糖尿病。作者手稿；于2017年10月28日在PMC上市。
以最终编辑形式发布为：
预防性维修识别码：项目经理5660634
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院907883
在糖尿病小鼠模型中，感光细胞产生炎症产物，促进视网膜血管通透性
,1 ,2 ,1和
1,2,三 Deoye Tonade公司
1药理学系，W309 Wood Building，凯斯西储大学，10900 Euclid Ave，Cleveland，OH 44106，美国
刘海涛老师
2美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学系
克日什托夫·帕尔琴夫斯基
1美国俄亥俄州克利夫兰市欧几里德大道10900号凯斯西储大学W309木楼药理学系
蒂莫西·科恩
1美国俄亥俄州克利夫兰市欧几里德大道10900号凯斯西储大学W309木楼药理学系
2美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学系
三美国俄亥俄州克利夫兰退伍军人管理医疗中心研究服务
1美国俄亥俄州克利夫兰市欧几里德大道10900号凯斯西储大学W309木楼药理学系
2美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学系
三美国俄亥俄州克利夫兰退伍军人管理医疗中心研究服务
通讯作者。 - 补充资料
补充的。
GUID:AC08E09C-90FB-4F3F-AA2E-3178683B0683
摘要
目标/假设
最近的研究表明，感光细胞产生的介质或产物有助于糖尿病视网膜毛细血管损伤。这项研究的目的是确定光感受器细胞是否释放可溶性因子，这些可溶性因子有助于糖尿病患者视网膜血管的通透性。
方法
为了评估视网膜血管渗漏，用链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型（高血糖8个月）和年龄匹配的对照小鼠注射FITC-BSA。用荧光显微镜检测FITC-BSA从视网膜血管系统向神经视网膜的渗漏。进行了体内外实验，以确定感光细胞是否释放了直接增加视网膜内皮细胞通透性或细胞死亡的产物。通过定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）评估光感受器释放的产物对紧密连接蛋白和细胞粘附蛋白的影响。使用蛋白质阵列测量光感受器释放到介质中的炎症产物。
结果
8个月的糖尿病持续时间增加了野生型小鼠的视网膜血管通透性，但在感光细胞更早退化的视蛋白缺乏型糖尿病小鼠中，这种缺陷被抑制。来自糖尿病野生型小鼠的光受体细胞释放炎症产物（如IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、趋化因子C-X-C基序配体1[CXCL1]、单核细胞趋化蛋白1[MCP-1]、CXCL12a、I-309、趋化因子配体25[CL25]和TNF-α），这些产物直接导致视网膜内皮细胞通透性增加，至少部分是通过claudin（紧密连接）mRNA的改变。糖尿病小鼠或糖尿病样条件下感光细胞释放的产物在体外并没有直接杀死视网膜内皮细胞。
结论/解释
在糖尿病小鼠模型中，感光细胞可以产生炎症产物，促进视网膜血管通透性。
关键词：糖尿病，糖尿病视网膜病变，内皮细胞，炎症产物，渗透性，感光细胞，视网膜
介绍
糖尿病视网膜病变是24-64岁人群视力受损和失明的主要原因，它影响60%以上患有糖尿病≥10年的人[1,2]。许多糖尿病视网膜病变发病机制的研究都集中于血管异常，因为糖尿病引起的视网膜血管系统异常（即通透性增加和变性）直接与视力丧失和损害有关。然而，神经视网膜（包括感光细胞）的改变也被检测到，最近的研究表明感光细胞中的分子异常可导致视网膜血管损伤和糖尿病视网膜病变的早期特征[三–6]。
感光细胞不仅调节糖尿病视网膜中炎症蛋白的增加[三,6]，但它们本身是炎症蛋白的来源[4,7]。糖尿病视网膜病变中炎性蛋白的增加很重要，因为当炎症前蛋白的产生受到抑制时，糖尿病视网膜病变特征性血管病变的发展受到抑制[8–10]。此外，糖尿病或糖尿病样疾病中的光感受器产生炎症产物，可以刺激附近的细胞，如循环白细胞、视网膜内皮细胞和胶质细胞[4,5]。光感受器细胞已被证明能刺激白细胞介导的糖尿病视网膜内皮细胞的杀伤[4,5,11–13]，可能导致糖尿病引起的视网膜毛细血管变性。迄今为止，光感受器细胞是否参与糖尿病诱导的视网膜血管通透性的研究。
血-视网膜屏障（BRB）的破坏（即视网膜血管通透性）是人类和实验性糖尿病患者糖尿病视网膜病变的特征[14–23]。BRB由促进紧密连接（如克劳丁）和细胞粘附（如血管内皮细胞钙粘蛋白）的内皮蛋白组成，从而调节溶质和其他分子从血液进入神经视网膜的通道，反之亦然[17,24]。研究表明，糖尿病导致内皮紧密连接蛋白水平降低，从而增加视网膜血管通透性[14,18]。在本研究中，我们研究了在糖尿病小鼠模型中，感光细胞有助于视网膜血管通透性，并释放可直接增加视网膜内皮细胞通透性和死亡的炎症产物的可能性。
方法
实验动物
视紫红质敲除(罗−/−)分别从J.Lem（马萨诸塞州波士顿塔夫茨大学）和Jackson实验室（美国ME州巴尔港）获得C57BL/6J背景小鼠和野生型C57BL/6J小鼠。在罗−/−小鼠，形成视紫红质的视杆蛋白被敲除。这个罗−/−小鼠与我们小组和de Gooyer等人之前研究的小鼠来自同一个品系[三–6,25]。这个罗−/−小鼠表现出视网膜色素沉着样表型，视杆细胞数量和功能随年龄而逐渐下降[26]48天龄时视网膜电图反应消失[5,26]。在罗−/−与野生型动物相比，所有视网膜区域（除了外核层[ONL]）的厚度没有变化（参见电子辅助材料【ESM】).
