AGTR1号机组启动子高甲基化在肺鳞癌中的表达但在肺腺癌中不表达

摘要

介绍

肺癌是一种由上皮细胞引起的恶性肿瘤。它是全球癌症相关死亡的主要原因(1). 2012年新增患者近180万人，导致1.59亿人死亡，其中中国占三分之一以上(2). 根据恶性细胞的大小和外观，肺癌分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌(三). 非小细胞肺癌约占肺癌的85%(4)可进一步细分为大细胞癌、肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC）。LUAD和LUSC在分子图谱、特征和治疗方法上有很多不同(5).

抑癌基因的启动子高甲基化被认为是诱导肿瘤发生的重要因素(6). 例如，SRY-box 17(SOX17标准)60.2%的原发性肺癌样本中发现甲基化SOX17标准沉默基因表达，消除肺癌细胞增殖抑制(7). 特异性基因超甲基化的鉴定可以解释非小细胞肺癌的基因组不稳定性和复杂性，并为靶向治疗或风险预测提供依据。

AGTR1号机组编码血管紧张素II（Ang II）I型受体，属于G蛋白偶联受体家族(8). Ang II是心血管系统中控制血压的主要效应器，通过Gq和Gi蛋白诱导多种信号转导途径，如Raf-1、MEK和ERK的双相激活(9). 调节醛固酮分泌，参与血管重塑、炎症和内皮功能障碍(10). 低甲基化AGTR1号机组启动子已被证实与尿酸水平呈负相关，尿酸水平可能是原发性高血压（EH）的重要风险预测因子(11). 此外，AGTR1号机组甲基化在人类癌症中已被广泛研究，如口腔鳞癌(12)，结直肠癌(13)，乳腺癌(14)，卵巢癌(15)和口腔癌(12). 例如，一些研究支持AGTR1号机组乳腺癌癌变过程中细胞生长和增殖的调控(16)，在10–20%的乳腺癌病例中被扩增和过度表达，甚至显著过度表达超过100倍(14). 此外AGTR1号机组启动子甲基化与口腔鳞状细胞癌（OSCC）的发展有关(12). AGTR1在粪便DNA中也得到验证，具有较高的检测灵敏度，可用于结直肠癌的无创诊断(13). 此外，DNA甲基化微阵列数据集显示AGTR1号机组可能是非小细胞肺癌诊断的有效生物标志物(17).

自从检测到AGTR1号机组不同病理亚型和阶段的甲基化尚未进行，我们使用LUSC和LUAD样本来研究AGTR1号机组本研究中甲基化对疾病风险的影响。

材料和方法

患者

2010年8月至2013年10月，从南通大学附属吴江医院（中国江苏）收集了111例患者的肿瘤组织和配对的相邻非肿瘤组织。共有73名男性和38名女性患者，平均年龄63.59±10.19岁（范围为33–82岁），其中42名LUSC患者和69名LUAD患者。临床病理数据和亚型来自患者的病历和病理档案。根据第三版美国胸科医师学会（ACCP）肺癌指南（LC III）对临床分期进行分类(18). 本研究方案经南通大学吴江附属医院伦理委员会批准。所有患者都签署了书面知情同意书。

DNA提取和亚硫酸氢盐转化

使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒（德国希尔顿Qiagen公司）从福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）癌症样品中分离DNA。使用NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA）测量DNA浓度。然后使用EZ DNA甲基化-Gold Kit™（美国加利福尼亚州欧文市Zymo Research Corporation）转化DNA。

定量甲基化特异PCR

采用SYBR绿色定量甲基化特异性PCR（qMSP）检测甲基化水平。PCR在最终体积为20µl的溶液中进行，其中含有5µl SYBR混合物，4µl H₂O、 0.5微升引物和0.5微升修饰DNA。对每个样品进行一式三份的PCR扩增，并在Light Cycler 480系统（Roche Applied Science，Mannheim，Germany）上在以下条件下进行反应：在95°C下变性10分钟，然后在95°C下20秒、58°C下20秒和72°C下30秒的45个循环。熔化曲线系统如下：95°C下15秒，58°C下1分钟，95°C连续，然后将温度降至40°C持续4分钟(ACTB公司)通过扩增非CpG序列作为内部参考。循环阈值（Ct值）为的结果ACTB公司>40例被定义为检测失败。M.SssI公司催化靶胞嘧啶脱氨基生成尿嘧啶，生成仅在CpG甲基化状态上不同的DNA(19). 制备甲基化DNA作为阳性内对照。每组扩增包括阳性对照、阴性对照和非模板对照。

目标基因和内部参考基因的引物序列总结如下表一，以及AGTR1号机组基因显示在图1A使用Qsep100 DNA分析仪（中国台湾Bioptic公司）对部分PCR产物进行分析，以验证甲基化状态，最终通过Q分析仪软件导出可见峰(图1B). 此外，一些产品是使用Applied Bio系统随机测序的^®3730 DNA分析仪（Applied Biosystems，Warrington，UK），用于确认亚硫酸氢盐的完全转化(图1B).

