CEACAM1-4S抑制乳腺癌细胞侵袭和迁移

细胞系

具有不同转移潜能的人乳腺癌细胞系（BT549、Hs578T、T-47D、MCF7、MDA-MB-231和MDA-MB-468）购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所（中国上海）。MCF10A是一种来源于纤维囊性乳腺疾病患者的非侵袭性人类永生乳腺上皮细胞系，从美国类型培养收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）获得。所有细胞系均按照供应商的方案进行培养。BT-549和T-47D细胞在RPMI-1640培养基（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA）中培养，Hs578T和MCF7细胞在Dulbecco的改良鹰培养基（Gibco；Hermo Firse Scientistic，Inc.）中培养；MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞在Leibovitz的L-15培养基（Gibco；Thermo Fisher科学，Inc.）上培养。MCF10A细胞在乳腺上皮生长介质中培养（Lonza Group，Ltd.，Basel，Switzerland）。所有细胞系均在37°C下在含有95%空气和5%CO的湿化空气中培养₂培养基中添加10%胎牛血清（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）。

免疫组织化学（IHC）

对乳腺癌组织标本进行CEACAM1免疫组化染色。将组织样品切成4µm厚的薄片，在4°C下将其固定在0.1 m PBS中4%（w/v）多聚甲醛中过夜，在浓度增加的乙醇中脱水，然后嵌入石蜡中。简言之，将石蜡包埋的组织切片脱蜡，在下降浓度的乙醇中重新水化，并在95°C的水浴中提取，然后在4°C的加湿室中与主要抗CEACAM1抗体（1:75；ab49510；英国剑桥Abcam）孵育过夜。接下来，在室温下用生物素化二级抗体（1:100；K4061；Dako；Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA，USA）培养切片1小时。在PBS中漂洗后，加入链霉亲和素-过氧化物酶复合物试剂[StrepABC复合物/辣根过氧化物酶（HRP）Duet；Dako；安捷伦科技公司]。最后，用3,3′-二氨基联苯胺对切片进行可视化，然后在室温下苏木精复染5分钟。对于阴性对照，省略了一级抗体。这些图像是使用显微镜（尼康日食80i；日本东京尼康公司）在×200倍放大率下获得的。使用Image Pro-Plus 6.0软件（美国马里兰州Rockville Media Cybernetics，Inc.）定量评估CEACAM1染色强度。

逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

使用SYBR进行定量实时聚合酶链反应（qPCR）^®Green Premix Ex Taq™（Tli RNaseH Plus）套件（RR420A；Takara Bio Inc.，日本志贺）。收集细胞，并使用TRIzol试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）分离总RNA。根据制造商的协议，使用PrimeScript RT试剂盒（日本志贺县Takara生物技术公司）合成互补DNA。使用CEACAM1-4S（NCBI GenBank登录号NM_00104912）的特异引物（正向，5′-AAACCAGAGTCCCCGTCCT-3′；反向，5′-TGGAGTGGTCCGCTGCCG-3′）对热循环器ABI7500（应用生物系统公司；赛默飞世尔科学公司）进行qPCR。放大条件如下：95°C 30秒，95°C 5秒，64°C 34秒，40个循环。此外，生成熔化曲线以验证分析的特异性。对于CEACAM1-4S mRNA的定量，2^-ΔΔCq（-ΔCq=Cq_GAPDH公司-Cq公司_{CEACAM1号机组})方法(17)被雇佣。通过归一化家政基因GAPDH计算CEACAM1-4S mRNA的相对量。GAPDH的引物序列为正向、5′-GCACGTGTGGAGAAC-3′和反向、5′-ATGGTGAAGAGGAGT-3′。

细胞转染

包含CEACAM1-4S基因和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的质粒由OriGene Technologies，Inc.（美国马里兰州罗克维尔）构建，如Oliveira-Ferrer之前所述等(18). 空载体（PS100071；OriGene Technologies，Inc.）用作对照。将培养的乳腺癌BT549或Hs578T细胞以3×10接种在6孔板中⁵细胞/孔，并根据制造商的协议，使用Opti-MEM还原血清培养基（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）和Lipofectamine Plus试剂（Invitron；Thermal Fisher科学公司）转染1.25µg质粒DNA。使用GFP报告基因监测转染效率。GFP阳性细胞计数结果显示转染效率在50%到75%之间。转染后6 h，将细胞清洗并在完整的生长培养基中培养（BT549的RPMI-1640培养基和Hs578T的Dulbecco改良Eagle's培养基）。48小时后，对细胞进行裂解以进行western blot分析或用于后续实验。