糖尿病小鼠视网膜血管通透性受到抑制，其中感光细胞因视蛋白缺乏而退化。(一)糖尿病野生型小鼠所有视网膜层的FITC-BSA荧光增强。然而，当糖尿病动物的光感受器由于视蛋白缺乏而完全退化时(罗−/−)糖尿病诱导的部分视网膜FITC-BSA荧光增强（OPL和INL）被抑制。相比之下，IPL中FITC-BSA的荧光显著大于正常罗−/−老鼠。白条，非糖尿病动物；黑条，糖尿病动物；灰条，糖尿病罗−/−动物。(b条–克)显示非糖尿病患者的视网膜图像(b条,c（c）)，糖尿病患者(d日,e（电子）)和糖尿病罗−/−(（f）,克)动物。蓝色，细胞核用Hoechst DNA染色；绿色，FITC-BSA。n个=每组使用4-5只动物进行分析。糖尿病持续时间为8个月，小鼠死亡时为10个月大。比例尺：0.14 mm**第页< 0.01
雄性小鼠（2个月大）被随机分为“糖尿病”组或“非糖尿病对照”组。糖尿病组小鼠每天连续五次腹腔注射新鲜制备的链脲佐菌素柠檬酸缓冲液（pH 4.5）溶液，剂量为60 mg/kg体重。链脲佐菌素给药后第二周内，高血糖至少被证实三次。连续三次测量血糖>15.26 mmol/l的小鼠被归类为糖尿病。在不预防高血糖和糖尿的情况下，根据需要给予胰岛素以防止体重减轻（每周0-3次，每次0-0.2单位NPH胰岛素皮下注射）。每周测量食物消耗量（7004饮食；美国印第安纳州印第安纳波利斯Harlan Teklad）和体重。动物治疗符合视觉和眼科研究协会关于研究中动物治疗的决议，以及凯斯西储大学机构动物护理和使用委员会。在糖尿病2个月和8个月大时（分别为4个月和10个月大），对动物实施安乐死，并摘除眼睛。
白蛋白渗入神经视网膜
血白蛋白蛋白在神经视网膜中的积累被视为血管通透性增加的标志[14,19,20]。糖尿病8个月时，将无菌FITC-BSA（50μg/μl）磷酸盐缓冲盐水（0.138 mol/l NaCl，0.0027 mol/l KCl[pH7.4]）以100μg/g的速度注射到小鼠的尾静脉中。20分钟后，对小鼠实施安乐死，用肝素化管从心脏采集血液，收集眼睛，将其固定在冰镇4%多聚甲醛中，用蔗糖冷冻保存，然后在干冰上用异戊烷的最佳切割温度（OCT）复合物冷冻。心脏血液在18000年被离心分离克持续20分钟，使用2030 Multilabel Reader VICTORTM X3（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市珀金埃尔默）测量血浆中的FITC荧光。切割视网膜冰冻切片（每只动物三个切片，厚度为11μm），在20倍物镜下成像，并通过荧光显微镜进行分析。使用NIS-Elements AR Analysis 3.2 64位软件分析每个视网膜切片中的FITC荧光(www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Advanced-Research). 在所有视网膜图像中，光强度和曝光时间保持相等。如前所述，通过计算机辅助显微镜测量外丛状层（OPL）、内核层（INL）和内网状层（IPL）中的FITC-BSA来评估白蛋白向神经视网膜的渗漏[19,20]。为了有效测量FITC-BSA渗入神经视网膜的量，从分析中选择并排除了血管荧光。从神经视网膜的FITC荧光中减去背景荧光（即视网膜外部的荧光）。糖尿病患者的血管通透性表示为神经视网膜中FITC荧光强度除以血浆中的荧光强度的比值，这与非糖尿病动物的荧光强度是一致的。
小鼠视网膜感光细胞的振动分离
我们使用一个震动器（徕卡VT1000 S）将新鲜的未固定视网膜分为外视网膜（感光层）和内视网膜，如前所述[4,27]。2个月糖尿病野生型小鼠的视网膜被一分为二，因为在2个月的糖尿病小鼠中，感光细胞的分子异常（例如炎症蛋白增加和氧化应激）增加[三,4]。造血谱系的细胞（例如小胶质细胞和白细胞）不太可能出现在切片的感光片中（在糖尿病的这个年龄和持续时间），因为如前所述，CD45+糖尿病患者外视网膜中不存在细胞，但内视网膜中存在细胞[4]。此外，我们报道了大约79%的感光层（即内、外节段和ONL）是使用振动体方法从视网膜上切片的[4]。因此，隔离的感光层不太可能被主要存在于视网膜内部的细胞污染。将糖尿病小鼠分离的光感受器细胞片在DMEM中30 mmol/l的葡萄糖中培养2个月，将年龄匹配的非糖尿病小鼠的光感受器片在DMTEM中5 mmol/l的葡萄糖内培养14–16小时，以接近其体内暴露的葡萄糖环境。