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Oncol Lett公司。2017年10月；14(4): 4965–4970.
2017年8月18日在线发布。 数字对象标识：10.3892/ol.2017.6771
预防性维修识别码：PMC5649517
PMID：29085508

雷公藤内酯醇诱导DNA断裂，激活caspase-3依赖性凋亡，并使B细胞淋巴瘤对聚ADP-核糖聚合酶1和磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂敏感

关嘉伟,1,* 钱照,1,* 吕健（Jian Lv）,1 张志伟,1 孙世杰,2和毛伟峰1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

雷公藤内酯醇是从雷公藤据报道，其可抑制核苷酸切除修复，并具有抗炎和抗肿瘤活性。然而，雷公藤甲素在DNA断裂中的作用尚不清楚。本研究研究了雷公藤内酯醇在小鼠B细胞淋巴瘤细胞系CH12F3中诱导DNA断裂和细胞凋亡的作用。MTT分析显示X射线修复交叉互补蛋白1（XRCC1）−/−CH12F3细胞对6 nM雷公藤甲素的敏感性高于野生型CH12F4细胞，这表明低水平雷公藤乙素诱导DNA断裂的方式依赖于XRCC1介导的修复途径。流式细胞术分析表明，50 nM雷公藤内酯醇增加了磷酸氢istone H2AX水平，表明雷公藤醇可诱导双链断裂。Western blot分析显示雷公藤甲素上调Rad51和核增殖细胞核抗原。Annexin V/碘化丙啶染色证实雷公藤甲素促进细胞凋亡，western blot分析证实雷公藤甲素激活caspase-3依赖性细胞凋亡。本研究的结果还表明，5nM雷公藤甲素对CH12F3淋巴瘤细胞致敏多聚ADP-核糖聚合酶1和磷酸肌醇3-激酶抑制剂，表明雷公藤乙素可能是一种有效的抗肿瘤药物，可使淋巴瘤细胞对化疗药物致敏。

关键词：雷公藤甲素、双链断裂、凋亡、聚ADP-核糖聚合酶1、磷脂酰肌醇3-激酶

引言

雷公藤内酯醇是一种从雷公藤(1)已知具有免疫抑制和抗炎活性(2–7). 许多研究已经证实雷公藤甲素也具有抗肿瘤活性，抑制癌细胞的增殖和迁移(8–12). 以前的一项研究表明，雷公藤甲素在核苷酸切除修复（NER）中抑制基础转录因子转录因子II H（TFIIH）和RNA聚合酶II介导的转录的ATP酶活性(13). 雷公藤内酯醇还干扰其他转录因子，包括p53、核因子-κB和热休克因子蛋白1(6,14). 考虑到雷公藤甲素通过干扰肿瘤相关因子的转录而发挥的重要作用，雷公藤甲素被证明是一种有效的抗肿瘤药物。然而，雷公藤内酯醇在DNA损伤修复中作用的潜在分子机制尚不明确。

DNA修复蛋白X射线修复交叉互补蛋白1（XRCC1）作为一种支架蛋白，在碱基切除修复（BER）和单链断裂修复（SSB）中发挥着关键作用，在修复途径中招募了许多DNA修复相关因子，包括连接酶III、聚ADP-核糖聚合酶1（PARP1）、，无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1、增殖细胞核抗原（PCNA）和DNA聚合酶-β(15–17). 连接酶IV用于连接非同源末端连接（NHEJ）修复中的双链断裂（DSB）(18). Rad51在同源重组（HR）中发挥着重要作用，在HR中，Rad51灯丝寻找DNA复制的同源序列(19). PCNA是一种DNA滑动钳，在DNA复制中起作用(20). 本研究使用XRCC1−/−和连接酶IV−/−CH12F3细胞分析雷公藤甲素诱导的DNA断裂，同时检测雷公藤乙素治疗后细胞Rad51和核PCNA水平，以研究雷公藤甲素在细胞DNA修复中的作用。

