Oncol Lett公司。2017年10月；14(4): 4800–4804.
STK33与肺癌病理及预后的关系
, , , , ,和
一路
上海交通大学附属第六人民医院呼吸内科，中国上海200233
杰唐
上海交通大学附属第六人民医院呼吸内科，中国上海200233
张文美（Wenmei Zhang）
上海交通大学附属第六人民医院呼吸内科，中国上海200233
策慎
上海交通大学附属第六人民医院呼吸内科，中国上海200233
凌旭
上海交通大学附属第六人民医院呼吸内科，中国上海200233
杨丹荣
上海交通大学附属第六人民医院呼吸内科，中国上海200233
上海交通大学附属第六人民医院呼吸内科，中国上海200233
2017年6月16日收到；2017年8月11日接受。
摘要
研究STK33的表达与肺癌病理的相关性，探讨其对预后的影响。于2012年2月至2017年2月在上海交通大学附属第六人民医院随机抽取病理确诊的102例肺癌患者作为观察组，收集肿瘤组织。同时选取19例肺良性病变患者作为对照组，收集肺组织。RT-qPCR检测STK33 mRNA在组织中的表达。采用SP免疫组织化学染色和western blot分析检测STK33蛋白的表达水平并进行比较。统计分析STK33表达与肺癌病理及预后的相关性。PCR结果显示，对照组STK33基因的表达水平显著低于观察组（p<0.05）。STK33 mRNA在肺腺癌和鳞癌中的表达水平低于肺小细胞癌和大细胞癌（p<0.05）。Western blot分析显示，STK33蛋白在肺小细胞癌和大细胞癌中的表达水平显著高于肺腺癌和鳞癌（p<0.05）。免疫组化染色显示，STK33在肺大细胞癌（100%）和小细胞癌（10%）中的阳性率显著高于肺腺癌（88.1%）和鳞癌（86.2%）（p<0.05）。5年生存率分析表明，STK33基因高表达组的无复发生存率和总生存率显著低于低表达组（p<0.05）。STK33的差异表达水平与肺癌的病理和预后有关，对临床诊断和预后评估具有重要价值。
关键词：STK33，肺癌，病理学，预后
介绍
肺癌是最严重的癌症之一，没有有效的治疗(1). 肺癌的发病率是全世界所有类型癌症中最高的。肺癌也会导致无法接受的高死亡率，约占癌症死亡人数的25%(2). 随着吸烟者数量的增加和环境污染的加剧，特别是在工业化城市，肺癌的发病率正在迅速增加(三). 目前，基因检测和靶向治疗受到越来越多的关注。一些靶向药物已被证明能够延长肺癌患者的寿命(4). 近年来，STK33已被证明在多种癌症的发生发展中发挥重要作用，并参与DNA复制、信号转导、细胞增殖、细胞分化、凋亡和肿瘤发展的调控。由于STK33与众所周知的癌基因Ras相关，STK33已成为一个活跃的研究领域(5). 然而，关于STK33在肺癌发生发展中的作用的研究相对较少，STK33在肺癌发生发展中的作用尚不清楚(6,7). 本研究探讨STK33基因表达与肺癌病理及预后的关系，为临床诊断和治疗提供参考。
材料和方法
研究课题
2012年2月至2017年2月，在上海交通大学附属第六人民医院随机抽取102例经病理检查确诊的肺癌患者。收集肿瘤组织作为观察组。患者包括63名男性和39名女性，年龄为33至77岁，平均年龄为54.3岁。其中腺癌42例，鳞癌29例，小细胞肺癌16例，肺大细胞癌15例。同时选取19例肺良性病变患者作为对照组，收集肺组织。对照组包括8例肺炎、5例肺结核、4例良性肿瘤和2例淋巴组织非典型增生。排除标准：i）患有主要心脑血管疾病和消化系统疾病的患者；ii）患有精神障碍或无法以正常方式与研究人员沟通的患者；iii）孕妇；iii）临床数据不完整的患者。对所有患者进行电话随访，收集数据，分析5年生存率。两组在性别、年龄等基本信息方面无显著差异（p>0.05）。该研究得到了上海交通大学附属第六人民医院伦理委员会的批准。所有患者或其家属签署书面知情同意书。
试剂
TRIzol（美国纽约州纽约市生命科技公司）；氯仿和异丙醇（北京化学有限公司，中国北京）；M-MLV逆转录酶；DNase I（均来自Life Technologies）；SYBR公司®Premix Ex Taq™II（Takara Bio Inc.，中国辽宁）；DNA标记（TransGen Biotech，北京，中国）；引物合成（北京基因组研究所，广东）；RIPA蛋白裂解物（Solarbio，北京，中国）；肌动蛋白和STK33兔抗人一级抗体（细胞信号技术，马萨诸塞州波士顿，美国）；BCA工具包（生命技术）；脱脂奶粉（BD Biosciences，New Jersey，NY，USA）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二级抗体（细胞信号技术）；NC膜（Millipore，Billerica，MA，USA）；发光基质试剂盒（TransGen Biotech）；SP套件（细胞信号技术）。
实时逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）
肺癌组织和良性病变组织在使用前通过纤维支气管镜收集并储存在液氮中。组织在液氮中研磨，根据试剂盒的说明，使用TRIzöl提取总RNA。测量RNA样品的浓度，并使用1µg RNA和逆转录酶试剂盒进行逆转录以获得cDNA。SYBR公司®使用Premix Ex Taq™II和cDNA制备PCR反应系统，并在Bio-Rad CFX96 qPCR仪器上进行PCR反应，以检测每个样品中STK33的表达水平。反应条件列于和引物.
