Oncol Lett公司。2017年10月；14(4): 4897–4905.
MACC1的下调通过磷酸酶和紧张素同源物/磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路抑制食管癌细胞的生存能力、侵袭和迁移并诱导细胞凋亡
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李强乾
1中国江苏省苏州市吴江第一人民医院普外科，邮编：215200
李夏琴
2中国江苏省苏州市松陵区卫生院妇产科，邮编：215200
彭慧叶
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郝元素
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王刚（Gang Wang）
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刘燕（Yan Liu）
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根海申
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全根高
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*平均出资
摘要
作为一种癌基因，MACC1在肿瘤的进展和转移中起着重要作用。然而，MACC1在食管癌（EC）中的作用仍有待充分了解。本研究评估了MACC1表达与EC细胞进展之间的关系。将小干扰（si）RNA递送到EC细胞中以下调MACC1的表达。MTT分析表明，siRNA-MACC1降低了EC细胞的活性。与对照细胞相比，MACC1表达的降低增加了EC细胞的凋亡率。Transwell和Matrigel分析表明，siRNA-MACC1分别下调了EC细胞的迁移和侵袭。此外，敲低MACC1通过上调磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）的表达，抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路。本研究的结果表明，MACC1的表达通过PTEN/PI3K/Akt信号通路影响EC细胞的细胞功能。因此，MACC1有可能成为EC的新生物标记物和治疗靶点。
关键词：食管癌，MACC1，磷酸酶和张力蛋白同源物，磷酸肌醇3-激酶，蛋白激酶B
引言
食管癌（EC）与全球死亡率增加有关(1). 尽管治疗方法有所改进，但由于早期局部侵袭和系统性转移，手术切除与化疗或放疗相结合仍然是一种次优的治疗选择(2–4). EC的预后仍然很差，20世纪70年代美国的5年总生存率为4%，20世纪90年代增至14%(5,6). 以前的研究表明，多种生物标记物不仅有助于EC的诊断和治疗，而且有助于预测术后早期复发和临床结局(7–11).
MACC1是在对人类结肠癌组织进行全基因组筛查时首次发现的，其异常表达通过调节肝细胞生长因子-MET原癌基因信号通路与结肠癌的转移和复发相关(12). 此外，先前的研究表明，MACC1的异常表达可能与包括肺在内的多种实体瘤的发展和进展有关(13,14)和胃癌(15–18)，肝细胞癌(19–21)，乳腺癌(22)，神经胶质瘤(23)和冒号(12,24)和食管癌(25). 这些研究表明，MACC1可能是多种人类癌症复发、转移和患者生存的关键生物标志物。据我们所知，关于MACC1在EC中的功能的研究很少。本研究评估了MACC1在EC细胞中的功能。通过调节MACC1的表达来评估EC细胞的存活、侵袭、迁移和凋亡潜能。
材料和方法
细胞培养和治疗
人类EC细胞系Eca109和TE1购自中国科学院（中国上海）的类型培养物收集中心，并在含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基中培养（均来自Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA），100 IU/ml青霉素G和100µG/ml链霉素，37°C，加湿5%CO2孵化器。为了分析细胞活力和迁移率，Eca109和TE1细胞在37°C下用500 nM磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）抑制剂SF1670预处理30分钟（Gene Operation LLC，美国密歇根州安娜堡）。
小干扰RNA转染
