雌激素受体与miR-30a和miR-30a-功能的相关性⁻，公关⁻、AR⁺MDA-MB-453乳腺癌细胞

蛋白质印迹分析

48 h后，用RIPA裂解缓冲液裂解经DHT或载体处理的炭样裂解MDA-MB-453细胞。采集蛋白质，在10%SDS变性聚丙烯酰胺凝胶上进行分解，并转移到硝化纤维素膜上。膜在4°C下与抗AR或抗GAPDH抗体（赛尔生物技术，中国天津）在Blotto中培养过夜，然后用辣根过氧化物酶（HRP）结合二级抗体（赛尔生物技术）清洗和培养。利用增强化学发光评估蛋白质表达。波段强度由Lab Works™图像采集和分析软件（UVP）确定。

MicroRNA微阵列分析

KangChen Bio-tech，Inc.（中国上海）使用从经DHT或单独载体处理的MDA-MB-453细胞中提取的总RNA进行了microRNA微阵列实验。根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen，CA，USA）进行萃取。使用NanoDrop ND-1000评估RNA的数量和质量。变性琼脂糖凝胶电泳用于评估RNA完整性和DNA污染。

根据制造商的说明，使用miRCURY™Array Power Labeling试剂盒（目录号208032-A；Exiqon，Vedbaek，Denmark）用Cy3或Cy5荧光染料标记总RNA。每个miRCURY LNA微RNA阵列（v.11.0；Exiqon）由847个成熟人类微RNA捕获探针组成，与单个Cy3-或Cy5-标记样品杂交。使用DHT或载药处理细胞的独立样本，将每组与三个miRCURY LNA阵列杂交三次。使用GenePix Pro 6.0软件（Axon Instruments，Union City，CA，USA）通过Gene Pix 4000B扫描仪扫描图像。减去背景并进行归一化。我们选择了表达强度（ForeGround-BackGround）>50且表达水平在DHT和载体处理细胞之间差异至少1.5倍的microRNA。

预测的AR靶向microRNA

预测靶向AR的microRNA的计算机辅助算法来自miRanda（2010年8月发布，网址：http://www.microrna.org)和TargetScan（5.2版，http://www.targetscan.org).

实时反转录PCR

如前所述，进行干环RT-PCR以确定成熟miR-30a的水平(22). 简而言之，使用M-MLV逆转录酶（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加公司）和BGI公司合成的以下引物将2µg小RNA逆转录到cDNA：miR-30a-RT，5′-GTCGTTATCAGGCAGGCACTGGACCTTCCAG-3′；miR-30b-RT，5′-GTCGTACGAGTGCAGGGTCGGTGCACTGGACAGCTGAGG-3′；miR-30c-RT，5′-GTCGTACGAGTGCAGGGTCGAGGCACTGGACGCTGAGAG−3′；和U6-RT，5′-GTCGATCAGGCAGGGTCGAGGTATTCGCAGGACACACAAAATAAC-3′，可折叠成干环结构。使用BGI公司合成的以下引物扩增了特异性miR-30a、b、c cDNA片段和内源性对照（U6 snRNA）：miR-30a-Fwd，5′-TGCGGTAAACATCCTACTG-3′；miR-30b-Fwd，5′-TGCGTGTAAACATCCTACTACTCA-3′；miR-30c-Fwd，5′-TGCGGTAAACATCCTACCTCTC-3′；U6-Fwd，5′-TGCGGTGCTCTCGGCAGC-3′；反向，5′-CAGTGCAGGTCCGAGGT-3′，通用下游引物。PCR反应加热到94°C 4分钟，然后进行40次94°C循环30秒，50°C循环30s，72°C循环40s。SYBR Premix Ex Taq™试剂盒（日本大津Takara Bio公司）按照制造商的指示使用，并在7300实时PCR系统上进行实时PCR（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统生命技术公司）。

