血管内皮生长因子和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3在粘液性乳腺癌和浸润性导管癌中的表达（未另行规定）及其与无病生存的关系

摘要

介绍

粘液性乳腺癌（MBC）又称胶体癌，是一种罕见的乳腺肿瘤亚型，占所有乳腺癌病例的1-7%。MBC的特征是存在细胞外粘蛋白（MUC）(1). MBC包括由浸润性导管癌等其他癌症类型组成的混合MBC和纯MBC（PMBC），在纯MBC中，整个肿块几乎被粘液癌细胞占据，没有常规浸润性导管肿瘤细胞(2). PMBC由粘液成分>90%的肿块表示(三). 与未另行指定的浸润性导管癌（IDC-NOS）相比，MBC预后更好，无病间隔更长，腋窝淋巴结转移发生率更低(1,2,4). 然而，MBC的复发和转移在临床实践中经常出现。

血管生成是肿瘤发生的先决条件；肿瘤细胞附近血管的形成与肿瘤形成、侵袭和转移的可能性密切相关。血管生成是根据两组细胞外信号诱导和发展的：可溶性血管生成因子和细胞外基质(5). 实验和临床数据表明，乳腺癌是一种血管生成依赖性肿瘤。血管内皮生长因子（VEGF）是最有效的内皮细胞有丝分裂原(6)血管内皮生长因子（VEGF）是血管通透性的调节因子，因此被认为是一种强有力的新型预后工具(7). 然而，MBC和IDC-NOS中VEGF的表达与肿瘤的形态、行为和预后之间的关系以及MBC和IDS-NOS之间的差异尚不清楚。

MBC预后良好与细胞周围MUC的形成密切相关(8). 先前的研究已经揭示了PMBC中MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5A和MUC6蛋白的表达，并且这种表达被认为是一种预后因素(9). 凝胶形成分泌型MUC，包括MUC2和MUC6，在粘液癌中表现出较高的表达率，这表明这些类型MUC的大量产生可能会阻碍癌症的扩展，导致侵袭性较小的生物学行为。然而，与胃癌和结直肠癌预后不良相关的MUC1的表达在MBC中较低(9). 艾哈迈德的研究(10)强调MBC的MUC来自细胞分解。我们假设MBC组织中可能存在显著的细胞凋亡，并产生大量粘液。早期和晚期凋亡最著名的生化特征是半胱氨酸蛋白酶激活。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸合成肽通过直接激活caspase-3诱导细胞凋亡(11). 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3也是与凋亡相关的DNA片段化和形态学变化所必需的(12). 细胞和组织中高水平的活性caspase-3是多种凋亡信号诱导凋亡的重要生物标志物(13). 因此，检测caspase-3的表达可以反映肿瘤细胞的凋亡状态，这可能有助于解释MBC和IDC-NOS之间的预后和生存差异。

在本研究中，采用免疫组织化学染色研究了MBC和IDC-NOS中VEGF和caspase-3的表达，并进一步研究了VEGF与caspase-2表达水平与临床病理特征的关系。

材料和方法

结果

研究人群的特征

共纳入54名女性MBC患者（平均年龄53.87岁；范围24-82岁）和60名IDC-NOS患者（平均年纪50.08岁；范围27-78岁）。该队列包括94.5%的病理肿瘤1-2期（pT_1-2)患者，5.6%pT_3-4MBC组的患者和16.8%的结节阳性患者，以及98.4%的pT_1-2患者，1.7%pT_3-4IDC-NOS组中有例患者和45.0%的淋巴结阳性患者。手术前两组均未发现转移。在MBC组中，92.6%的患者选择进行乳腺切除术，7.4%的患者选择保乳手术。此外，14.8%的患者接受前哨淋巴结活检，85.2%的患者接受腋窝清除。在MBC组中，22.2%的患者没有接受辅助化疗，也没有患者在手术后接受辅助放疗。两组在年龄、T分期、乳腺手术和辅助放疗方面无显著差异。与IDC-NOS相比，MBC患者ER和激素受体阳性率较高，且Ki-67表达量≤20%的人群较多。MBC患者的淋巴结转移明显较少，肿瘤淋巴结转移（TNM）分期较低(15)与IDC-NOS患者相比（分别为P=0.010和P=0.023）(表一).

血管内皮生长因子和caspase-3在MBC和IDC-NOS患者中的表达

VEGF和caspase-3的阳性染色主要见于细胞质(图1). MBC和IDC-NOS患者VEGF和caspase-3的表达存在显著差异。总的来说，42.59%的MBC患者表现出较高的VEGF评分（≥6），IDC-NOS组的这一百分比为61.67%（P=0.042）。此外，31例（57.4%）MBC患者表现出胱天蛋白酶-3的高表达（≥6），但IDC-NOS组只有20例（33.33%）表现出胱天蛋白酶-3的高表达（P=0.028）(表二).