siRNA双链由苏州基因制药有限公司（中国苏州）合成和纯化。用无血清培养基将siRNA稀释至100 nM。MACC1的siRNA序列如下：正向，5′-AAGAGGACGGGACGGACGGCTT-3′，反向，5′-TTGGCGACCGGAAGAGGCGT-3′。根据制造商的协议，使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）将MACC1-siRNA转染到实验Eca109和TE1细胞中。使用相同的方案将MACC1-NC（正向，5′-CACAGTTAAGAACGTCCCCAAGCG-3′和反向，5′-AAGCTTGAGGTTAGGTATAATTTC-3′）转染到打乱控制Eca109和TE1细胞中。
蛋白质印迹分析
从转染的Eca109和TE1细胞（1×10）中提取蛋白质6)细胞使用含1/100苯甲烷磺酰基氟化物（P0013；中国海门贝约泰生物技术研究所）的放射免疫沉淀分析裂解缓冲液，在0–4°C条件下培养30分钟。上清液在4°C下以3000×g的浓度收集30分钟。总蛋白浓度用比新酸法测定。使用SDS-PAGE在10%凝胶上分离蛋白质（20µg/lane），然后转移到聚偏氟乙烯膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭膜1小时，然后在4°C下用初级抗体孵育过夜。然后将膜在含有0.05%吐温-20的TBS中清洗三次，并在室温下与标有AP的山羊抗鼠/兔IgG（A0258/A0239；1:5000；Beyotime生物技术研究所）孵育2小时。根据制造商的协议（Pierce；Thermo Fisher Scientific，Inc.），使用增强化学发光试剂盒检测二级抗体。主要抗体为山羊多克隆抗MACC1抗体（目录号HPA020081；稀释度，1:1000；Sigma-Aldrich；德国达姆施塔特默克KGaA）、兔单克隆抗caspase-3抗体（目录编号CST9662）、兔单克隆抗裂解caspase-2抗体（目录号码2872）和兔单克隆抗Bax（目录号5023）（稀释，1:1000；均来自Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA，USA）、兔单克隆抗PTEN（目录号ab32199）、小鼠单克隆抗PCNA（目录号29）、兔单克隆抗Akt（pan；目录号85683）、兔单克隆抗Akt（磷酸S473；目录号81283）（稀释度，1:1000；均来自英国剑桥Abcam）和小鼠单克隆抗GAPDH（目录号KC-5G5；稀释度，1:5000；中国南京康城生物科技有限公司）。GAPDH蛋白作为内部对照。
细胞活力测定
使用MTT法评估Eca109和TE1细胞在上述预处理下的生存能力。用RPMI-1640培养基将Eca109和TE1细胞接种到96孔板（8000个细胞/孔）上，并在37°C下用上述siRNA载体转染。在37°C下培养48小时后，向每个孔中添加5 mg/ml MTT，并在37°C下再培养细胞4小时。向每个孔中添加150 ml二甲基亚砜后，在490 nm处测量吸光度（ELX800；BioTek Instruments，Inc.，Winooski，VT，USA）。实验重复了三次。
软琼脂集落形成试验
为了评估菌落形成，在处理后收集Eca109和TE1细胞，并收集1×104将细胞与0.6%琼脂溶液混合在含有20%FBS的RPMI-1640培养基中，并放置在6孔组织培养板中1.2%琼脂层上。凝胶凝固后，细胞在5%的CO中培养2-3周2将培养箱在37°C下加湿，直至菌落形成，在此期间，每3或4天更换一次添加10%FBS的RPMI-1640。随后使用光学显微镜对含有>50个细胞的菌落进行计数。以×100倍放大率在10个随机场中计数克隆，并计算平均值±标准偏差（SD）。实验重复了三次。
细胞迁移和侵袭检测
根据制造商的协议，使用Transwell分析（EMD Millipore，Billerica，MA，USA）评估Eca109和TE1细胞迁移和侵袭。对于侵袭试验，5×104将全部细胞接种到涂有细胞外基质（50 mg/l Matrigel，无血清培养基1:6稀释；BD Biosciences，美国新泽西州富兰克林湖）的Transwell插入物（孔径，8 mm）上。随后，将含有10 g/l牛血清白蛋白的100µl无血清RPMI-1640培养基（ST023；Beyotime生物技术研究所）添加到上部培养箱中，并将500µl完整培养基添加到下部培养箱中。细胞在37°C下培养24小时，以进行迁移和侵袭分析。对于迁移分析，5×104Eca109和TE1细胞接种到未涂有Matrigel的Transwell插入物上。在37°C下培养24小时后，使用棉花涂布器去除粘附在滤纸上表面的细胞，并在室温下用0.5%结晶紫染色15分钟。用光学显微镜在10个随机区域中以×100倍放大率计算细胞数量。获得的值是计算每次试验三次的平均值±标准偏差（SD）。
细胞凋亡分析