从糖尿病和非糖尿病小鼠视网膜中分离出相对等量的光感受器片，因为先前的证据表明糖尿病患者的光感受器变性没有统计学上的显著变化[5]（环境与社会管理）). 为了测试内皮细胞的通透性，从感光片中采集条件培养液，与0.02 g FITC-白蛋白混合，并将未稀释的培养液转移到生长在transwell板（6.5 mm插入物，0.4μm聚碳酸酯膜；科宁Costar，Kennebunk，ME，USA）24小时后，通过汇合内皮细胞进入下腔的FITC荧光用PerkinElmer 2030多标签荧光阅读器定量。然后从这些视网膜内皮细胞中分离RNA进行定量逆转录PCR（qRT-PCR）分析。
细胞死亡
我们使用两种不同的细胞死亡测量方法，即乳酸脱氢酶释放（美国伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯生物技术公司的检测试剂盒）和台盼蓝排除试验，对新分离的感光细胞在培养基中孵育45分钟（与15小时相比）的细胞死亡进行了检测。
RNA分离和qRT-PCR
从细胞中分离出总RNA（RNeasy试剂盒，美国马里兰州齐根市）。在最终反应体积为20μl的条件下合成cDNA（iScript，cDNA合成试剂盒，Bio-Rad，美国）。使用SYBR green（美国印第安纳州印第安纳波利斯罗氏诊断公司）和qPCR系统（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯Bio-Rad的CFX Connect实时PCR检测系统）进行实时PCR。以下引物序列用于18S正向（5′-ACTCAACAGGAAACCTCACC-3′）和反向（5′-CCAGACAAATCCCAAC-3′。18S被用作归一化的参考。cDNA样本重复运行。通过琼脂糖凝胶电泳和熔融温度确认PCR产物。2ΔΔCq=基因表达的倍数变化。
细胞培养
以下细胞系在含有5 mmol/l葡萄糖和10%胎牛血清的DMEM中生长：661W感光细胞样细胞（我们小组之前通过锥视蛋白mRNA的阳性鉴定确认了661W的身份[20])和小鼠视网膜内皮细胞（内皮细胞的身份之前由我们通过PECAM1基因的阳性鉴定确认[4]). 视网膜内皮细胞由N.Sheibani（威斯康星大学，威斯康星州麦迪逊分校，美国）善意提供，最初从不朽小鼠中分离得到[28]。将661W细胞（200000个细胞）培养在5 mmol/l葡萄糖（正常葡萄糖）和30 mmol/l葡萄糖（高糖）的12孔板中，培养40~48h。从661W感光细胞中提取条件培养基，并将其未稀释添加到12孔板的200000个鼠视网膜内皮细胞中，培养24h。为了获得细胞活性，采集内皮细胞并测定台盼蓝排斥反应。细胞存活率计算公式为：（存活）/（存活+死亡）×100%。
蛋白质阵列
从2个月大的糖尿病小鼠中分离出的感光细胞片（由如上所述的振动体分离产生）在DMEM中的30 mmol/l葡萄糖中孵育，从年龄匹配的非糖尿病小鼠中提取的感光片在DMEM5 mmol/l葡萄糖中孵化14–16 h。收集条件培养基，并使用Ray Biotech小鼠炎症阵列C1试剂盒（美国佐治亚州诺克罗斯）按照制造商的说明进行炎症蛋白阵列分析。
酶联免疫吸附试验
用小鼠ELISA试剂盒（Biolegend，加州圣地亚哥，美国）分别在糖尿病小鼠2个月和年龄匹配的非糖尿病小鼠的条件培养基中测量感光片释放的TNF-α和IL-1β的蛋白浓度。根据光感受器片释放TNF-α和IL-1β的结果，向经孔植入物中的视网膜内皮细胞中添加相同浓度的TNF-β和IL-1？小鼠重组蛋白（Biolegend）24小时，并如上所述估算通透性。
统计分析
由于动物数量较少，因此使用Mann–Whitney（非参数检验）分析数据。为了方便读者，数据以平均值±SEM的形式提供第页<0.05。
结果
在10个月大的时候，基本上所有的感光细胞都在罗−/−小鼠（ESM) [5]。持续8个月的糖尿病对野生型或罗−/−动物（ESM) [5]。
光感受器细胞对糖尿病视网膜血管通透性的影响