在单独的窗口中打开

图1。

VEGF和胱天蛋白酶-3在MBC和IDC-NOS中的表达。（A）VEGF在MBC中的高表达。（B） IDC-NOS中VEGF的高表达。（C）MBC中caspase-3的高表达。（D） caspase-3在IDC-NOS标尺（50µm）中的低表达；原始放大倍数，×400。血管内皮生长因子；MBC，粘液性乳腺癌。

表二。

MBC和IDC-NOS中VEGF和caspase-3的表达。

表达式	MBC，n（%）	IDC-NOS，n（%）	P值
VEGF高	23 (42.59)	37 (61.67)	0.042一
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3高	31 (57.41)	20 (33.33)	0.010一

在单独的窗口中打开

^一MBC与IDC-NOS之间有显著性差异（P<0.05）。粘液性乳腺癌；IDC-NOS，浸润性导管癌，未另行规定；血管内皮生长因子。

MBC患者VEGF和caspase-3表达与DFS的关系

由于IDC-NOS的表达、功能和机制已经明确，本研究显示它们在MBC中的相关性。Kaplan-Meier log-rank检验表明，与MBC低表达患者相比，VEGF高表达患者的DFS时间更短（P=0.006）。然而，MBC患者中caspase-3的表达与DFS时间无关(图2).

在单独的窗口中打开

图2。

MBC患者DFS的Kaplan-Meier生存分析。（A） VEGF的高表达与MBC 5年DFS发生率低显著相关（P<0.05）。（B） 在MBC中，caspase-3的表达与DFS无显著相关性。DFS，无病生存；血管内皮生长因子；MBC，粘液性乳腺癌。

MBC患者VEGF和caspase-3表达与临床病理变量的关系

MBC患者VEGF的表达与年龄、淋巴结状态和TNM分期有显著相关性，但caspase-3的表达与患者年龄、肿瘤分期、淋巴结状况、TNM分期、雌激素受体（ER）状态、孕激素受体（PR）状态或Ki-67表达无显著相关性(表III).

表三。

血管内皮生长因子、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3和MBC中其他变量之间的相关性。

变量	血管内皮生长因子（−）	血管内皮生长因子（+）	P值	半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（−）	半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（+）	P值
年龄，年			0.013一			0.783
≤50	20	7		12	15
>50	11	16		11	16
肿瘤分期			0.220			0.658
第1页	11	12		9	14
第T2-3页	20	11		14	17
节点状态			0.002一			0.717
否定	30	15		20	25
积极的	1	8		3	6
TNM阶段			0.008一			1
I–IIa	30	16		20	26
IIb-IIIc类	1	7		3	5
呃			1			0.384
否定	3	3		4	2
积极的	28	20		19	29
公共关系			0.107			0.554
低b条	12	14		10	16
高c	19	9		13	15
Ki-67，%			0.358			0.346
≤20	22	19		16	25
>20	9	4		7	6

在单独的窗口中打开

^一MBC与IDC-NOS的差异有显著性（P<0.05）

^b条PR<20%

^cPR≥20%。粘液性乳腺癌；血管内皮生长因子；雌激素受体；PR，孕酮受体。

MBC中的Cox分析

单变量Cox回归分析显示，较高的VEGF评分、阳性淋巴结状态和较高的TNM分期是DFS恶化的显著预测因素。Caspase-3的表达对DFS没有显著的预测价值。此外，多元分析分析了DFS与VEGF表达、淋巴结状态和TNM分期之间的相关性，发现TNM分期与DFS恶化显著相关(表四). 还分析了Ki-67的表达。MBC患者Ki-67（≤20%）的表达率为75.93%，IDC-NOS患者为50%（P<0.05），提示MBC肿瘤的增殖能力可能低于IDC-NOS肿瘤。然而，Cox生存分析表明Ki-67的表达与MBC患者的DFS没有显著相关性。