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图1。

AGTR1号机组以及测序和电泳结果的验证。（A） AGTR1在染色体上的定位及靶基因的引物序列。（B） 测序验证结果的顶行表示原始基因序列，第二行显示转换后的基因序列。电泳实验揭示了甲基化样品、阳性内对照和阴性对照的结果。

表一。

定量甲基化特异性聚合酶链反应的引物序列。

基因	正向引物（5′-3′）	反向底漆（5′-3′）	产品（bp）	温度（°C）
AGTR1号机组	GGAGGAGGGGAATGA公司	CCTATCCACTCGCTACT公司	142	58
ACTB公司	TGGTGATGGAGGAGGTTAGTAAGT公司	AACCAAAACCTACTCCCTTAA公司	133	58

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统计分析

对于每个样品，使用比较Ct（ΔΔCt）方法来确定相对甲基化值。甲基化参考物（PMR）的百分比通过使用以下公式显示（替换此处的实际甲基化值）：[（基因/AGTR1号机组)样本/（基因/AGTR1号机组)阳性]×100%。PMR中位数（97.4）被设定为临界值，并将甲基化定义为高甲基化（阳性）和低甲基化（阴性）亚组。使用SPSS 18.0版本（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）进行统计分析。采用wilcoxon符号秩检验确定肿瘤组织和非肿瘤组织甲基化指数的差异。χ²test用于评估启动子甲基化与临床参数之间的相关性。通过Kaplan-Meier生存曲线计算与甲基化状态相关的总生存率，并通过log-rank检验评估生存差异。P<0.05表示有统计学意义。

结果

测序的PCR产物显示，所有非CpG胞嘧啶都转化为胸腺嘧啶，而CG二核苷酸的胞嘧啶保持不变(图1). 毛细管电泳实验结果表明，产物的长度是正确的。

结果显示，在AGTR1号机组肿瘤组织和邻近非肿瘤组织之间的甲基化（PMR:97.4 vs.85，P=0.024）。亚组分析表明，有一种显著诱导的高甲基化AGTR1号机组在LUSC肿瘤中（P=0.008），但在LUAD肿瘤中没有（P=0.449，图2).

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图2。

甲基化水平的比较AGTR1号机组在肿瘤组织和配对的相邻非肿瘤组织之间。

还对启动子甲基化状态患者的临床病理特征进行了进一步的相关性分析(表二). 有更高的AGTR1号机组LUSC患者的启动子甲基化水平高于LUAD患者（比值比=2.483，95%CI=1.125-5.480，P=0.023）。此外，AGTR1号机组启动子甲基化与非小细胞肺癌的性别、年龄、吸烟史、临床分期和病变部位无关(表二).

先前的研究表明AGTR1号机组是无进展生存期（PFS）和晚期/转移性乳腺癌反应的预测因子(20). 然而AGTR1号机组甲基化与癌症总体生存率的关系尚不清楚。在这项研究中，我们根据AGTR1号机组PMR值，LUSC和LUAD患者之间无显著差异（P=0.293，图3).

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图3。

个体总生存率的Kaplan-Meier曲线。

为了进一步揭示基因表达和甲基化状态之间的相关性AGTR1号机组在LUSC和LUAD中，MEXPRESS系统(21) (http://mexpress.be网站)已使用。378例LUSC和477例LUAD患者的癌症基因组图谱（TCGA）数据(21)表明癌组织中表达较低，支持基因表达与AGTR1号机组甲基化。

讨论

非小细胞肺癌对人类健康是一个巨大的威胁，甲基化及其与非小细胞肝癌关系的研究是一个日益受到关注的领域。AGTR1号机组作为肾素-血管紧张素系统（RAS）的一种新成分，影响血压和心脏肥大(15)，通过靶向肾素-血管紧张素系统（RAS）AGTR1号机组阻滞剂与耐药乳腺癌治疗中的耐药现象有关。现在AGTR1阻滞剂已应用于临床肿瘤学，如用于乳腺癌的氯沙坦(22)和坎地沙坦治疗前列腺癌(23). 现在出现的证据表明AGTR1号机组调节肿瘤发展过程中的细胞增殖，促进肿瘤侵袭、迁移、转移和血管生成(24). 考虑到非小细胞肺癌的不良治疗状况，检测诸如AGTR1号机组是非常必要和紧迫的。