PARP是一类将单（ADP-核糖）或多（ADP--核糖）基团转移到目标蛋白质上的蛋白质(21). 由于DNA修复因子的PARylation对DNA断裂的募集是必需的，因此PARPs对DNA修复至关重要(22–25). PARP1在DNA修复中的功能有助于癌细胞对基因毒剂的反应而存活，因此PARP1是癌症治疗的一个很有前景的治疗靶点，尤其是对于乳腺癌1缺陷癌细胞。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路是多种癌症中经常激活的关键信号通路，许多PI3K靶向化合物被用于临床治疗(26–28). 本研究探讨雷公藤甲素与PARP1抑制剂和PI3K抑制剂的联合应用，以分析雷公藤乙素在淋巴瘤治疗中的潜在应用。本研究有助于了解雷公藤甲素在DNA损伤和凋亡中的作用，以及在临床治疗中与化疗药物联合治疗淋巴瘤患者中的作用。

材料和方法

抗体和试剂

雷公藤内酯醇、PARP抑制剂、PI3K抑制剂、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂购自Selleck Chemicals（中国上海）。抗Rad51（目录号14961-1-AP）和抗H3（目录号17168-1-AP）抗体购自ProteinTech Group，Inc.（美国伊利诺伊州芝加哥）。RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素购自Hyclone（GE Healthcare Life Sciences，Logan，UT，USA）。二甲基亚砜（DMSO）和β-巯基乙醇（BME）购自Sigma-Aldrich；默克公司（德国达姆施塔特）。MTT购自天根（中国北京）。细胞细胞质和核蛋白提取试剂盒购自Sangon Biotech Co.，Ltd.（中国上海）。抗磷烯酮H2AX（γH2AX；Ser139)购自CST生物试剂有限公司（中国上海；目录号2577）。caspase-3（目录号19677-1-AP）、caspase-9（目录号10380-1-AP）和PCNA（目录号10205-1-AP）的抗体、PARP1（目录号13371-1-AP）以及β-肌动蛋白的抗体，用作参考基因（目录号60008-1），购自武汉三鹰生物科技有限公司（中国武汉），所有这些抗体均以1:300的稀释度用于western blot分析。山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二级抗体与Alexa Fluor-488（目录号A-11034）结合，购自Thermo Fisher Scientific Inc.（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。HRP结合的山羊抗兔和抗鼠IgG二级抗体（目录号分别为SA00001-2和SA00001-1）购自武汉三鹰生物科技有限公司（中国武汉）。

细胞培养

小鼠B细胞淋巴瘤细胞系CH12F3来自T.Honjo教授（日本京都京都大学）。连接酶IV−/−和XRCC1−/−CH12F3细胞取自于Kefei Yu博士（密歇根州立大学，密歇根州东兰辛，美国）。所有细胞均在添加10%FBS、100 U/ml青霉素、100 ng/ml链霉素和50 nM BME的RPMI-1640培养基中培养，并在37°C和5%CO下培养2.

蛋白质印迹分析

6孔板镀有1×106细胞，并用不同浓度的雷公藤内酯醇处理24小时。根据制造商的协议，使用细胞质和核蛋白提取试剂盒提取细胞全蛋白或核蛋白。使用Qubit 2.0荧光仪（Thermo Fisher Scientific，Inc.）测定蛋白质浓度。使用SDS-PAGE将每个样品中总共50µg的蛋白质在10或15%的凝胶中在120 V下分离2 h，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在室温下用5%脱脂奶粉（在20号三缓冲盐中稀释）封闭PVDF膜1小时，然后与上述主要抗体（1:300稀释）在4°C孵育过夜。将HRP偶联的山羊抗兔和抗小鼠IgG二级抗体以适当的稀释度（1:2000）在室温下用于对抗一级抗体（稀释度，1:300）1小时。最后，使用增强化学发光底物（Thermo Fisher Scientific，Inc.）检测蛋白质。组蛋白3（H3）作为对照。

