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Oncol Lett公司。2017年10月；14(4): 4822–4828.
2017年8月14日在线发布。 数字对象标识：10.3892/ol.2017.6753
预防性维修识别码：项目经理5649603
PMID：29085486

的标识NCCRP1号机组作为食管鳞癌恶性表型的表观遗传调控肿瘤抑制因子和生物标志物

Miwa先生, 神田光郎, 小池正彦, 岩田直树, 田中春一, 铃田信一, 奇·田中, 小林大辅, Masamichi Hayashi先生, 山田秀古, 藤井拓木, 藤原美中,和柯田靖弘
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

食管鳞状细胞癌（ESCC）的不良预后和发病率的增加突出了识别新的ESCC相关分子事件以提高该疾病的诊断和治疗的必要性。非特异性细胞毒性细胞受体蛋白1(NCCRP1号机组)据报道在人类鳞状上皮中大量表达，并参与细胞增殖；然而NCCRP1号机组在ESCC中仍不清楚。阐明NCCRP1号机组在ESCC中，NCCRP1号机组对ESCC细胞系的表达、DNA甲基化和拷贝数进行分析。9个ESCC细胞株表现出不同NCCRP1号机组mRNA表达水平和均表现出高甲基化NCCRP1号机组启动子，但没有拷贝数丢失。此外，NCCRP1号机组在213例手术切除的食管组织标本中检测其表达。NCCRP1号机组204例（95.8%）患者食管鳞癌组织中mRNA表达水平与相应的癌旁组织相比降低。低收入患者NCCRP1号机组与高表达组相比，高表达组的复发率更高，总生存时间更短NCCRP1号机组表达组。此外，多元分析显示NCCRP1号机组表达是一个独立的预后因素（危险比，1.75；95%可信区间，1.08–2.87；P=0.022）。当前研究结果表明NCCRP1号机组作为一种假定的肿瘤抑制因子，通过启动子超甲基化被灭活，并作为一种有希望的生物标志物来预测ESCC的术后预后。

关键词：食管癌，NCCRP1号机组甲基化，预后，生物标志物

介绍

食管癌仍是癌症相关死亡的一个重要原因，其发病率在全球范围内急剧增长，已超过6倍(1,2). 食管鳞状细胞癌（ESCC）是食管恶性肿瘤的主要组织学类型(三,4). 食管鳞状细胞癌预后不良，发病率不断增加，这突出表明需要改进检测、预测、监测和治疗方法(2,5). 现有的组织病理学术语，如病理性TNM分类，不足以准确预测结果的个体差异并为个性化治疗提供信息(2,6). 遗传和表观遗传学改变，如异常基因表达、拷贝数改变和DNA甲基化，与食管鳞癌以及其他恶性肿瘤的发生有关，并且基因组和表观遗传谱的潜在预后作用的证据正在积累(7,8). 由于分子标记可在风险分层中用于预测治疗反应、转移潜能、复发和生存率，研究人员应继续努力，以确定新的ESCC相关分子事件(9,10).

非特异性细胞毒性细胞受体蛋白1(NCCRP1号机组)最初是从鱼类中克隆的，预计是II/III型膜蛋白(11). NCCRP1被认为是一种在非特异性细胞毒性细胞中表达的受体，负责其细胞溶解功能(12). 后来，卡利奥等对人类基因进行了研究，发现NCCRP1在细胞内表达，是F-box超家族蛋白质的一个副家族，是E3泛素连接酶复合物的组成部分，调节细胞周期(13). 更重要的是，NCCRP1号机组mRNA在含有鳞状上皮的人类组织中大量表达，并沉默NCCRP1号机组导致HeLa细胞的生长显著下降(13). 然而NCCRP1号机组ESCC中未知。

在本研究中，我们重点关注NCCRP1号机组作为候选ESCC相关基因，原因如下：(1)鳞状上皮中富含NCCRP1；(2)NCCRP1参与细胞增殖；(三)的NCCRP1基因基因在启动子区有一个CpG岛（暗示甲基化的可能性）；(4)NCCRP1是调节细胞周期的F盒超家族蛋白的一个paralog(14–16); 最后(5)没有与以下内容相关的已发布数据NCCRP1号机组在ESCC中表达。本研究的目的是评估NCCRP1号机组在ESCC中。