蛋白质印迹分析

使用刮匙收集细胞，并在4°C下以3500×g离心10分钟，然后在冰冷的放射免疫沉淀分析裂解缓冲液（P0013B；Beyotime生物技术研究所，中国上海）中裂解。用SDS-PAGE（10%凝胶）分离等量的蛋白质（30µg），然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭1小时后，在4°C下用一级抗体（包括抗CEACAM1（1:1000；ab49510；Abcam）、抗N-cadherin（1:500；sc8424；Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Dallas，TX，USA）、抗E-cadherin，抗vimentin（1:1000；#3932；Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA，USA）、抗信号转导子和转录激活子3（STAT3；1:1000；#1139；Cell信号技术，Inc.）、抗Smad2/3（1:1000，#8685；Cell信令技术，Inc，抗磷酸-Smad2（Ser465/467；1:1000；#3108；Cell Signaling Technology，Inc.）、抗基质金属蛋白酶（MMP）2（1:1000；#1022；Cell信号技术，Inc.），抗MMP9（1:1000，#3852；Cell信令技术，Inc，抗TIMP2（1:1000；#5738；Cell Signaling Technology，Inc.）和抗GAPDH（1:1000，ab9484；Abcam），然后在室温下用HRP结合的多克隆二级抗体（1:5000；ab6789/ab6721；Abcam）孵育2小时。根据制造商的协议，使用增强型加化学发光分析试剂盒（EMD Millipore，Billerica，MA，USA）对所有蛋白质印迹进行可视化。

Transwell侵入试验

使用孔径为8 mm的Matrigel侵入室研究细胞侵入（Costar；康宁生命科学公司，马萨诸塞州剑桥市，美国）。简单地说，BT549或Hs578T细胞（4×10⁴将无血清培养基中每个培养箱的细胞接种在上部培养箱中，并将10%胎牛血清（FBS）（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）用作底部培养箱中的化学引诱剂。在37°C下培养24小时后，用棉签去除膜上表面的非侵入性细胞，将底部的侵入性细胞在室温下用100%甲醇固定5分钟，室温下用1%结晶紫染色10分钟，并用显微镜进行计数（Nikon Eclipse80i；尼康公司）在×100放大倍数下，每个样品有五个视场。

伤口愈合试验

进行伤口愈合试验以研究细胞迁移。将BT549或Hs578T细胞培养在6孔板（3×10）上⁵细胞/孔），直至达到100%融合。然后用吸管尖端划伤培养物形成伤口线。在用PBS冲洗后，将细胞在含有1%FBS的培养基中培养额外24小时。通过反相对比显微镜（放大倍数×200；尼康公司）观察伤口区域。通过从初始伤口面积中减去24小时时未愈合的面积来计算迁移面积。

免疫荧光染色（IF）

为了进行免疫荧光，将BT549或Hs578T细胞接种在盖玻片上（2×10⁴细胞/孔；24孔板）。第二天，在室温下用100%冷甲醇固定细胞10分钟，然后在室温下在PBS中用1%牛血清白蛋白（ST023；Beyotime生物技术研究所）封闭细胞1小时，然后在4°C下与主要抗体：抗-E-卡德林（1:100；sc8426；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）和抗vimentin（1:200；#3932；Cell Signaling Technology，Inc.。）。使用PBS清洗三次后，在室温下用Alexa Fluor 594结合二级抗体（016580084；Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA，USA）以1:400的稀释度培养细胞1小时。细胞核在室温下黑暗中用DAPI（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）染色10分钟。图像用倒置荧光显微镜（放大倍率×200；尼康公司）捕获。对于阴性对照，省略了主要抗体孵育步骤。图像分析使用Image Pro-Plus 6.0版软件（Media Cybernetics，Inc.）。

CEACAM1-4S mRNA表达与人类乳腺癌细胞系转移潜能降低有关

为了证实免疫组化结果，用qPCR分析了一组具有不同转移潜能的乳腺癌细胞系的CEACAM1 mRNA表达水平。尽管已在人类中描述了12种CEACAM1亚型(19)众所周知，CEACAM1-4S是CEACAM1的一种短细胞质亚型，在人类乳腺上皮中占主导地位(15,20). 因此，以下实验以CEACAM1-4S为代表。如所示图2CEACAM1-4S mRNA在高转移性Hs578T、BT549和MDA-MB-231细胞中的表达明显低于最低转移性MDA-MB-468和T47D细胞以及非侵袭性乳腺上皮MCF10A细胞。当归一化为MCF10A时，除了MCF7细胞外，高转移细胞系中CEACAM1-4S mRNA的表达水平与最低转移细胞系的表达水平相比，平均低4-5倍。