流式细胞术分析

收集前用雷公藤内酯醇（0、10、20、30、40和50 nM）处理CH12F3细胞4 h，并在37°C下添加0.5 ml 4%甲醛10 min。通过离心（1000×g，3 min，室温）收集细胞，缓慢添加冰镇100%甲醇，直到最终达到90%甲醇的浓度。细胞在冰上培养30分钟。总计0.5×106每个样品的细胞用2ml洗涤缓冲液洗涤，包括1X PBS和0.5%牛血清白蛋白（Sangon Biotech Co.Ltd.）。将细胞悬浮在100µl抗γH2AX兔抗体中（在1X PBS中1:200稀释），并在室温下培养1 h。细胞在2 ml洗涤缓冲液中洗涤。细胞在100µl山羊抗兔IgG二级抗体Alexa Fluor 488中悬浮30分钟，然后用上述洗涤缓冲液重复洗涤。最后，将细胞悬浮在0.5 ml PBS中进行流式细胞术（FCM），并使用BD CellQuest 5.1软件（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）分析结果。

细胞活力测定

将总共5000个细胞置于96 well板中，并在37°C下的雷公藤内酯醇（10、20、30、40和50 nM）中培养24小时。培养后，以0.5 mg/ml的最终浓度将MTT添加到每个孔中。在室温下通过离心（1000×g，3分钟）收集细胞之前，在37℃下培养4小时。向每个孔中添加总共200µl二甲基亚砜，并在37°C下培养板15分钟。最后，使用微孔板光度计（Thermo Fisher Scientific，Inc.）在589 nm处检测吸光度值。

细胞凋亡测定

流式细胞仪检测细胞凋亡。使用膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）对用5 nM雷公藤甲素处理12 h并在室温下培养15 min的细胞进行染色。使用FCM对凋亡细胞进行量化，并使用BD CellQuest 5.1软件（BD Biosciences）对结果进行分析。

统计分析

使用SPSS软件（6.0版；SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）进行统计分析。进行Student t检验以比较各组之间的差异。P<0.05被认为是统计学上的显著差异，P<0.01被认为是高度显著的。

结果

雷公藤内酯醇抑制CH12F3细胞活性

用MTT法分析雷公藤甲素对CH12F3细胞活性的影响，结果表明雷公藤乙素抑制CH12F4细胞增殖。在用0至50 nM剂量的雷公藤内酯醇处理24小时后，细胞活力在30 nM时几乎被完全抑制(图1A). 为了评估雷公藤甲素对DNA损伤的影响，连接酶IV的活性−/−和XRCC1−/−对CH12F3细胞进行分析。MTT分析结果表明，6 nM雷公藤甲素抑制XRCC1−/−存活率达到40%；然而，连接酶IV的活性−/−与XRCC1相比，对照组CH12F3细胞增加−/−相同剂量雷公藤甲素的细胞(图1B). 由于XRCC1对BER SSB通路至关重要，连接酶IV对NHEJ DSB修复至关重要，这些结果表明雷公藤内酯醇诱导DNA损伤，主要依赖于XRCC1介导的修复。

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雷公藤内酯醇抑制CH12F3细胞增殖。（A） 用指示浓度的雷公藤内酯醇处理CH12F3细胞24小时，并使用MTT分析。（B） XRCC1公司−/−，连接酶IV−/−用指示浓度的雷公藤内酯醇处理野生型CH12F3细胞24小时，并用MTT分析细胞活力。结果显示为三个独立实验的平均值±标准偏差**与CH12F3细胞相比，P<0.01和***P<0.001。XRCC1，X射线修复交叉互补蛋白1。

