口修复(). 令人惊讶的是，与未经治疗的伤口和仅使用水凝胶或不使用水凝胶载体的HIO治疗的伤口相比，使用水凝胶运载体将HIO输送到结肠伤口显著增加了伤口闭合(). 合成水凝胶和Matrigel™中产生的HIO在伤口闭合方面没有差异。综上所述，这些结果表明，工程PEG-4MAL水凝胶可作为一种注射递送载体，支持HIO在结肠粘膜伤口的局部植入，并增强伤口闭合。这些发现确立了合成水凝胶作为体内hPSC衍生HIO的运载工具，并证明HIO可用于治疗肠道损伤或疾病。
在这项研究中，我们设计了一种完全合成的水凝胶在体外无需Matrigel™封装，即可从hPSC衍生球体中生成肠道类有机物。合成ECM的机械和生化特性对肠道类有机物的形成都很重要，我们确定了一种最佳配方，可以支持肠道球体存活、扩张和上皮分化为HIO并分化为成熟肠道组织体内达到与Matrigel™类似的水平。此外，我们还表明，这种合成基质支持开发其他人类有机物，如HLO。合成基质中特定机械和细胞粘附性能的要求与之前的工作一致，表明上皮细胞囊肿生长、极化、，管腔的形成仅限于ECM弹性的窄范围内，在3D培养的上皮细胞形态发生过程中，粘附肽类型调节根尖极性和管腔形成18有趣的是，本研究中支持hPSC衍生类有机物的机械特性和蛋白酶降解特性与最近鉴定的小鼠不同发光二极管组5+肠道干细胞生长与类器官形成15这涉及到更复杂的机械动力学特性，并表明这两种有机物来源之间的差异。这种完全合成的矩阵解决了Matrigel™与乐透成分和结构变异性相关的主要局限性，以及严重限制扩大应用和临床翻译的肿瘤衍生性。
我们还利用小鼠结肠镜确定了工程水凝胶作为HIO给小鼠肠粘膜伤口的运载工具的用途。尽管其他研究主要集中在将小鼠肠道类有机物作为悬浮液输送到结肠腔中7我们发现，缺乏运载工具会减少HIO在植入部位的植入。将水凝胶液体前体和HIO注射到粘膜伤口导致就地支持局部类器官植入和增强伤口修复的聚合水凝胶。因此，该递送策略为开发基于HIO的治疗方法奠定了基础，以治疗涉及肠上皮损伤（例如IBD）的人类胃肠道疾病。此外，该水凝胶平台的模块化特性允许适应在体外生成和体内输送其他人类PSC衍生的有机物（例如肺）用于再生医学。
方法
免疫荧光分析
对于结肠、HIO、植入HIO或HLO的肾胶囊冰冻切片的免疫荧光标记，在室温下用3.7%（w/v）多聚甲醛固定15分钟，然后用0.5%（w/v）Triton X-100固定5分钟。除非另有说明，否则在1:100稀释度下进行一级抗体孵育过夜。以1:2000的稀释度进行二次抗体孵育1小时。报告摘要中提供了所用抗体的详细信息，包括其来源（公司名称、目录号）和稀释液。
hPSCs分化为肠道球体或HLO
密歇根大学人类多能干细胞监督委员会（HPSCRO）批准了所有使用人类多能干细胞的工作。定期监测干细胞系的染色体核型、多能性（使用一组抗体和RT-qPCR标记）以及进行多系分化的能力。对于肠球体的生成，无支原体人类ES细胞（H9，NIH注册号0062）和iPS细胞（第20.1行，来源如上所述13)在Matrigel™涂层板上培养并分化为肠组织，如前所述13。在中肠/后肠诱导的第4天和第5天，采集培养物中存在的漂浮球体，用于后续实验。在一些实验中，使用了表达组成活性H2BmCherry荧光报告子的hESCs。该株系通过感染含有PGK-H2BmCherry的慢病毒而产生，该慢病毒是Mark Mercola（Addgene质粒#21217）馈赠的37对于HLO生成，如前所述，人类ES细胞（UM63-1，NIH注册号0277）被维持、分化并扩展为HLO29.