材料和方法

伦理学

本研究符合世界医学协会《赫尔辛基人体医学研究伦理原则宣言》的伦理准则。按照日本名古屋大学机构审查委员会的要求，所有患者都获得了使用临床样本和数据的书面知情同意书。

样品采集

9个ESCC细胞系（TE1、TE2、TE3、NUEC1、NUEC2、NUEC3、TT、TTn和WSSC(17). 使用细胞保存液（cell Banker；Mitsubishi Chemical Medience Corporation，Tokyo，Japan）将细胞储存在−80°C的温度下，并在添加有10%胎牛血清的RPMI-1640（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）中在含有5%CO的大气中培养细胞2温度为37°C。2001年10月至2016年1月期间，在名古屋大学医院接受食管癌根治术的患者共获得213个原发性食管癌组织和邻近正常组织。所有组织样本经组织学诊断为ESCC，切除后立即冷冻，并储存在−80°C。使用第七版UICC食管癌分期系统对标本进行组织学分类。对患者进行询问，以确定他们的饮酒水平，过量饮酒被定义为≥3年>210 g/周(18). 自2006年起，除非患者的病情或拒绝，否则对临床II/III期食管鳞癌患者进行新辅助化疗（氟尿嘧啶联合铂类药物）(19,20). 术后随访检查包括体格检查、每3个月测量一次血清肿瘤标志物、每6个月增强一次胸腹腔CT检查。根据患者的情况和医生的判断，对选定的患者进行辅助化疗。

定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）

的级别NCCRP1号机组用qRT-PCR测定mRNA。从ESCC细胞系和213个初级ESCC及邻近正常组织中分离的总RNA（10µg）用作cDNA合成的模板。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH公司)对mRNA水平（TaqMan、GAPDH对照试剂：美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行量化，以使表达水平正常化(9). 使用SYBR Green PCR核心试剂盒（Applied Biosystems）进行qRT-PCR，如下所示：95°C下一个循环，持续10分钟；在95°C下进行40次循环，持续5秒，在60°C下持续60秒。所有样品均进行了一式三份的测试，每个PCR板中包含无模板的样品作为阴性对照。使用ABI StepOnePlus实时PCR系统（Applied Biosystems）实时检测SYBR绿色荧光。每个样本的表达式级别显示为NCCRP1号机组放大子除以GAPDH公司(21). 特定引物的序列列于表一.

表一。

引物序列。

底漆实验类型序列（5′-3′）产品尺寸退火温度
NCCRP1号机组qRT聚合酶链式反应福沃德AAAGCTCCAGCAGAAACCAAA公司104个基点60摄氏度
反向TAATGGCTGTTTCGTCA公司
亚硫酸氢盐福沃德TTTAGTTAATTTTAGTTTGTGAAAT公司282个碱基64摄氏度
排序反向CCACTCTCACAACACACACTAC
GAPDH公司qRT聚合酶链式反应福沃德GAAGGTGAAGGTCGGAGTC公司226个基点60摄氏度
探查CAAGCTTCCCCGTTCTCAGCC
反向GAAGATGGTGATGGATTTC公司

NCCRP1号机组非特异性细胞毒受体蛋白1；GAPDH公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

NCCRP1基因甲基化分析

进行核苷酸序列分析以确定CpG岛是否存在于NCCRP1号机组CpG岛定义如下：≥200-bp区域，GC含量>50%，CpG：预期CpG≥0.6，使用Methyl Primer Express软件（Applied Biosystems）确定。从细胞系中分离出的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理以进行亚硫酸氢序列分析。用特异性引物扩增了9个ESCC细胞系和对照细胞（FHs 74）的亚硫酸氢盐DNA(表一)并使用Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科学公司）和日本东京Eurofins Genomics Co Ltd的3730x l DNA分析仪（应用生物系统公司）进行测序。评估启动子高甲基化与NCCRP1号机组转录，GC细胞（1.5×106细胞）用5-aza-2′-脱氧胞苷（5-aza-dC；Sigma-Aldrich）处理以抑制DNA甲基化，然后培养6天，在第1天、第3天和第5天改变培养基(22). 提取RNA并按上述方法进行qRT-PCR。