在糖尿病8个月时，在野生型对照动物和罗−/−感光细胞退化的动物。糖尿病导致野生型小鼠视网膜OPL、INL和IPL的通透性显著增加，具有统计学意义(). 糖尿病患者罗−/−动物（其中光感受器细胞由于视蛋白缺乏而退化）受到部分保护，免受这种缺陷的影响。在罗−/−动物，糖尿病不会改变OPL或INL的通透性()尽管IPL内视网膜血管的通透性仍在增加。因为感光细胞已经完全退化罗−/−老鼠()这一结果与光感受器细胞有助于糖尿病患者视网膜血管通透性的假设一致（至少在OPL和INL中）。
为了帮助确定光感受器对糖尿病血管通透性的影响，我们还进行了体外和体外研究。
糖尿病患者感光细胞释放的可溶性产物可直接导致视网膜内皮细胞通透性增加
我们测试了糖尿病小鼠的光感受器是否能释放可溶性产物，从而在体外直接增加视网膜内皮细胞的通透性。新分离的感光细胞片的条件培养基（通过振动体隔离产生[4,27])将来自非糖尿病和糖尿病小鼠的细胞与FITC-白蛋白混合，并将其添加到transwell板上腔的小鼠视网膜内皮细胞中24小时。与使用非糖尿病小鼠感光器条件培养基培养的内皮细胞相比，使用糖尿病小鼠感光器条件培养液培养的视网膜内皮细胞显示FITC-白蛋白的通透性在统计学上显著增加(). 这种通透性的增加并不是由于葡萄糖浓度升高对内皮细胞的直接影响，因为与在正常葡萄糖中孵育的内皮细胞相比，单独在高糖中孵育的内皮细胞（之前没有暴露于光感受器）的通透性没有显示出可检测的变化(). 在体外培养期间，我们发现感光细胞（ESM）很少或没有死亡)，但我们承认体外培养释放的产物可能有助于检测到的内皮细胞通透性增加。
糖尿病小鼠分离的感光片释放的产物可以直接增加视网膜内皮细胞的通透性。(一)与年龄匹配的非糖尿病小鼠的视网膜感光器条件培养基培养的内皮细胞相比，用糖尿病小鼠感光片条件培养基孵育的视网膜内皮细胞2个月后，FITC-白蛋白的通透性增加。与用5mmol/l葡萄糖培养的内皮细胞相比，仅用30mmol/l的葡萄糖培养的视网膜内皮细胞没有表现出内皮细胞通透性增加。用糖尿病小鼠感光细胞的条件培养基培养的视网膜内皮细胞显示减少(b条)克劳丁和(c（c）)VE钙粘蛋白mRNA水平与非糖尿病小鼠光感受器条件培养液培养的内皮细胞的比较。仅在30 mmol/l葡萄糖中培养的视网膜内皮细胞显示(b条)克劳丁mRNA水平无变化，但(c（c）)与在5 mmol/l葡萄糖中培养的内皮细胞相比，VE钙粘蛋白mRNA减少。CM，条件培养基；D、 糖尿病；N、 非糖尿病；PR，光感受器；–，不存在。n个每组5只动物用于分析。糖尿病持续时间为2个月，小鼠死亡时为4个月大*第页< 0.05
采集transwell平板中视网膜内皮细胞的mRNA，进行qRT-PCR以评估调节内皮细胞通透性的基因的潜在变化。与使用非糖尿病小鼠感光器条件培养基培养的内皮细胞相比，使用糖尿病小鼠感光器条件培养液培养的视网膜内皮细胞的claudin和VE-cadherin基因表达减少约50%(). 当视网膜内皮细胞与高糖单独孵育时，克劳丁基因表达没有变化，而VE钙粘蛋白基因表达下降().
这些结果表明，糖尿病动物的光感受器细胞释放的产物直接增加视网膜内皮细胞的通透性。由于内皮细胞活性可能影响FITC-白蛋白在内皮细胞之间的传递，我们测试了感光细胞释放的产物是否导致内皮细胞死亡。
糖尿病或糖尿病样疾病中感光细胞释放的产物不会直接杀死视网膜内皮细胞
将来自糖尿病和非糖尿病小鼠感光细胞的条件培养基与视网膜内皮细胞孵育24 h，然后用台盼蓝排斥试验评估内皮细胞的活性。与在非糖尿病小鼠或正常葡萄糖的感光细胞条件培养基中培养的内皮细胞相比，用糖尿病小鼠感光细胞或高糖的条件培养基培养的视网膜内皮细胞的细胞活力没有变化().
产品发布自(一)隔离感光片或(b条)糖尿病或糖尿病样条件下的661W细胞（感光细胞样细胞）在24小时培养期间不会直接杀死视网膜内皮细胞。用条件培养基培养视网膜内皮细胞(一)从糖尿病小鼠或(b条)在30 mmol/l葡萄糖中培养的661W光感受器样细胞未导致内皮细胞活性的改变。(一,b条)与在5mmol/l CM条件培养基中孵育的内皮细胞相比，在30mmol/l葡萄糖中孵育的视网膜内皮细胞的细胞活力也没有变化；D、 糖尿病；N、 非糖尿病；PR，光感受器；+，存在；–，不存在。n个=（a）和n个=4–5次重复(b条). 糖尿病持续时间为2个月，小鼠死亡时为4个月大
从661W（类光感受器）细胞收集的条件培养基在高糖中孵育，得到了类似的结果。与在正常葡萄糖中用661W细胞的条件培养基培养的内皮细胞相比，在高糖中用661 W细胞的条件性培养基培养24小时的视网膜内皮细胞没有导致内皮细胞活性的改变().