水凝胶形成和在体外肠球体/HIO
为了制备PEG水凝胶，将PEG-4MAL大分子单体（MW 22000或44000；Laysan Bio）溶解在4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）缓冲液（20 mM，DPBS，pH 7.4）中。AAPPTec定制合成了粘合剂和GPQ-W交联肽。粘附肽RGD（GRGDSPC）、AG73（CGGRKRLQVQLSIRT）、GFOGER（GYGGG P（GPP）5GFOGER（GPP）5将GPC）、IKVAV（CGGAASIKVAVSADR）和RDG（GRDGSPC）以10.0 mM（5倍最终配体密度）溶解在HEPES中，并以2:1 PEG-4MAL/配体比率与PEG-4MAC混合以生成功能化PEG-4MA前体。双半胱氨酸交联肽GPQ-W（GCRDGPQG↓IWGQDRCG；↓ 表示酶切位点）或不可降解交联剂DTT（1,4-二硫苏糖醇；3483-12-3，Sigma）在计算马来酰亚胺基团与粘附肽反应后，以对应于1:1马来酰胺/半胱氨酸比率的密度溶解在HEPES中。对于HIO封装，球体嵌入Matrigel™中并在其中膨胀30天。产生的HIO从Matrigel™中移出，并在肠生长培养基中以5倍最终密度（最终密度：2-4 HIOs/水凝胶）再次悬浮38并保持在冰上。对于人肠球状物包囊，在分化后立即收集球状物，以5倍最终密度（最终密度：20-30个球状物/水凝胶）将其重新悬浮在肠生长培养基中，并保存在冰上。对于HLOs封装，将其从Matrigel™中取出，并以5倍最终密度（最终密度：2-4个HLOs/水凝胶）重悬在前肠生长培养基中27,28并保持在冰上。为了形成水凝胶，在添加肠生长培养基之前，将粘附肽功能化的PEG-4MAL大分子单体、细胞和交联肽聚合20分钟。如前所述，生成并培养Matrigel™生成的hPSC衍生HIO13,38如前所述，PEG-4MAL水凝胶中培养的HIO的传递与Matrigel™中嵌入的组织相似27,38简单地说，将HIO从PEG-4MAL水凝胶中取出，转移到无菌培养皿中，然后用手术刀手动切成两半。将一半HIO以5倍最终密度（最终密度：2-4 HIOs/水凝胶）重新悬浮在肠生长培养基中38并与水凝胶前体溶液混合形成PEG-4MAL水凝胶。在3周的过程中，HIO被传代多达3次。Matrigel™生成的HIO如前所述进行传递13,38样本量确定为每种条件下至少4个水凝胶，前提是在特定条件下4个不同水凝胶中的结果将揭示该给定条件下的群体行为。
生成水凝胶和嵌入HIO的详细协议可在协议交换处找到：DOI:10.1038/protex.2017.098
水凝胶特性
水凝胶的储存和损失模量通过在MCR 302应力控制流变仪（Anton Paar）上进行的动态振荡应变和频率扫描进行评估，该流变仪具有9 mm直径、2°锥体和平板几何形状。振荡频率扫描用于检查存储和损耗模量（ω=0.5–100 rad s-1)应变为2.3%。
活性测定和量化
PEG-4MAL凝胶在2μM钙蛋白-AM（活性；生命科技）和1μM TOTO-3碘化物（死亡；生命科技。通过使用ImageJ（美国国家卫生研究所）计算活或死染色呈阳性的球体/类器官总投影面积的百分比来量化存活率。结果代表了每个实验组使用6个PEG-4MAL/Matrigel™凝胶样品进行的三个独立实验。
抑制机械传导介质
分别使用维替泊芬（SML0534，Sigma）、布利司他丁（203389，Calbiochem）和Y-27632（688002，Calbiochem），在水凝胶中球形包裹20分钟后向肠生长培养基中添加10或30μM，以抑制YAP、肌球蛋白II或Rho-相关激酶。使用Annexin V/Dead Cell apoptosis Kit（A13201，ThermoFisher）在封装后1天评估细胞凋亡/死亡。使用Axiovert 35蔡司显微镜对样品进行成像。结果代表了每个实验组使用12个PEG-4MAL水凝胶样品进行的一项实验。
RT-qPCR
使用MagMax RNA分离系统和MagMax-96总RNA分离试剂盒（AM1830，ThermoFisher Scientific）提取PEG-4MAL水凝胶或Matrigel™中生长的hESC第0天球体或HIO的总RNA。cDNA使用SuperScript VILO cDNA合成试剂盒（11754-250，ThermoFisher Scientific）合成。使用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒（204145，Qiagen）进行RT-qPCR。使用公式[2ˆ（管家基因Ct–感兴趣基因Ct）]×10000，将相对基因表达绘制为任意单位。RT-qPCR引物序列见补充表2.