雷公藤内酯醇诱导DNA断裂并调节Rad51和PCNA水平

本研究研究了雷公藤甲素暴露后CH12F3细胞的DNA损伤。用雷公藤内酯醇（0、10、20、30、40和50 nM）处理CH12F3细胞4 h，并提取核蛋白。用western blotting检测γH2AX(图2A). 雷公藤甲素治疗后，核γH2AX的表达呈剂量依赖性上调，这表明高剂量雷公藤乙素诱导DSB(29,30). 为了证实这一结果，使用FCM检测γH2AX水平，这表明雷公藤甲素增加了γH2AX的水平(图2B和C). 这些结果进一步表明，高剂量雷公藤甲素会导致细胞DSB。

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雷公藤甲素诱导DNA损伤。用指定浓度的雷公藤内酯醇处理细胞4小时。（A）γH2AX的表达通过western blot分析检测。（B） 用流式细胞术检测γH2AX的表达。（C） FCM结果的量化。结果显示为三个独立实验的平均值±标准偏差**与相应对照组相比，P<0.01。（D） 用指定浓度的雷公藤内酯醇处理细胞4小时。使用western blot分析检测Rad51水平。（E） 用指定浓度的雷公藤甲素处理细胞4小时。提取核蛋白，并使用蛋白质印迹分析检测细胞核PCNA水平。对照组为H3。流式细胞术；增殖细胞核抗原；H3，组蛋白3；γH2AX，磷烯H2AX。

为了说明细胞对雷公藤甲素的反应，在雷公藤乙素处理的细胞中检测了Rad51和核PCNA的表达。雷公藤甲素（0、10、20、30、40和50 nM）治疗4小时后，Rad51水平增加(图2D)雷公藤内酯醇显著上调细胞核PCNA(图2E). PCNA是一种DNA滑动夹，在DNA复制中起作用。这些结果表明，PCNA在DNA复制中的作用对于雷公藤甲素引起的DNA损伤的修复非常重要。

雷公藤内酯醇诱导caspase-3依赖性细胞凋亡

分析雷公藤甲素对细胞凋亡的影响。用10 nM雷公藤内酯醇处理CH12F3细胞12 h。通过annexin V/PI染色分析凋亡细胞。雷公藤内酯醇在早期（膜联蛋白V阳性和PI-阴性）和晚期（膜联毒素V阳性和PI阳性）引起细胞凋亡(图3A和B). 通过分析凋亡蛋白的表达，揭示了细胞凋亡的潜在分子机制。用雷公藤内酯醇在1、2、4和5nM下处理细胞12 h。提取整个细胞裂解液进行western blot分析。裂解的胱天蛋白酶-3、裂解的胱天蛋白酶-9和裂解的PARP1以剂量依赖的方式上调(图3C). 这些结果表明雷公藤甲素诱导caspase-3依赖性细胞凋亡。

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雷公藤内酯醇诱导caspase-3依赖性细胞凋亡。（A） 用10 nM雷公藤内酯醇处理细胞12 h。用流式细胞术结合annexin V和PI染色分析细胞凋亡。（B） 对早期和晚期凋亡率进行量化。结果显示为三个独立实验的平均值±SD*与对照组相比，P<0.05和**P<0.01。（C） 雷公藤内酯醇处理12 h后，提取细胞总蛋白，通过western blot分析检测凋亡蛋白caspase-3、caspase-9和PARP1。PI，碘化丙啶；PARP1，聚ADP-核糖聚合酶1。

雷公藤内酯醇使CH12F3细胞对PARP1和PI3K抑制剂敏感

在上述结果表明雷公藤内酯醇可诱导CH12F3细胞DNA损伤和凋亡后，分析了CH12F4细胞对雷公藤甲素联合PARP1和PI3K抑制剂的敏感性。当雷公藤甲素剂量为5 nM时，细胞存活率>80%；然而，这种剂量的雷公藤内酯醇显著提高了CH12F3细胞对PARP1（ME0328）和PI3K抑制剂的敏感性(图4A和B). 这些结果表明雷公藤甲素使淋巴瘤对PARP1和PI3K抑制剂敏感，这支持雷公藤乙素作为一种抗肿瘤药物用于使淋巴瘤细胞对基因毒性药物敏感。