在本研究中AGTR1号机组使用定量甲基化特异性PCR对111对肿瘤样本和邻近非肿瘤组织进行评估。我们发现了以下方面的显著差异AGTR1号机组肿瘤组织和邻近非肿瘤组织之间的甲基化，这一观察结果提示CpG岛甲基化表型AGTR1号机组可能是非小细胞肺癌发展的早期事件。此外，AGTR1号机组在LUSC中高甲基化，但在LUAD中没有，并且在AGTR1号机组LUAD和LUSC患者之间的启动子甲基化，表明该表观遗传生物标记物在LUSC诊断中的潜在用途。此外，我们发现AGTR1号机组启动子甲基化与非小细胞肺癌的性别、年龄、吸烟史、临床分期和病变部位无关。对TCGA数据的研究表明，基因表达与AGTR1号机组甲基化。

我们的发现AGTR1号机组启动子甲基化作为非小细胞肺癌的诊断标志物与中国汉族非小细胞肝癌回顾性队列高通量DNA甲基化微阵列数据集的研究一致，该研究表明甲基化与非小细胞癌之间存在显著相关性(17). 这也与TCGA对LUSC和LUAD患者的结果一致，表明AGTR1号机组可能与非小细胞肺癌风险增加有关。

我们的结果表明，在AGTR1LUAD和LUSC患者之间的启动子甲基化，并且存在显著诱导的高甲基化AGTR1号机组与正常组织相比，在LUSC肿瘤中，但在LUAD中没有。先前的研究表明，差异甲基化基因是独特癌症中的特殊差异甲基化，DNA甲基化相关网络是基于甲基化相关性建立的，例如7个生物标记物(PCDHB15、IGF1、PRRT1、CYGB、WBSCR17、ACTG2和中国石油天然气集团公司)可以将乳腺癌分为高危组和低危组。同样，八种生物标记物的甲基化状态不同(ZBTB32、GPSM1、SALL1、OR51B4、MAGEA8、SALL3、CCL8和TMEFF2型)结肠癌显示出不同的风险水平(25). 所以甲基化了AGTR1号机组可能被鉴定为LUSC的特异性驱动基因，其可能与癌症类型特异性途径有关，并有望用于解释这两种NSCLC类型之间的部分异质性。

非小细胞肺癌被认为是一种复杂的疾病，一些临床病理特征与癌症有关，如吸烟史，这是肺癌的主要危险因素(26)吸烟与几个基因的启动子DNA超甲基化之间的关联已经被证明，例如转录因子21(TCF21型)以及小RNA Let-7a-3(27). 此前对中国原发性肺癌病例的研究（N=40022）表明，男性患肺癌的可能性是女性的1.5倍(28)但由于最近不同性别吸烟模式的改变，女性肺癌的发病率呈指数级上升。此外，女性肺癌的诊断年龄低于男性，这表明患者存在不同的性别和年龄易感性(29). 值得注意的是，临床分期是非小细胞肺癌的重要预后因素。晚期疾病对生存率有负面影响(30). 此外，尽管表面上是对称的，但先前的研究表明右侧肺癌的发病率较高(31)就像乳腺癌一样，左侧乳腺癌的发病率比右侧乳腺癌高约5%(32). 从甲基化和表达谱推断，发生在身体不同部位的乳腺癌具有不同的癌症特征(31)这一结果有助于为其他双边癌症（如肺癌）提供原理证明。在我们的研究中，AGTR1号机组启动子甲基化可能与性别、年龄、吸烟史、临床分期和肿瘤位置无关。但考虑到我们的实验设计中存在的限制因素，需要进一步验证以确保结果。

在本研究中，我们纳入了包含111名患者的相对较大的队列，并收集了宝贵的手术组织，以便于应用于不同癌症亚型的通用方法进行调查。然而，这里存在一些限制。首先，由于时间有限，我们的研究没有包括大细胞癌，研究设计可能过于简单，无法揭示非小细胞肺癌的复杂特征。其次，由于样本数量有限，我们没有检测到不同甲基化物的表达AGTR1号机组并被TCGA的数据库分析所取代，该分析显示甲基化与AGTR1然而，之前的一项研究表明甲基化程度与mRNA丰度之间没有相关性AGTR1号机组妊娠早期羊膜和胎盘(33)因此需要进一步研究。第三AGTR1号机组甲基化对LUSC的影响在很大程度上尚不明确。第四，我们只检测了部分内容区，可能需要更多的CpG位点来实现基因功能，此外，研究NSCLC进展还需要额外的表观遗传改变，例如与基因甲基化密切相关的组蛋白修饰。此外，只有AGTR1号机组本研究对基因进行了研究，未来还需要进一步探索其他相关基因。

总之，我们发现AGTR1号机组甲基化和LUSC为LUSC的检测、诊断和风险预测提供了潜在的生物标志物。

致谢

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