拷贝数分析

NCCRP1号机组使用TaqMan拷贝数测定法（Applied Biosystems）测定了9个ESCC细胞系的拷贝数。根据制造商的说明，使用特异性引物对扩增20纳克的基因组DNA（测定ID:Hs02638838_cn，外显子6内）。使用CopyCaller软件（加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命科技公司）分析数据(23). 拷贝数丢失定义为拷贝数值等于在NCCRP1号机组轨迹。

统计分析

使用Mann-Whitney U检验比较两组之间的数值变量。χ2test用于分析NCCRP1号机组和临床病理参数。使用Kaplan-Meier方法计算总生存率和无病生存率，并使用对数秩检验分析生存曲线的差异。我们使用Cox比例风险模型进行多变量回归分析，以检测预后因素，并将P值<0.05的变量输入最终模型。所有统计分析均使用JMP 10软件（SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）进行。P值<0.05被认为具有统计学意义。

结果

细胞系的表达、甲基化和拷贝数分析

NCCRP1号机组在转录起始位点侧翼含有CpG岛（长度920bp，GC 64.9%，CpG 5.7%；图1A).NCCRP1号机组9种ESCC细胞系的mRNA表达水平不同(图1B). 亚硫酸氢盐序列分析显示CpG位点位于NCCRP1号机组所有ESCC细胞中的DNA均为CG（完全甲基化），对照细胞系FHs74=中的相应位置为TG（无甲基化）(图1C). 当我们比较NCCRP1号机组ESCC细胞株去甲基化前后mRNA的表达NCCRP1号机组在所有ESCC细胞中检测到转录(图1B). 此外，在ESCC细胞系中没有检测到拷贝数的丢失(图1B).

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ESCC细胞系的表达、甲基化和拷贝数分析。（A） 在NCCRP1号机组转录起始位点。（B）NCCRP1号机组5-氮杂-dC处理前后9个ESCC细胞株的mRNA水平。甲基化和拷贝号信息NCCRP1号机组在单元格中的行如图所示。（C） 亚硫酸氢盐序列分析的代表性结果。对照组中所有CpG位点均转化为TG，而NUEC1、TE2和TT的CpG位点均转化为CG。食管鳞癌；NCCRP1号机组非特异性细胞毒性细胞受体蛋白1；M、 甲基化。

手术切除食管组织中NCCRP1 mRNA水平的临床意义

213名患者的中位年龄为66岁（44-84岁）。男女比例为167:16。根据UICC分期系统（第七版），42、54、107和10名患者分别处于病理阶段I、II、III和IV。患者随访的中位持续时间为35.2个月（范围为4.8-173个月）或直至死亡。204名患者（95.8%），NCCRP1号机组与相应的癌旁组织相比，食管鳞癌组织中的mRNA表达水平较低。的平均表达水平NCCRP1号机组与邻近正常组织相比，ESCC组织中的mRNA显著减少(图2A).

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的表达式NCCRP1号机组在临床标本中。（A） 的平均水平NCCRP1号机组与相应的正常邻近组织相比，食管鳞癌组织中的mRNA表达较低。（B） 213例食管鳞癌患者的总体无病生存率。食管鳞癌；NCCRP1号机组，非特异性细胞毒性细胞受体蛋白1。

根据患者的中位数，将患者分为两组NCCRP1号机组食管鳞癌组织中mRNA表达水平（高NCCRP1号机组表达组，n=107；低的NCCRP1号机组表达组，n=106）。未发现两者之间存在显著关联NCCRP1号机组表达组和临床病理参数，包括患者性别、肿瘤大小、位置和深度(表二). 处于低位的患者NCCRP1号机组与高表达组相比，表达组的总生存时间（OS）更短NCCRP1号机组表达组（低表达组和高表达组的5年OS率分别为52和69%；P=0.031；图2B). 在总体生存率的多元分析中NCCRP1号机组表达被确定为一个独立的预后因素（危险比，1.75；95%可信区间，1.08–2.87；P=0.022；表III). 无病生存率（DFS）也显著低于NCCRP1基因高表达组NCCRP1号机组表达组（3年DFS率低和高分别为47和61%NCCRP1号机组表达组；P=0.042；图2C). 低位食管癌根治术后总复发率NCCRP1号机组表达组高于高表达组NCCRP1号机组表达组（分别为49%和35%，P=0.032；图3A). 在低复发率和高复发率之间的比较中，在转移部位没有发现明显的复发趋势NCCRP1号机组表达式组(图3A).