表一。
| 步骤 | 温度 | 时间 | 圆形 |
|---|
| 1 | 94摄氏度 | 15分钟 | 1 |
| 2 | 94摄氏度 | 10秒 | 40 |
| 50摄氏度 | 30秒 | |
| 72°C | 15秒 | |
|
| 荧光记录 |
|
| 三 | 72摄氏度 | 10分钟 | 1 |
表二：。
| 基因 | 引物序列 |
|---|
| β-肌动蛋白 | 5′-3′GTGGACATCCGCAAAGAC |
| 3′-5′GAAAGGGTGTAACGCAACTA公司 |
| STK33号机组 | 5′-3′GGGAGCCAGATAAAACG |
| 3′-5′GCTTCACCGTTAATT公司 |
Western blot分析定量分析蛋白质表达水平
组织在液氮中研磨，然后用RIPA蛋白裂解液在冰上裂解30分钟。然后将样品离心（12000×g，4°C）10分钟以收集上清液。上清液储存在1.5 ml EP管中。使用BCA法测量蛋白质浓度，将每个样品中的100µg蛋白质与加载缓冲液混合并在沸水中变性10 min，然后在40 V下进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶电泳0.5 h。然后将蛋白质转移到NC膜。在4°C下用5%脱脂牛奶封闭过夜后，将膜清洗3次（每次10分钟），并在室温下用原代兔单克隆STK33抗体（稀释度为1:500；目录号为ab206296；美国马萨诸塞州剑桥市Abcam）孵育2小时。清洗后，用次级羊抗兔（HRP）孵养膜IgG抗体（稀释度，1:2000；cat.no.ab6721；Abcam）在室温下放置1小时。然后添加荧光底物，以便在黑暗中显色。使用ImageJ软件（X版；Media Cybernetics，Silver Springs，MD，USA）量化成像结果。
免疫组织化学染色分析蛋白质的表达
严格按照试剂盒说明书进行SP免疫组化染色。染色样品中阳性细胞的测定：i）棕色颗粒；ii）颜色强度高于背景的颜色强度。观察部位：iii）细胞质，主要位于巨噬细胞和肿瘤细胞内；iv）间质管内皮细胞。观察方法：随机选择5个视野（×400）。相对表达定义：阳性细胞比例>50%，3分；阳性细胞比例25～49%，2分；阳性细胞比例1～24%，1分；阳性细胞比例<1%，0分。根据染色强度评分，深色为3分，中度为2分，浅色为1分。这两个分数的组合被用作确定表达水平的基础。得分≤3分记录为低表达水平，得分>3分记录为高表达水平和阳性表达。
预后分析
进行5年随访，记录不同病理类型患者的无复发生存率和总生存率。Kaplan-Meier生存曲线也用于显示患者的生存率。
统计分析
所有数据均使用SPSS 19.0软件进行处理（IBM，Armonk，NY，USA）。测量数据表示为平均值±SD。通过t检验和单因素方差分析比较平均值。使用χ处理计数数据2测试。p<0.05被认为具有统计学意义。
结果
STK33 mRNA在不同病理类型患者中的表达
如所示β-actin和STK33的熔融曲线呈单峰，表明引物的特异性和结果的准确性较高。如所示观察组STK33 mRNA表达水平显著高于对照组（p<0.05）。如所示STK33mRNA在肺腺癌和鳞状细胞癌中的表达水平显著低于肺小细胞癌和大细胞癌（p<0.05）。
β-actin（左）和STK33（右）PCR产物的熔化曲线。单峰表明引物的高度特异性和结果的准确性。
观察组和对照组STK33 mRNA表达水平。RT-qPCR结果显示，观察组STK33 mRNA的表达水平显著高于对照组（**p<0.01）。
STK33 mRNA在不同病理类型患者中的表达水平。RT-qPCR结果显示，肺腺癌和鳞癌中STK33 mRNA的表达水平显著低于肺小细胞癌和大细胞癌（*p<0.05）。
western blot检测STK33蛋白在不同病理类型患者中的表达
STK33蛋白在四种病理类型肺癌患者中的表达水平显著高于良性病变患者（p<0.05）。此外，STK33蛋白在肺小细胞癌和大细胞癌中的表达水平显著高于肺腺癌和鳞癌（p<0.05）().