为了实时RT-PCR检测AR转录的相对水平，使用带有5µg大RNA的M-MLV逆转录酶（Promega）生成cDNA。PCR扩增AR基因，并将β-actin基因作为内源性对照，使用以下引物：AR sense，5′-AAGACGTCTTACCACCA-3′；AR反义，5′-TCCAGAGAAGGATCTGGGCACTT-3′；β-肌动蛋白感觉，5′-CGTGACATAAGGAGAGCTG-3′；β-肌动蛋白反义，5′-CTAGAGAGCATTGCGGTGGAC-3′。将PCR反应加热至94°C 5 min，然后40个循环94°C 1 min，56°C 1分钟，72°C 1 min.。实时PCR后，AR基因的表达归一化为同一样本中β-actin基因的表达。

向量构造

通过从基因组DNA中扩增携带pri-miR-30a的487 bp DNA片段，并将其插入到位于BamHI和EcoRI位点的pcDNA3.1（+）载体中，构建了pcDNA3.1/pri-miR-30-a表达载体。PCR引物为miR-30a-sense、5′-CGCGATCCGAAACACTTTGGGGATTAC-3′和miR-30a反义、5′-CCGGAATTCAACTGCAGAGAGACA-3′。

通过从pEGFP-N2（Clontech）中扩增EGFP编码区，并将其插入HindIII和BamHI位点的pcDNA3.1（+）中，构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告载体（pcDNA3/EGFP/AR）。然后将含有预测miR-30a结合位点的AR 3′UTR片段插入到BamHI和XhoI位点的pcDNA3.1（+）/EGFP中。PCR引物为EGFP阳性，5′-GCAGCAAGCTTGCCACCATGTAGCAAGGGC-3′；EGFP反义，5′-CGCGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCC-3′；AR意义，5′-CGCGGATCCTTAAATCTGATGATCCTC−3′；和AR反义，5′-GAGGCCTCGAGGTGTGTGGCTGCACAGAG-3′。通过将突变的AR 3′UTR片段插入pcDNA3.1（+）/EGFP的相同位点，构建了突变增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告载体（pcDNA3/EGFP/AR-mut）。用以下引物对突变体AR 3′UTR的片段进行退火。顶部引物：5-GATCCTTAAATCTGTGATGATCCTTCATATGCCCAGTCAAGTTGCTCTATTCTGCACTACTCTGCCAGCCACACAAAC-3′底部引物：5′-TCGAGTTGTGTGGCTGGCACAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCATATGCCATATGCAGTACATCACAGATTTAAAG-3′。

转染

使用脂质体内酰胺2000（Invitrogen）将载体（0.5 mg/l）或反义寡核苷酸（ASO；最终浓度10）转染MDA-MB-453细胞⁻⁹M） 根据制造商的说明制备电镀和转染复合物后24小时。转染后4小时更换转染培养基。IDT（Coralville，IA，USA）合成了与miR-30a互补的寡核苷酸：miR-30a-ASO，5′-CTTTCCAGTGAGGATGTTACA-3′和对照ASO，5'-TGACTGTACTGAGACTGA-3′。

EGFP报告子分析

为了证实miR-30a对AR的直接作用，将野生型和突变型AR实验组进一步分为三个亚组：第一组，瞬时转染pcDNA3/EGFP/AR细胞；第2组，pcDNA3/EGFP/AR和pcDNA3.1（+）瞬时共转染细胞（对照载体）；第3组，细胞瞬时联合转染pcDNA3/EGFP/AR和pri-miR-30a。负载控制为RFP表达载体pDsRed2-N1。转染后48小时，使用放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液（150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH Q2 7.2、1%Triton X-100和0.1%SDS）对细胞进行裂解。使用荧光分光光度计（F4500；日本东京日立）测量EGFP和RFP的强度。

染色体免疫沉淀分析法

染色质免疫沉淀（ChIP）用于确定活化AR是否直接上调MDA-MB-453细胞中miR-30a的表达，如前所述(23). 简单地说，通过超声波从收获的细胞中提取染色质DNA，并与正常兔血清（IgG）和蛋白A/G-Sepharose珠孵育。兔抗AR抗体（PG-21，Upstate）用于免疫沉淀。使用以下引物扩增−2843/−2623和−1513/−1286片段：−2843/−2623为5′-CTTAGATTTCTTGCCTTTAG（正向）和5′-CTCAATAACCTTCTCCTCCTC（反向），−1513/−1286为5′-GTAGGACCTGTCACTTTG（正向）和5′-CTGAGTCAATCCACCAAAC（反向）。