表四。

MBC DFS临床病理变量（包括VEGF）的Cox单变量分析和多变量分析。

	单变量分析			多元分析
变量	人力资源	95%置信区间	P值	人力资源	95%置信区间	P值
血管内皮生长因子
高	10.640	(1.326–85.403)	0.026一	5.881	(0.632–54.741)	0.120
低
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3
高	0.473	(0.125–1.785)	0.269
低
年龄，年
≤50	1.809	(0.452–7.244)	0.402
>50
肿瘤分期
pT2/pT3	1.941	(0.479–7.863)	0.353
第1页
节点状态
积极的	5.844	(1.452–23.529)	0.013一	0.477	(0.060–3.809)	0.485
否定
TNM公司
二/三	11.689	（2.762–49.465）	0.001一	10.386	（1.230–87.703）	0.032一
我
急诊室
积极的	0.872	(0.172–4.409)	0.868
否定
公共关系
高b条	0.542	(0.135–2.618)	0.386
低c
Ki-67，%
>20	1.299	(0.262–6.454)	0.749
≤20

在单独的窗口中打开

^一MBC与IDC-NOS之间有显著性差异（P<0.05）。

^b条PR≥20%

^cPR<20%。DFS，无病生存；粘液性乳腺癌；血管内皮生长因子；雌激素受体；孕酮受体；HR、危害比；CI，置信区间。

讨论

以往的大多数MBC临床研究发现，MBC表现出较高的ER和PR阳性率、较少的淋巴结转移、较低的TNM分期以及显著较高的OS和DFS发生率(16–20). 本研究分析了MBC患者的基本信息，并与同期治疗的IDC-NOS患者进行了比较。结果与先前的研究一致，MBC患者的预后优于IDC-NOS患者。

饶等(21)用电子显微镜研究了7例MBC，发现MBC除了分泌大量的粘液物质外，还表现为没有肌上皮分化和基底膜沉积，存在显著发达的细胞质丝状系统，溶酶体相对稀少，细胞间连接明显且经常发育良好，基质血管明显缺乏。这些数据表明，MBC良好的临床预后可能是多种复杂因素的结果(21).

肿瘤生长需要持续的血管生长和重塑，因此实体肿瘤可以超过1-2毫米^三尺寸。VEGF及其受体是血管生成的关键调节器，这意味着它们是有吸引力的治疗靶点(22). 此前已经对肝细胞癌中的微血管密度和肿瘤VEGF表达进行了评估，结果表明VEGF的上调促进了血管生成、肿瘤生长和肝内转移(23). VEGF-C产生的癌细胞可诱导淋巴管增殖和扩张，导致癌细胞侵入淋巴管和淋巴结转移(24). 目前正在评估使用多种VEGF靶向抑制剂进行癌症治疗。VEGF靶向治疗已被批准用于转移性三阴性乳腺癌的临床治疗(25). MBC中基质血管的缺乏可能是血管生成的一个重要不利因素(21). 在本研究中，我们评估了MBC和IDC-NOS样本中VEGF的表达，发现MBC中的VEGF表达低于IDC-NOS。结论是，MBC中VEGF的低表达可能与肿瘤血管的缺乏有关，并导致更好的预后。在MBC患者中，高VEGF表达与原发性淋巴结转移和高TNM分期显著相关。Kaplan-Meier曲线显示，MBC患者中VEGF与DFS相关，而在Cox多变量分析模型中，只有TNM分期是独立的预后因素。

大量粘液是MBC样本的典型特征。诺里斯和泰勒(8)发现肿瘤组织中的粘液对患者的预后和整个临床过程起着重要作用。艾哈迈德(10)注意到粘液的形成是由癌细胞的分解引起的，随后是线粒体的退化，它导致肿瘤侵袭性显著降低。除坏死外，细胞凋亡也是细胞解体的主要原因。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶是一个基因家族，通过调节细胞死亡和炎症来维持体内平衡(26). Caspase-3是各种凋亡途径中的关键分子因子(27,28). 本研究检测了各组caspase-3的表达。MBC样本显示caspase-3高表达，提示caspase-3-介导的凋亡可能阻碍MBC患者的肿瘤进展。出乎意料的是，MBC患者中caspase-3的表达与DFS或其他临床病理参数无关。

Ki-67指数对乳腺癌有潜在的预后和预测价值，已成为重要的常规使用的增殖生物标记物(29). 本研究分析了Ki-67的表达，发现Ki-67（≤20%）在MBC中的表达率为75.93%，而在IDC-NOS中为50%，Cox生存分析表明Ki-67的表达与MBC患者的DFS没有直接关系。

总之，本研究表明，与IDC-NOS相比，激素受体和胱天蛋白酶-3的高表达率、VEGF和Ki-67的低表达以及早期TNM分期可能有助于改善MBC的预后。VEGF和胱天蛋白酶-3可能在粘液产生中发挥作用，这在MBC的进展中很重要。然而，VEGF和caspase-3的高表达与MBC患者的DFS无明显直接关系。未来可能需要培养粘液性乳腺癌细胞系，以探讨癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力以及粘液在肿瘤进展中的确切作用。

致谢

工具书类