这些结果表明，至少在测试的24小时内，糖尿病或糖尿病样疾病中感光细胞释放的产物不会直接杀死视网膜内皮细胞。因为在我们的实验中未检测到视网膜内皮细胞活性的变化，我们检测到的感光细胞条件培养基对视网膜内皮细胞通透性的影响()不是由于内皮细胞死亡。
糖尿病患者的感光细胞释放细胞因子和炎症产物
用检测炎症蛋白的蛋白质阵列评估2个月糖尿病小鼠和年龄匹配的非糖尿病小鼠分离的感光片释放的产物。与非糖尿病小鼠的光感受器相比，糖尿病小鼠的光受体释放的IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、趋化因子C-X-C基序配体1（CXCL1）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、CXCL12a、I-309、趋化素配体25（CCL25）和TNF-α蛋白数量增加(). 虽然IL-6和IL-12蛋白水平也有增加的趋势，但增加并不具有统计学意义().
糖尿病患者的感光细胞释放细胞因子和炎症产物。(一)糖尿病小鼠的光受体片释放的IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、CXCL1、MCP-1、CXCL12a、I-309、CCL25和TNF-α明显多于非糖尿病小鼠的光感受器。数据以糖尿病动物的蛋白质含量高于非糖尿病动物的百分比表示。(b条)和(c（c）)显示了从非糖尿病和糖尿病小鼠的光感受器片释放的蛋白质的各自印迹。可从RayBiotech小鼠炎症阵列C1中找到斑点图。N、 非糖尿病患者。n个=3只非糖尿病组动物，以及n个=糖尿病组的4只动物。糖尿病持续时间为2个月，小鼠死亡时为4个月大*第页< 0.05
糖尿病患者感光细胞释放的IL-1β可直接增加视网膜内皮细胞的通透性
我们将重点放在TNF-α和IL-1β上，因为之前有报道称它们直接导致内皮细胞通透性增加[29–33]。我们通过免疫分析量化糖尿病患者感光细胞释放的IL-1β和TNF-α蛋白的浓度，然后测试相同细胞因子的纯（市售）形式是否可以直接增加视网膜内皮细胞的通透性。
采用ELISA检测2个月（4个月龄）糖尿病小鼠或年龄匹配的非糖尿病对照小鼠感光细胞释放的TNF-α和IL-1β的准确浓度。与非糖尿病小鼠相比，糖尿病小鼠分离的光感受器片释放的IL-1β和TNF-α超过正常量().
糖尿病患者感光细胞释放的IL-1β浓度可直接增加视网膜内皮细胞的通透性。ELISA检测小鼠视网膜光感受器释放的蛋白质量(一)IL-1β（糖尿病小鼠为69 pg/ml，非糖尿病小鼠为49 pg/ml）和(b条)TNF-α（糖尿病小鼠29 pg/ml，非糖尿病小鼠9 pg/ml）。与添加相同浓度的非糖尿病小鼠光感受器释放的IL-1β相比，将相同浓度的糖尿病小鼠光感受器片释放的IL-1-β添加到内皮细胞中24小时后，内皮细胞的通透性增加(c（c）). 将糖尿病和非糖尿病小鼠的光感受器释放的相同浓度的TNF-α添加到内皮细胞中并不会增加通透性(c（c）). IL-1β和TNF-α共同加入内皮细胞导致通透性增加(c（c）)但并没有以添加或协同的方式增强内皮细胞的通透性。白条，添加到内皮细胞的细胞因子浓度与非糖尿病动物感光片释放的浓度相同；黑条，与糖尿病动物感光片释放的细胞因子浓度相同。D、 糖尿病；N、 非糖尿病患者。n个=所有组为4。糖尿病持续时间为2个月，小鼠死亡时为4个月大*第页< 0.05, **第页< 0.01
使用非糖尿病和糖尿病小鼠感光片释放的相同浓度的IL-1β和TNF-α，我们在体外测试了这些炎症蛋白（使用IL-1β与TNF-β的小鼠重组蛋白形式）对视网膜内皮细胞通透性的影响。与添加相同浓度的非糖尿病小鼠光感受器释放的IL-1β相比，将相同浓度的糖尿病小鼠光感受器释放IL-1β添加到内皮细胞24小时后，内皮细胞通透性显著增加，具有统计学意义(). 相比之下，与非糖尿病小鼠的光感受器中相同浓度的内皮细胞孵育相比，孵育具有相同浓度的糖尿病小鼠的光感受器释放的TNF-α的内皮细胞不会引起通透性的变化(). 将IL-1β和TNF-α以糖尿病小鼠感光片释放的精确浓度一起添加，导致内皮细胞通透性显著增加，具有统计学意义(). 然而，IL-1β和TNF-α共同添加对内皮细胞通透性没有产生加性或协同效应。24小时孵育期间使用的葡萄糖浓度似乎没有加剧这些细胞因子对内皮细胞通透性的影响().