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的临床意义NCCRP1号机组表达式。（A） 各组初次复发的部位根据NCCRP1号机组表达式。（B） 根据NCCRP1号机组新辅助化疗（NAC）的表达和疗效。NCCRP1号机组，非特异性细胞毒性细胞受体蛋白1。

表二：。

表达式之间的关联NCCRP1号机组213例食管鳞癌患者的mRNA和临床病理参数。

参数低NCCRP1基因表达式（n）高NCCRP1号机组表达式（n）P值
年龄（年）
  <654746
  ≥6559610.843
性别
男8780
女性19270.194
术前症状
缺席者：2429
出席82780.451
布林克曼指数
  <1,0006675
  ≥1,00040320.227
过量饮酒
不存在3029
出席76780.845
癌胚抗原（ng/ml）
  ≤59496
  >512110.807
SCC（纳克/毫升）
  ≤1.56568
  >1.541390.737
肿瘤大小（cm）
  <5.06362
  ≥5.043450.825
肿瘤位置
铈，公吨6568
左侧，Ae41390.737
UICC pT系数
第T1-2页3942
T3-4层67650.712
区别
中等至良好9094
可怜的16130.531
淋巴受累
不存在3028
出席76790.727
血管侵入
缺席者：6268
出席44390.449
上皮内扩散
不存在7982
出席27250.720
壁内转移
缺席者：10097
出席  6100.305
淋巴结转移
不存在3744
出席69630.350

χ2测试。统计学意义（P<0.05）。鳞状细胞癌相关抗原；UICC，国际癌症控制联盟。

表三。

213例食管鳞癌患者总生存率的预后因素。

单变量多变量
变量n个危险比95%置信区间P值危险比95%置信区间P值
年龄（≥65岁）1201.280.80–2.090.308
性别（男性）1671.300.74–2.430.370
术前症状1602.051.12–4.130.0181.870.93–4.040.081
布林克曼指数（≥1000）72个1.170.71–2.020.540
饮酒过量1540.890.54–1.540.678
CEA（>5纳克/毫升）  231.580.79–2.890.187
应力腐蚀开裂（>1.5 ng/ml）  801.360.84–2.190.206
肿瘤大小（≥5.0cm）  881.300.81–2.070.281
肿瘤位置（Lt/Ae）  800.830.50–1.350.460
UICC T系数（T3-4）1321.921.15–3.340.0111.090.59–2.080.794
肿瘤分化（差）  291.470.77–2.610.226
淋巴受累1553.521.79–7.98<0.0012.871.37–6.800.004一
血管侵入  831.470.91–2.350.111
上皮内扩散  521.370.82–2.240.228
壁内转移  1620.92–3.830.076
淋巴结转移1322.511.47–4.53<0.0011.680.95–3.150.077
低NCCRP1号机组表达1061.691.05–2.750.0311.751.08–2.870.022一
一多变量分析具有统计学意义（P<0.05）。CI，置信区间；癌胚抗原；鳞状细胞癌相关抗原；UICC，国际癌症控制联盟。采用log-rank检验进行单变量分析。使用Cox比例风险模型进行多变量分析。

我们根据新辅助化疗（氟尿嘧啶联合铂类药物）的用药情况进行了亚组分析，以进一步探讨NCCRP1号机组在ESCC中表达。预测的影响NCCRP1号机组新辅助化疗患者与未化疗患者的表达相似(图3B).