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雷公藤内酯醇使细胞对聚ADP-核糖聚合酶1抑制剂（ME0328）和磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂（BKM120）敏感。（A） 用5 nM雷公藤内酯醇和指示浓度的ME0328处理细胞24 h，并用MTT法检测细胞活力。（B） 用5 nM雷公藤内酯醇和指示浓度的BKM120处理细胞24小时，并用MTT法检测细胞活力。结果显示为三个独立实验的平均值±标准偏差**与对照组相比，P＜0.01和***P＜0.001。

讨论

雷公藤内酯醇以前曾被报道在不同类型的肿瘤中抑制癌细胞生长并诱导凋亡(1–三). 然而，其大多数抗肿瘤活性在高浓度下观察到，在高浓度时出现不良反应(31). 本研究研究了低剂量雷公藤内酯醇对DNA断裂和细胞凋亡的影响，以及与化疗药物联合治疗B淋巴瘤细胞的影响。本研究结果表明雷公藤甲素抑制CH12F3细胞活性，低剂量雷公藤乙素（6 nM）抑制XRCC1−/−CH12F3细胞，表明雷公藤甲素依赖于XRCC1介导的修复途径诱导DNA断裂。此外，经不同剂量雷公藤甲素处理的CH12F3细胞中γH2AX的表达表明，雷公藤乙素以剂量依赖性方式诱导DSB。本研究还证实雷公藤甲素诱导caspase-3依赖性细胞凋亡。

先前的研究表明雷公藤甲素特异性结合TFIIH基础转录因子，并通过其抑制NER(13). 这一结果表明雷公藤甲素具有DNA损伤效应；然而，雷公藤甲素在DNA损伤修复中的潜在分子机制尚不明确。本研究表明低剂量雷公藤甲素抑制XRCC1−/−CH12F3细胞，但不是连接酶IV−/−CH12F3细胞或野生型CH12F3。XRCC1是一种支架蛋白，它招募参与BER和SSB修复的DNA修复相关因子。因此，本研究结果表明雷公藤内酯醇可诱导基底损伤或SSB。通过分析雷公藤内酯醇处理的细胞中Rad51和PCNA的表达，本研究结果显示雷公藤醇处理后PCNA表达增加了8倍。Rad51在HR中起作用，PCNA是一种在DNA复制中起作用的滑动夹。这一结果表明雷公藤内酯醇可以高度调节PCNA的转录，以响应DNA断裂。本研究分析了雷公藤内酯醇诱导CH12F3细胞凋亡，并确定低剂量雷公藤醇诱导caspase-3依赖性凋亡。考虑到低剂量雷公藤甲素诱导DNA断裂，可以得出结论，雷公藤乙素诱导的DNA损伤触发caspase-3依赖性凋亡。

PARP1抑制剂是治疗癌细胞，特别是HR缺乏癌细胞的有希望的临床治疗剂。PI3K信号的激活有助于癌细胞增殖，因此PI3K抑制剂被临床用于治疗PI3K异常信号的肿瘤。本研究结果表明，低剂量雷公藤甲素可诱导DNA断裂和凋亡，分析了低剂量雷公藤甲素联合PARP1和PI3K抑制剂治疗淋巴瘤细胞的应用。本研究表明，5 nM雷公藤甲素可以有效地使CH12F3细胞对PARP1和PI3K抑制剂敏感。因此，雷公藤甲素可能是一种有效的抗肿瘤药物，可以使淋巴瘤细胞对化疗药物敏感。雷公藤内酯醇在调节细胞DNA修复和使肿瘤细胞对抗肿瘤基因毒剂敏感方面的潜在分子机制尚需进一步研究。

致谢

本研究得到了中国国家科学基金会（批准号：81201563和31371254）的支持。

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