讨论
多项研究人员证实糖尿病视网膜病变相关的视网膜血管通透性[14–23,34]。在这里，我们提供了光感受器细胞促进糖尿病诱导的视网膜血管通透性增加的证据。在野生型小鼠中持续8个月的糖尿病显著增加了神经视网膜（血管外）多个视网膜层（即OPL、INL和IPL）中荧光标记白蛋白的积累，每个层都由不同的视网膜血管网络灌注，而在其他因视蛋白缺乏而导致感光细胞早期退化的动物中，糖尿病诱导的通透性缺陷被显著抑制。我们和其他人此前曾提供证据表明，啮齿类动物在糖尿病2-3个月时视网膜血管通透性也增加[14,21]。在我们的野生型糖尿病小鼠中，光受体细胞在8个月内没有显示细胞死亡增加[5]但在已知的光感受器变性模型中诱导糖尿病，清楚地表明了光感受者在糖尿病诱导的视网膜血管通透性增加中的重要性。
有趣的是，在缺乏光感受器的动物中，糖尿病诱导的渗透性增加在最靠近光感受者的视网膜层（即OPL和INL）中受到抑制，但在IPL中没有受到抑制。可以考虑在整个视网膜血管系统中产生这种不均匀影响的几个可能原因，但一种可能性是光感受器释放的可溶性因子以扩散限制的方式对视网膜血管系统产生不利影响。如果是真的，人们可能会认为通透性缺陷首先发生在外血管丛，因为据报道，由于视蛋白缺乏引起的光感受器退化会刺激视网膜血管系统的退化[5,6]。然而，我们承认存活的血管系统可能存在于罗−/−小鼠可能不太容易患糖尿病或视网膜光感受器变性后的视网膜重组罗−/−突变体可能诱导抗渗透因子的释放。
以前的证据表明，感光细胞释放的产物可能会在糖尿病和其他病理模型中诱导炎症前蛋白[4,35]因此，我们测试了光感受器是否释放了直接导致视网膜内皮细胞通透性增加的产物。野生型糖尿病动物的光受体释放出的产物直接增强了内皮细胞的通透性，而这种增加并不是通过单独在高糖中培养内皮细胞来复制的。野生型糖尿病小鼠的光受体也释放出降低至少一种调节内皮细胞通透性的蛋白质（克劳丁）水平的产物[17,24]。我们确实承认糖尿病患者的光感受器细胞可能会释放刺激附近细胞（例如循环白细胞、小胶质细胞和视网膜内神经元）的产物来调节内皮细胞的通透性，但这些对其他细胞的影响是否是由感光细胞释放的产物引起的，尚待确定。事实上，我们之前已经报道过体外和体外证据表明，感光细胞可以释放出能够刺激附近细胞的产物[4]。
为了检测糖尿病患者光感受器释放的可能炎症蛋白，我们进行了一个蛋白质阵列。糖尿病小鼠的光受体释放出比正常蛋白质量更多的多种蛋白质，包括IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、CXCL1、MCP-1、CXCL12a、I-309、CCL25和TNF-α。其中一些蛋白以前曾被报道增加内皮通透性或改变紧密连接和细胞粘附蛋白[29–31,36]。因此，我们将相同浓度的糖尿病小鼠感光细胞释放的IL-1β和TNF-α添加到培养的内皮细胞中，以确定它们是否会增加体外内皮通透性。我们的结果表明，IL-1β可能有助于糖尿病患者光感受器介导的内皮通透性增加，但我们发现没有证据表明糖尿病患者光感受器释放的TNF-α量有助于通透性缺陷，至少在急性程度上。重要的是要认识到糖尿病患者的感光细胞也可能释放出许多其他产物或介质（例如脂质、神经递质等），这些产物或介质可能有助于视网膜血管通透性或早期糖尿病视网膜病变的其他特征。
糖尿病患者视网膜血管通透性增加也可能是内皮细胞死亡的结果，众所周知，内皮细胞死亡发生于糖尿病患者[11,37]。我们研究了糖尿病或糖尿病样疾病中感光细胞释放的可溶性产物是否可以直接杀死视网膜内皮细胞，但没有发现直接细胞毒性的证据，至少在24小时的暴露期间。因此，这些数据未能提供证据证明光感受器通过直接导致内皮细胞死亡而影响糖尿病患者的通透性。然而，先前的证据表明，将糖尿病患者或动物的白细胞与视网膜内皮细胞一起孵育可以直接杀死内皮细胞[11–13]光感受器有助于激活白细胞，从而引起内皮细胞的细胞毒性[4,5]。因此，虽然糖尿病患者光感受器释放的可溶性因子似乎不会直接杀死内皮细胞，但光感受者可以通过其他方式影响内皮细胞的死亡().