在单独的窗口中打开

图2。

CEACAM1-4S mRNA表达与人乳腺癌细胞株转移潜能的关系。采用定量聚合酶链反应检测永生人乳腺MCF10A细胞和乳腺癌BT549、Hs578T、MDA-MB-231、MDA-MB-468、T47D和MCF7细胞中CEACAM1-4S mRNA水平。数据显示相对于MCF10A的折叠变化。每个实验至少重复三次。CEACAM1-4S，癌胚抗原相关细胞粘附分子1-4S。

研究还发现，与其他细胞系相比，MCF7是一种侵袭性较小的细胞系(21)表达低水平的CEACAM1-4S，表明CEACAM1-4S可能在调节MCF7细胞的转移潜能中没有关键作用。这些数据表明，CEACAM1-4S mRNA表达与乳腺癌转移潜能呈负相关。考虑到临床样本的IHC结果，推测CEACAM1-4S可能在乳腺癌转移中起重要作用。

CEACAM1-4S抑制人乳腺癌细胞的侵袭和迁移

为了验证上述假设，将CEACAM1-4S表达载体或空载体转染到Hs578T和BT549细胞中，这两个高转移性细胞系内源性CEACAM1-4S表达水平较低(21). western blot分析证实了转染效率(图3A)然后进行Transwell侵袭和伤口愈合分析。如所示图3B-E与野生型或空载体对照组相比，CEACAM1-4S转化的细胞通过Matrigel涂层膜侵袭和迁移到受伤区域的能力显著降低。对于过度表达CEACAM1-4S的细胞，入侵细胞的数量比对照组平均低4-5倍，运动能力下降了>40%。此外，CEACAM1-4S过度表达对这两种细胞系的增殖几乎没有影响（数据未显示），表明细胞侵袭和迁移中观察到的所有变化都不是由于细胞增殖引起的。因此，结果表明CEACAM1-4S抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移。

在单独的窗口中打开

图3。

在乳腺癌细胞中转染CEACAM1-4S可抑制侵袭和迁移。（A） Western blot分析验证了CEACAM1-4S在BT549和Hs578T细胞中的转染效率。在（B）BT549和（C）Hs578T细胞中CEACAM1-4S过度表达后进行Transwell侵袭试验。显示代表性图像（放大倍数，×100），数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差***P<0.001。通过CEACAM1-4S转染（放大×200）后（D）BT549和（E）Hs578T细胞的伤口愈合试验，评估CEACAM4-4S对细胞迁移的影响。无细胞区域的相对闭合度表示为三个独立实验的平均值±标准偏差，**P<0.01*P<0.05。CEACAM1-4S，癌胚抗原相关细胞粘附分子1-4S。

MMP2和ITMP2参与CEACAM1-4S对乳腺癌侵袭和迁移的抑制作用

接下来，研究CEACAM1-4S是否抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移。一种可能的解释是，CEACAM1诱导了表征良好的MMPs/TIMPs系统的二次激活，该系统在癌症侵袭中发挥着重要作用(22). 因此，本研究采用western blot分析MMP/TIMP家族的四个主要成员。结果表明，与相应的对照组相比，CEACAM1-4S转染的BT549和Hs578T细胞TIMP2表达水平显著升高，而MMP2表达水平显著降低(图4). 此外，结果显示，在两种细胞系中CEACAM1-4S过度表达后，MMP9和TIMP1的表达没有明显变化。数据表明，MMP2/TIMP2而非MMP1/TIMP1参与了CEACAM1-4S介导的细胞侵袭和迁移抑制。

在单独的窗口中打开

图4。

Western blot分析CEACAM1-4S转染乳腺癌细胞中MMP2、TIMP2、MMP9和TIMP1的相对表达。与相应的对照组相比，CEACAM1-4S转染后，在人类乳腺癌BT549和Hs578T细胞中观察到TIMP2表达增加，同时MMP2降低。相比之下，不同组间MMP9和TIMP1的表达没有差异。基质金属蛋白酶；金属蛋白酶组织抑制剂。