讨论

先前的分子研究证明，ESCC不仅是由吸烟或过度饮酒等环境因素和易感基因变异的综合作用引起的，但也来自遗传和表观遗传改变的积累，这些改变在细胞永生化和肿瘤发生过程中起着关键作用(6,7,24). 了解食管肿瘤发生和发展背后的分子机制和变化对于疾病监测和确定食管鳞癌的新治疗和临床靶点至关重要(2,25). 迄今为止，致癌基因和抑癌基因（TSG）、细胞周期调节器、细胞粘附分子和DNA修复基因的多种遗传和表观遗传变化与食管癌的发生有关(7,26,27). 然而，ESCC的分子发病机制仍不完全清楚，破译致癌的潜在机制至关重要。我们假设NCCRP1号机组是一个候选的ESCC相关基因。

这个NCCRP1号机组该基因位于染色体19q13.2上，编码由275个氨基酸残基组成的31-kDa蛋白(11,13). 以前没有关于肿瘤作用的报告NCCRP1号机组在本研究中，我们研究了NCCRP1号机组在ESCC中。我们的结果表明NCCRP1号机组作为TSG的功能，可能至少部分导致ESCC致癌，因为大多数检查的ESCC显示减少NCCRP1号机组mRNA表达与匹配的非癌组织比较。我们还评估了NCCRP1号机组具有ESCC临床特征的表达。低水平患者NCCRP1号机组表达可能预后不良，这意味着NCCRP1基因在ESCC进展中，提示NCCRP1号机组食管鳞状细胞癌组织可能是预测术后结果的新生物标记物。值得注意的是NCCRP1号机组与食管鳞癌预后的典型危险因素（如肿瘤深度和淋巴结转移）无显著相关性。这一发现可能突出了NCCRP1号机组用于独立于TNM分期系统对有不良预后风险的患者进行分层。由于JCOG9907 III期研究的结果比较了临床II/III期ESCC患者术前或术后顺铂联合氟尿嘧啶的生存益处，证明了新辅助化疗的优越性，新辅助顺铂加氟尿嘧啶联合食管切除术是日本食管鳞癌患者的标准治疗方法(19,20). 在这项研究中，我们发现NCCRP1号机组接受新辅助化疗的患者与未接受新辅助治疗的患者的表达相似。这一结果强调了NCCRP1号机组无论患者是否接受新辅助化疗，表达预测术后预后。

启动子超甲基化导致各种恶性肿瘤中TSG的转录沉默(28,29). 在调控机制方面，所有被检测的ESCC细胞系都含有NCCRP1号机组启动子超甲基化。此外，NCCRP1号机组在用DNA甲基化抑制剂处理的细胞中转录增加。据我们所知，这是第一份关于NCCRP1号机组然而，没有一个ESCC细胞株在NCCRP1号机组轨迹。这些发现表明，启动子高甲基化是抑制NCCRP1号机组ESCC中的转录。由于肿瘤特异性异常DNA甲基化可以比mRNA表达水平更稳定地检测到(30)，它已被认为是一种很有前途的液体活检和评估手术边缘印记局部复发的工具(31,32). 检测NCCRP1号机组除ESCC组织外，循环血液中的甲基化将提高NCCRP1号机组.

作为未来的展望，我们的发现可以转化为以下几个临床应用：i）NCCRP1号机组在内镜监测期间获得的术前活检组织可以确定需要强化围手术期治疗的患者；ii）表达水平NCCRP1号机组手术标本可以预测复发和随后的不良预后，这可能有助于设计适当的术后治疗和监测策略；和iii）去甲基化剂靶向NCCRP1号机组可以作为治疗手段。然而，这项研究有一些局限性。需要进一步的研究，包括食管癌发生中的通路分析，以阐明食管癌生物活性的分子机制NCCRP1号机组在ESCC中。此外，本研究还受到样本量相对较小以及缺乏对表达分析的再现性及其跨实验室标准化的外部验证的限制。最后，由于缺乏对NCCRP1号机组.更好地了解NCCRP1号机组将通过强制表达NCCRP1号机组.

然而，综合起来，我们的研究结果支持以下结论：NCCRP1号机组作为一个被启动子高甲基化失活的假定抑癌基因，可能成为预测ESCC术后预后的一个有希望的生物标志物。

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