假设模型：光感受器细胞释放的产物导致糖尿病患者视网膜血管通透性增加和变性
总之，我们提供了体内证据，证明糖尿病患者的光感受器细胞有助于增加视网膜血管通透性，体外证据表明糖尿病动物的光感受器释放可溶性产物和炎症蛋白，直接导致视网膜内皮细胞通透性增加（而非死亡）()部分通过调节视网膜内皮细胞紧密连接蛋白。然而，感光细胞也可能通过激活白细胞间接促进内皮通透性(). Talahalli等人证明，白细胞缺乏5-脂氧合酶的糖尿病嵌合体小鼠并没有出现预期的糖尿病诱导的视网膜血管通透性缺陷增加[22]，但骨髓源性细胞缺乏toll样受体2/4、IL-1β或MyD88的嵌合体小鼠确实发展为糖尿病诱导的视网膜血管通透性缺陷[21]。需要更多的研究来更好地阐明这种差异，并阐明白细胞在糖尿病诱导的视网膜血管通透性中的特殊作用。
糖尿病视网膜病变的研究尤其关注视网膜血管系统，但最近的研究表明，神经视网膜（尤其是感光细胞）也参与其中。这项研究提出了感光细胞启动糖尿病视网膜病变特征性视网膜血管通透性的机制(). 未来，我们将研究经历渗透性的特定血管区域。感光细胞影响附近细胞的能力可能不是唯一的，视网膜内部神经元也可能对通透性产生局部影响。然而，视网膜中感光细胞的大量存在和代谢活动表明，感光细胞在血管生理调节中比其他神经元细胞起主导作用。
致谢
我们感谢凯斯西储大学的C.A.Lee、H.Butler和K.Franke对老鼠的专业维护。小鼠视网膜内皮细胞（来自转化系）由N.Sheibani（美国威斯康星大学，威斯康星州麦迪逊分校）提供。
基金本手稿中报告的研究得到了美国国立卫生研究院国家眼科研究所的资助，获得了R01EY00300、R01EY022938和R24EY021126奖项；以及退伍军人事务部颁发的荣誉奖。
缩写
| 巴西储备银行 | 血视网膜屏障 |
| CCL公司 | 趋化因子配体 |
| CXCL公司 | 趋化因子（C-X-C基序）配体 |
| 印度卢比 | 内核层 |
| IPL公司 | 内网状层 |
| MCP-1型 | 单核细胞趋化蛋白1 |
| ONL公司 | 核外层 |
| OPL公司 | 外丛状层 |
| 定量RT-PCR | 定量逆转录PCR |
| 价值工程 | 血管内皮 |
脚注
电子补充材料本文的在线版本（doi:10.1007/s00125-017-4381-5）包含同行评审但未经编辑的内容补充材料，可供授权用户使用。
数据可用性数据共享不适用于本文，因为在当前研究期间没有生成或分析数据集。
利益的双重性作者声明没有与本文相关的利益冲突。
出资声明DT和HL设计了实验并获得了数据。DT、HL和TSK撰写了手稿。DT、TSK和KP建议、解释和审查了手稿。所有作者都同意出版手稿的最终版本。DT和TSK是这项工作的保证人。
工具书类
1Engelgau MM、Geiss LS、Saaddine JB等，《美国不断演变的糖尿病负担》。Ann医学实习生。2004;140：945–950。[公共医学][谷歌学者] 2Arden GB，Ramsey DJ。糖尿病视网膜病变和基于杆感光细胞生物物理和暗适应的新型治疗。犹他大学健康科学中心1995[公共医学][谷歌学者] 三。Du Y、Veenstra A、Palczewski K、Kern TS。感光细胞是糖尿病诱导的氧化应激和视网膜局部炎症的主要促因。美国国家科学院院刊。2013;110:16586–16591. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Tonade D，Liu H，Kern TS。光受体细胞产生炎症介质，导致糖尿病患者内皮细胞死亡。投资眼科视觉科学。2016;57:4264–4271. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5刘华，唐杰，杜勇，等。视网膜退化和糖尿病小鼠模型中感光细胞对视网膜血管变性的影响。投资眼科视觉科学。2016;57:4272–4281. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6de Gooyer TE、Stevenson KA、Humphries P等。实验性糖尿病期间视网膜外变性小鼠模型的视网膜病变减少。投资眼科视觉科学。2006;47:5561–5568.[公共医学][谷歌学者] 7Scuderi S、D'aico AG、Federico C等。1型STZ诱导糖尿病大鼠模型中IL-1α、IL-1β及其受体的不同视网膜表达模式。《分子神经科学杂志》。2015;56:431–439.[公共医学][谷歌学者] 8Zheng L，Du Y，Miller C，等。诱导型一氧化氮合酶在链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠视网膜毛细血管变性中的关键作用。糖尿病。2007;50:1987–1996.[公共医学][谷歌学者] 9Joussen AM、Poulaki V、Le ML等。炎症在糖尿病视网膜病变发病机制中的中心作用。FASEB J。2004;18:1450–1452.[公共医学][谷歌学者] 10唐杰，科恩·TS。糖尿病视网膜病变的炎症反应。Prog视网膜眼科研究。2011;30：343–358。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Li G，Veenstra AA，Talahalli RR，等。骨髓源性细胞调节小鼠早期糖尿病视网膜病变和触觉超敏的发展。糖尿病。2012;61:3294–3303. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12田平，葛浩，刘浩，等。糖尿病患者白细胞杀死视网膜内皮细胞：小檗碱的作用。摩尔粘度。2013;19:2092–2105. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Veenstra AA，Tang J，Kern TS。CD11b与中性粒细胞抑制因子（NIF）的拮抗作用抑制糖尿病视网膜病变中的血管病变。公共科学图书馆一号。2013;8：e78405。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Antonetti DA、Barber AJ、Khin S等。实验性糖尿病的血管通透性与内皮闭塞素含量降低相关：血管内皮生长因子降低视网膜内皮细胞中的闭塞素。宾夕法尼亚州立大学视网膜研究小组。