Eca109和TE1细胞接种到6孔板（5×105细胞/孔）和RPMI-1640完整培养基。在如上所述的转染48小时后，通过250×g室温离心3分钟收集细胞，包括培养基上清液，并用PBS清洗每个孔中的细胞两次。随后在室温下用5µl Annexin V-fluorescein isothiocyanate在195µl结合缓冲液（目录号C1063；Beyotime Institute of Biotechnology）中在黑暗中孵育细胞10分钟。细胞在250×g室温下离心5分钟，然后再悬浮在190 ml结合缓冲液和10 ml碘化丙啶中。使用BD FACSVerse™（651156）流式细胞仪（BD Biosciences）对所有样本进行凋亡分析。使用BD FACSuite™软件（11.10；BD Biosciences）分析数据。实验重复了三次。
免疫细胞化学
Eca109和TE1细胞（2×105)用RPMI-1640完整培养基在6孔板的盖玻片上培养，并如上所述转染MACC1-siRNA。培养48小时后，用PBS清洗细胞，用2%w/v多聚甲醛固定15分钟，并在室温下用1%v/v Triton X-100渗透10分钟。随后，通过在室温下用10%w/v正常山羊血清（SP Kit-B2；中国福州麦欣生物科技有限公司）在PBS中培养1h，实现阻断。然后用MACC（目录号HPA020081；稀释度，1:100；Sigma-Aldrich；Merck KGaA）、PTEN（目录号ab32199；稀释度：1:100）培养细胞和p-Akt（磷酸化S473；目录号ab81283；稀释，1:200）（均来自Abcam）在4°C下过夜。随后，用PBS清洗细胞，并在室温下用Cy3-标记的二级抗体（目录号A0516；稀释度1:400；Beyotime生物技术研究所）培养1 h，然后在室温下使用DAPI（1µg/ml）复染5 min（Sigma-Aldrich；Merck KGaA）。使用荧光显微镜（×200放大倍数）获得免疫染色细胞的图像。
统计分析
所有统计分析均使用SPSS 18.0统计软件（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）进行。结果显示为平均值±标准差（视情况而定）。使用Student t检验比较各组的生存能力、迁移、侵袭和凋亡。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
MACC1表达减少显著抑制EC细胞体外存活
使用MTT测定法评估细胞活力。本研究评估了用siRNA-MACC1转染EC细胞后的四个时间点（12、24、48和72小时）。结果表明，转染siRNA-MACC1的EC细胞与转染打乱对照细胞相比，细胞活力显著降低（P<0.05；). siRNA-MACC1对EC细胞活力的抑制率为5–35%。本研究评估了治疗2周后EC细胞的集落形成率。结果表明，转染siRNA-MACC1的EC细胞与对照组相比，形成的集落较少（P<0.05，P<0.01；). 本研究结果表明，siRNA-MACC1抑制EC细胞的活性和肿瘤能力在体外.
MACC1的下调显著抑制EC细胞的活力和集落形成在体外（A）采用MTT法评估EC细胞活力。用siRNA-MACC1和干扰控制siRNA预处理Eca109和TE1细胞12、24、48或72小时*与加扰控制相比，P<0.05，**P<0.01。食管癌；si，小干扰。
下调MACC1有助于抑制体外EC细胞的迁移和侵袭
为了评估siRNA-MACC1对细胞运动的影响，EC细胞在转染后进行迁移和侵袭试验。结果表明，siRNA-MACC1转染EC细胞组的迁移细胞和侵袭细胞数量显著低于打乱对照EC细胞组（P<0.05；). 这些结果表明，MACC1的敲除有助于抑制EC细胞的迁移和侵袭在体外本研究表明，MACC1在调控EC细胞运动，包括侵袭和转移中起关键作用。
MACC1下调有助于抑制食管癌细胞的迁移和侵袭在体外分别使用Matrigel和Transwell分析评估MACC1表达下调的Eca109和TE1细胞的迁移和侵袭。数据以平均值±标准偏差表示，这是从三个独立的实验中得出的*与加扰控制相比，P<0.05。si，小干扰。魔法，×100。
敲除MACC1显著诱导EC细胞凋亡
细胞凋亡实验显示，siRNA-MACC1转染Eca109细胞的凋亡率（9.71±2.89%）高于对照细胞（4.79±1.65%）；siRNA-MACC1转染的TE1细胞的细胞凋亡率（15.32±2.45%）高于打乱对照TE1细胞（6.08±0.87%）。两组细胞凋亡率差异有统计学意义（P<0.05；). 与对照细胞相比，siRNA-MACC1转染的EC细胞中抗凋亡指标B细胞淋巴瘤2（BCL2）的表达下调，凋亡相关裂解caspase-3和BCL2相关X的表达上调(). 本研究表明下调MACC1可显著诱导EC细胞凋亡在体外.