不同病理类型肺癌和良性病变患者STK33蛋白表达水平的检测和比较。（A） western blot分析的代表性结果；（B） STK33蛋白在不同病理类型肺癌和良性病变患者中的相对表达水平。与对照组相比，腺癌组和鳞癌组STK33蛋白的表达水平显著增加（*p<0.05）。与腺癌组相比，小细胞癌组STK33蛋白的表达水平显著升高，大细胞癌组STK33蛋白的表达水平升高（**p<0.01）。
免疫组织化学染色检测STK33蛋白的表达
免疫组化染色显示，STK33在肺大细胞癌（100%）和小细胞癌（10%）中的阳性率显著高于肺腺癌（88.1%）和鳞癌（86.2%），（p<0.05）().
表三。
| 类型 | 案例 | 否定 | 积极的 | χ2 | P值 |
|---|
| 腺癌 | 42 | 5 (11.9) | 37 (88.1) | 12.653 | <0.001 |
| 鳞状细胞癌 | 29 | 4 (13.8) | 25 (86.2) | 14.823 | <0.001 |
| 大细胞癌 | 15 | 0（0） | 15 (100) | | |
| 小细胞癌 | 16 | 0（0） | 16 (100) | | |
STK33表达与肺癌患者预后的关系。根据免疫组化染色结果，阴性表达组为低表达组，阳性表达组为高表达组。5年生存率分析表明，STK33基因高表达组的无复发生存率和总生存率显著低于低表达组（p<0.05）(). 两组患者的Kaplan-Meier生存曲线如图所示.
Kaplan-Meier生存曲线显示肺癌患者的5年生存率。STK33高表达组的总生存率显著高于低表达组（p<0.01）。
表四。
STK33基因高表达组与低表达组生存率比较[n（%）]。
| 组 | 案例 | 无复发生存率 | 总生存率 |
|---|
| 低表达组 | 71 | 34 (47.9) | 50 (70.4) |
| 高表达组 | 31 | 7 (22.6) | 8 (25.8) |
| χ2 | | 13.92 | 39.841 |
| P值 | | <0.001 | <0.001 |
讨论
肺作为人体与外界气体交换的中枢，很容易受到环境的影响。与其他器官相比，肺部更容易发生病变甚至癌症。肺癌细胞容易迁移，治愈率很低。随着分子生物学的发展，癌症的诊断和治疗已经从化疗和放疗转向分子水平的个体化治疗，其中针对不同癌症不同基因的靶向小分子药物的出现是一个典型的代表(8,9). 感兴趣的肺癌相关基因包括EGFR、KRAS和BRAF，也已经开发出靶向药物来靶向这些基因(10–12). 然而，随着研究的深入和相关分子信号通路的逐步挖掘，已经发现了越来越多的肺癌相关基因，如STK33(13). STK33位于人类染色体11p15.3区域。研究表明，该区域的多个基因与多种临床疾病的发生和发展有关，这些基因的功能异常可导致肿瘤的发生(14). STK33基因编码一种新的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。由于STK33的特殊结构，它不仅可以激活蛋白酶，还可以通过影响钙的吸收来参与多种生命活动(15). STK33作为一种新发现的基因，其作用机制尚不明确，越来越受到人们的关注。
STK33可以间接与Ras基因相互作用，导致各种癌细胞的合成杀伤(16). 使用RNAi，Scholl等已经证明STK33基因和KRAS基因是影响癌细胞发生、生长和转移的两个独立且不可或缺的基因(17). 一些研究人员认为，STK33可以通过特异性磷酸化蛋白参与间充质细胞的凝集，引起细胞结构的改变，影响正常的生理功能，促进肿瘤细胞的活化和增殖(18). 相关研究还表明，STK33蛋白在结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌等肿瘤细胞中的存在与KRAS基因突变的发生密切相关(19,20). 然而，STK33在癌症尤其是肺癌发病机制中的作用机制尚不清楚。
本研究探讨了STK33基因的表达与肺癌临床病理特征的相关性，并探讨了STK 33的表达对肺癌预后的影响。结果表明，STK33基因的表达与肺癌的病理类型密切相关，不同病理类型患者的STK33蛋白表达水平存在显著差异。肺癌组STK33基因表达水平显著高于良性病变组（p<0.05）。STK33 mRNA在肺腺癌和鳞癌中的表达水平显著低于肺小细胞癌和大细胞癌（p<0.05）。Western blot分析显示，STK33蛋白在肺小细胞癌和大细胞癌中的表达水平显著高于肺腺癌和鳞癌（p<0.05）。免疫组织化学染色显示，STK33在肺大细胞癌和小细胞癌中的阳性率（100%）显著高于肺腺癌（88.1%）和鳞状细胞癌（86.2%）（p<0.05）。所有数据表明，STK33可能被用作非癌性病变的生物标记物。5年生存率分析表明，STK33基因高表达组的无复发生存率和总生存率显著低于低表达组（p<0.05），表明该基因与肺癌的程度和临床分期密切相关。
总之，STK33的差异表达水平与肺癌的病理和预后相关，对临床诊断和预后评估具有重要价值。
致谢
本研究得到了上海交通大学附属第六人民医院自然科学基金（1575）的资助。
参考文献
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