糖尿病。1998;47:1953–1959.[公共医学][谷歌学者] 15Cunha-Vaz J、Faria de Abreu JR、Campos AJ。糖尿病患者血-肠屏障的早期破坏。英国眼科杂志。1975;59:649–656. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Enea NA、Hollis TM、Kern JA、Gardner TW。组胺H1受体介导实验性糖尿病患者血-视网膜屏障通透性增加。眼科杂志（芝加哥，IL 1960）1989;107:270–274.[公共医学][谷歌学者] 17Frey T，Antonetti DA。糖尿病患者血-视网膜屏障的改变：细胞因子和活性氧物种。抗氧化剂氧化还原信号。2011;15:1271–1284.[公共医学][谷歌学者] 18Barber AJ、Antonetti DA、Kern TS等，《Ins2》秋田小鼠作为糖尿病早期视网膜并发症的模型。眼科视觉科学研究。2005年；46:2210.[公共医学][谷歌学者] 19刘华，唐杰，杜勇，等。维生素A对小鼠早期糖尿病视网膜病变的治疗作用。生物化学杂志。2015;290：21568–21579。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Du Y，Cramer M，Lee CA，等。肾上腺素能和5-羟色胺受体影响糖尿病小鼠视网膜超氧化物生成：与毛细血管变性和通透性的关系。FASEB J。2015;29:2194–2204. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Tang J，Allen Lee C，Du Y等。糖尿病患者白细胞中MyD88依赖性通路影响视网膜。公共科学图书馆一号。2013;8：e68871。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Talahalli R、Zarini S、Tang J等。白细胞通过产生白三烯调节糖尿病小鼠视网膜毛细血管变性。白细胞生物学杂志。2013;93:135–143. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Joussen AM、Poulaki V、Mitsiades N等。非甾体抗炎药通过抑制TNF-a预防早期糖尿病视网膜病变。FASEB J。2002;16:438–440.[公共医学][谷歌学者] 24González-Mariscal L、Betanzos A、Nava P、Jaramillo BE。紧密连接蛋白。生物物理分子生物学进展。2003;81:1–44.[公共医学][谷歌学者] 25de Gooyer TE、Stevenson KA、Humphres P等。Rho-/-小鼠的视杆感光细胞缺失可降低视网膜缺氧和低氧调节基因表达。投资眼科视觉科学。2006;47:5553–5560.[公共医学][谷歌学者] 26Humphries MM、Rancourt D、Farrar GJ等。通过靶向破坏视紫红质基因在小鼠中诱导的视网膜病变。自然遗传学。1997;15：216–219。[公共医学][谷歌学者] 27Clérin E，Yang Y，Forster V，等。振动切片小鼠视网膜以制备感光细胞培养物。J签证费用。2014年：e51954。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Su X，Sorenson CM，Sheibani N.小鼠视网膜内皮细胞的分离和表征。摩尔粘度。2003;9:171–178.[公共医学][谷歌学者] 29Aveleira CA，Lin CM，Abcouwer SF，等。TNF-α通过PKCξ/NF-κB发出信号，改变紧密连接复合体，增加视网膜内皮细胞通透性。糖尿病。2010;59:2872–2882. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Rochfort KD，Collins LE，McLoughlin A，Cummins PM。肿瘤坏死因子-α介导的脑血管内皮屏障完整性破坏在体外包括产生促炎性白细胞介素-6。神经化学杂志。2016;136:564–572.[公共医学][谷歌学者] 31Rochfort KD，Collins LE，McLoughlin A，Cummins PM。细胞活性氧水平的剪切依赖性衰减可以抑制促炎细胞因子对人脑微血管内皮屏障特性的损伤。大脑血流代谢杂志。2015;35:1648–1656. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Puhlmann M、Weinreich DM、Farma JM等。白细胞介素-1β诱导的血管通透性依赖于内皮组织因子（TF）活性的诱导。《运输医学杂志》。2005年；三:37. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33Partridge CA、Jeffrey JJ、Malik AB。TNF-α诱导的96-kDa明胶酶有助于增加微血管内皮通透性。美国物理学杂志。1993;265：L438–L447。[公共医学][谷歌学者] 34Vinores SA、Derevjanik NL、Mahlow J等。糖尿病兔血-视网膜屏障破裂机制的电子显微镜证据：与磁共振成像的比较。病理学研究实践。1998;194:497–505.[公共医学][谷歌学者] 35杨莉、朱旭、左敏。小胶质细胞感光细胞串扰的可能机制。摩尔粘度。2007;13:2048–2057.[公共医学][谷歌学者] 36Rochfort KD、Collins LE、Murphy RP等。促炎细胞因子对血脑屏障表型的下调涉及NADPH氧化酶依赖性ROS的生成：对内皮间黏附物和紧密连接的影响。公共科学图书馆一号。2014;9：e101815。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37Joussen AM、Doehmen S、Le ML等。TNF-α介导的细胞凋亡在早期糖尿病视网膜病变和长期组织病理学改变的发展中起着重要作用。摩尔粘度。2009;15:1418–1428. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