下调MACC1表达诱导食管癌细胞凋亡在体外（A）使用流式细胞术测量由siRNA-MCC1诱导的凋亡潜能。（B） western blot分析检测MACC1表达下调的Eca109和TE1细胞中凋亡相关蛋白的表达*与加扰对照组相比P＜0.05。si，小干扰；Bcl2，B细胞淋巴瘤2；bax、Bcl2相关的X；异硫氰酸荧光素。
降低MACC1表达抑制EC细胞的PTEN/磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路
本研究评估了下调MACC1表达对EC细胞PTEN和PI3K/Akt信号通路的影响(). 与打乱对照EC细胞相比，siRNA-MACC1转染EC细胞的MACC1蛋白表达显著降低(). 在MACC1表达下调的EC细胞中，与打乱对照EC细胞相比，PTEN的表达增加，总Akt的表达保持不变，磷酸化（p）Akt和增殖细胞核抗原的表达降低(). 本研究从免疫荧光实验中获得了类似的结果(). 此外，本研究使用PTEN抑制剂SF1670评估PTEN对EC细胞信号通路的影响。结果表明，500 nM SF1670处理降低了对EC细胞中Akt活性、流动性和磷酸化的抑制(). 本研究结果表明，减少MACC1表达会影响EC细胞中PTEN的表达和Akt的磷酸化，这表明MACC1是一种潜在的癌蛋白，也是这些细胞中PTEN/PI3K/Akt信号通路激活的促进因子。此外，减少EC细胞中MACC1的表达可能促进了PTEN对PI3K/Akt信号通路的调节，并有助于PTEN发挥抑癌作用。
下调MACC1表达抑制食管癌细胞中PTEN/PI3K/Akt信号通路。（A） 用免疫荧光（放大×200）检测MACC1、PTEN和pAkt的表达。（B） western blot分析检测MACC1表达下调的Eca109和TE1细胞中MACC1、PTEN、tAkt、pAkt和PCNA的蛋白表达。PTEN、磷酸酶和张力蛋白同源物；PI3K，磷脂酰肌醇3-激酶；蛋白激酶B；p、 磷酸化；t、 总量；增殖细胞核抗原；si，小干扰。
PTEN抑制剂SF1670影响EC细胞的存活率、迁移率和PTEN/PI3 K/Akt信号通路。（A） 采用MTT法评估EC细胞活力。用打乱控制siRNA和siRNA-MACC1对Eca109和TE1细胞进行12、24、48或72小时的预处理，包括或不包括500 nM SF1670。数据以平均值±标准偏差表示，这是从三个独立的实验中得出的。（C） 采用western blot分析检测MACC1、PTEN、tAkt和pAkt蛋白在Eca109和TE1细胞中的表达，这些细胞的MACC1表达下调有或没有500nM SF1670*与加扰控制相比，P<0.05。PTEN、磷酸酶和张力蛋白同源物；PI3K，磷脂酰肌醇3-激酶；蛋白激酶B；食管癌；si，小干扰；t、 总量；p、 磷酸化。放大倍数，×100。
讨论
在癌症类型中，EC与20世纪90年代全球第六高的死亡率有关(三). 尽管研究和新的分子靶点改善了早期诊断和治疗选择，并提供了微创手术选择，但由于转移和复发率增加，EC的5年生存率仍然很低(5).
EC细胞通过血液或淋巴系统从原发部位迁移到远处，这是EC预后的一个关键因素。MACC1最初被鉴定为结肠癌癌基因，可能作为早期诊断生物标志物，与多发性实体瘤的进展有关(12–28). 斯坦因等(12)证明MACC1上调与良性肿瘤转变相关。王等(29)发现抑制MACC1显著抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移。然而，MACC1在EC细胞中的表达效果尚不清楚。本研究利用MACC1-siRNA评估了MACC1在EC细胞中的表达及其对EC细胞存活、迁移、侵袭和凋亡的影响。结果表明，抑制EC细胞中MACC1的表达会降低其生存能力，并影响迁移和侵袭，这是转移的关键过程。此外，下调MACC1有助于诱导EC细胞凋亡。这些结果表明，MACC1表达增加可能与EC细胞的生存和侵袭性有关，并可能在其转移中发挥重要作用。
先前的研究表明，MACC1与Akt和Ras/EPH受体B2信号通路相关(28–30). 张等(28)表明MACC1的表达可能影响PI3K/Akt信号通路以及基质金属肽酶（MMP）2和MMP9的蛋白表达。孟等(30)结果表明，pAkt是MACC1的关键靶基因，在鼻咽癌细胞中，MACC1下调显著抑制了pAkt的表达。在本研究中，下调MACC1表达可增加EC细胞中PTEN的表达并降低Akt的磷酸化。PTEN是一种在多种组织中具有多种功能的肿瘤抑制基因，通过去磷酸化PI3K/Akt信号通路发挥中心负调控作用(31)PI3K的P3和调节下游信号(32). 本研究表明下调MACC1可降低EC细胞的活力和迁移率。本研究还表明，PTEN抑制剂SF1670不仅降低了siRNA-MACC1对EC细胞活力和迁移率的抑制作用，而且影响了EC细胞中PTEN/PI3K/Akt信号通路。这些结果表明，MACC1是一种潜在的癌蛋白，是激活EC细胞PTEN/PI3K/Akt信号通路的促进因子。此外，减少EC细胞中MACC1的表达可能促进了PTEN对PI3K/Akt信号通路的调节，并有助于PTEN发挥抑癌作用。
本研究表明，MACC1异常表达可能影响PTEN/PI3K/Akt信号通路，从而对EC细胞的存活、迁移、侵袭和凋亡至关重要。这些结果表明MACC1可能作为EC的治疗靶点。然而，MACC1在PTEN/PI3K/Akt信号通路中的作用的分子机制尚不完全清楚。需要进一步研究以阐明MACC1的遗传特征及其作为EC抗肿瘤治疗靶点的潜力。
参考文献
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