动物模型
所有动物研究均按照密歇根大学动物护理和使用委员会（IACUC）根据美国农业部（USDA）动植物健康检查服务（APHIS）法规和美国国家卫生研究院（NIH）制定的批准方案进行实验动物福利办公室（OLAW）关于脊椎动物使用的规定。所有实验均使用雄性（8周龄）NOD-scid IL2Rg-null（NSG）小鼠（杰克逊实验室）。
肾包膜植入术
如前所述，将有机物植入雄性NOD-scid IL2Rg-null（NSG）小鼠的肾包膜下（Jackson实验室）（Watson等人，2014年和Finkbeiner等人，2015年）24简单地说，用2%的异氟烷麻醉小鼠。左翼被剃光，并用洗必泰和异丙醇消毒。左侧切口暴露肾脏。使用镊子将HIO手动放置在肾脏的包膜下口袋中。在两层封闭之前，腹腔内冲洗Zosyn（100 mg/kg；辉瑞）。12周后处死小鼠并取回移植体。该结果代表了每种情况下用3只小鼠进行的一项实验（每个肾囊植入一个有机物）。样本量确定为3，前提是3种不同动物在特定条件下的结果将揭示该给定条件下的种群行为。没有使用统计方法预先确定样本量。
结肠粘膜损伤和HIO注射
通过腹膜内注射氯胺酮（100mg/kg）/甲苯噻嗪（10mg/kg）溶液来麻醉NSG小鼠。使用配有活检钳的高分辨率微型结肠镜系统（Coloview Veterinary Endoscope，Karl Stortz）对背动脉沿线3-5个部位的结肠粘膜进行生物检测。伤口平均大小约为1 mm2在受伤后第1天，借助一个定制的装置进行HIO注射，该装置包括一个连接到小管子的27号针头（外径：0.41 mm）(补充图6a). 在平板彩色监视器上通过高分辨率（1024×768像素）实时视频观看内镜手术。根据我们之前使用该模型的经验，每个条件下用4只小鼠进行了两次独立实验（每只小鼠五次结肠伤口/注射），结果具有代表性。
伤口闭合量化
通过腹腔注射氯胺酮（10 g/L）木聚嗪（8 g/L）溶液（10μL/g体重）对小鼠进行麻醉。为了在小鼠结肠中造成粘膜损伤并监测其再生，使用了高分辨率结肠镜系统。在第1天和第5天对每个伤口区域进行数字拍摄，并使用ImageJ（美国国家卫生研究所）计算伤口面积。在每个实验中，每只小鼠检查3-4个病灶。
现场杂交（ISH）
鼠用ISHLgr5级在用4%多聚甲醛（PFA）固定的冰冻切片上进行表达。用蛋白酶K（3115887001，Sigma-Aldrich）在37°C下使载玻片渗透30 min，用柠檬酸盐缓冲液洗涤，然后在室温下乙酰化10 min。在37°C的加湿室中预混合步骤执行1 h。将稀释在杂交缓冲液中的DIG标记的核糖探针在68°C下培养过夜。然后在室温下清洗玻片并封闭1小时，然后在4°C下与DIG抗体（11093274910，Sigma-Aldrich）孵育过夜。将显影液（11681451001，Roche）培养72小时，直到Lgr5级+细胞变得明显。ISH用于OLFM4型按照制造商的说明，使用RNAscope 2.5 HD手动分析进行棕色显色检测（Advanced Cell Diagnostics，Inc.）。人类20碱基对OLFM4型探针由Advanced Cell Diagnostics针对1111-2222中的20个碱基对生成OLFM4型（基因登录｛“类型”：“entrez核苷酸”，“属性”：｛“文本”：“NM_006418.4”，“term_id”：“325053703”，“term_text”：“NM_006418.4”｝NM_006418.4号)并且可以在市场上买到。该结果代表了每种情况下用4只小鼠进行的两项独立实验（每只小鼠五次结肠伤口/注射）。
统计学和再现性
所有实验均在类似条件下独立进行三次或更多次和补充图6，执行了两次。图如所示,,、和补充图1c、d、3和4是为了进行一项实验。中显示的图像和、和补充图5执行了一次。中显示的图像,,,,、和补充图5b和6b-d，代表每个实验组每个独立实验中每个特定标记的至少20个染色和成像组织切片。中显示的图像,,、和补充图2、3和5a，代表每个独立实验中每个实验组为每个水凝胶拍摄的至少3张图像。中显示的图像、和，是代表每只小鼠在每个独立实验中为所有器官样体/解剖肾脏或每个单独伤口/注射所拍摄的图像。所有统计分析均使用GraphPad Prism 6.0进行。采用Tukey多重比较检验，通过单因素方差分析（ANOVA）计算统计显著性(,、和)，双向重复测量方差分析()，和Welch校正的不成对t检验(补充图3b、c和4)如图图例所示。统计显著性的P值表示为****P（P）< 0.0001, ***P（P）< 0.001, **P（P）< 0.01, *P（P）< 0.05.