细胞增殖试验

将MDA-MB-453细胞以六个重复的方式接种在96周的微量滴定板（7000个细胞/孔）中。接种后20小时，用载体或ASO转染细胞。采用3-（4,5二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）比色法测定细胞活力和增殖。在连续七天的时间里，向微孔中添加MTT，并在4小时后添加二甲基亚砜（DMSO），以溶解生成的甲霜结晶。将平板摇晃20分钟，并使用µQuant通用微孔板分光光度计（Bio-Tek Instruments，Winooski，USA）在570 nm处检测吸光度。

流式细胞术

用载体或ASO转染48小时后，用胰蛋白酶从平板上分离MDA-MB-453细胞，用PBS冲洗，并用70%（v/v）乙醇固定。在FACSCalibur系统（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）进行分析之前，将细胞在PBS中重新水化，并用核糖核酸酶（100µg/ml）和碘化丙啶（60µg/ml；Sigma-Aldrich，MO，USA。细胞周期阶段由cell Quest分析确定。增殖指数（PI）计算为（S+G2/M）/G1，其中S、G2/M和G1分别是指S期、G2/M期和G1期细胞的百分比(24).

AR可能是miR-30a、b、c的靶点

在预测靶向AR的microRNA中，miR-30a、b、c被鉴定出来，因为AR mRNA的3′UTR含有miR-30b、c的假定结合位点(图1C). 在ER中⁻，公关⁻、AR⁺实时RT-PCR证实了异位miR-30a、b、c表达的有效性，显示DHT处理的MDA-MB-453细胞比载体处理组减少了5倍、2.5倍和2倍(图1D). 我们专注于miR-30a，并研究了miR-30a与AR之间的关系。

MiR-30a在mRNA和蛋白质水平上调节AR

与对照组相比，转染miR-30a ASO的MDA-MB-453细胞中AR表达在mRNA和蛋白水平上均升高(图2A). 用表达miR-30a的pcDNA3.1（+）/30a载体或对照载体（pcDNA3.1+）转染MDA-MB-453细胞48小时后，通过实时RT-PCR和Western blot检测AR mRNA和蛋白水平。miR-30a的过度表达降低了AR在mRNA和蛋白水平的表达(图2B).

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图2。

AR是miR-30a的直接靶基因。用载体或ASO转染48小时后，miR-30a和AR表达的（A和B）RT-PCR和Western blot。（C） EGFP报告子分析证实miR-30a对AR mRNA的直接调节。数据是来自三个独立实验的归一化荧光强度的平均值±标准差**与对照组相比，P<0.01，***P<0.001。

miR-30a对AR 3′UTR的直接影响

miR-30a与野生型或突变体AR 3′UTR的比对如图所示图1C使用包含野生型AR 3′UTR上游EGFP基因的载体，在miR-30a过度表达的情况下，EGFP荧光显著降低。然而，miR-30a的过度表达并不影响突变型AR 3′UTR的荧光强度(图2C). 因此，miR-30a直接通过UTR调节野生型AR的表达。

激活的AR不能加载miR-30a的启动子

我们假设，加载到miR-30a位点5′DNA区域的雄激素诱导AR激活信号可能是一种转录因子。当分析长度高达4.0kb的miR-30a基因时，在其5′区发现一个典型的TATA盒。使用PROMO 3.0程序，在miR-30a的5′区鉴定出6个潜在ARE，表明5′区存在启动子。在这些are中，ARE2和ARE6最有可能被激活的AR装载。为了确定AR装载量，使用两对引物进行ChIP，以扩增对应于ARE2的−2843/−2623片段和对应于ARE6的−1513/−1286片段。用10⁻⁸M DHT并未导致ARE2或ARE6的AR负荷增加。综上所述，结果表明雄激素-AR信号并不直接介导MDA-MB-453细胞中miR-30a的调节。