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Oncol Lett公司。2017年10月；14(4): 3989–3996.
2017年7月27日在线发布。 数字对象标识：2017.6683年1月10.3892日
预防性维修识别码：PMC5607651
PMID：28959362

抑制Hes1增强胃癌球形细胞对拉帕替尼的敏感性

李露春,1 阎丽,1 王露露（Lulu Wang）,1 吴志娟,1 马惠文,1 邵江河,1 李大荣,1 余慧卿,1 围棋年,2和王东林1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

人们认为神经源性位点notch同源蛋白（notch）信号通路在细胞分化、增殖和凋亡中起着重要作用。然而，Notch信号通路在胃癌干细胞（GCSCs）和表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）敏感性中的作用尚不清楚。本研究旨在阐明Notch1信号通路在GCSCs和拉帕替尼敏感性中的作用。从人胃癌MKN45亲代细胞中分离出球形细胞。球形细胞表现出CSC的特征，与亲代细胞相比，Notch1的表达更高。为了研究Notch1信号通路在GCSCs中的作用，使用针对Hes1的小干扰RNA敲除转录因子Hes1（Hes1）的表达。据观察，Hes1的表达在击倒细胞中显著下调。Hes1的抑制抑制了CSC的特性，如转录因子性别决定区Y-box 2、上皮细胞粘附分子和同源盒蛋白Nanog的表达显著降低，球状集落形成减少。此外，Hes1基因敲除后，球形细胞的上皮-间充质转化显著受损。此外，Hes1的抑制有效地增强了拉帕替尼在球体形成细胞中的敏感性。这些结果表明，球形胃癌细胞具有CSC的特征，Notch1信号通路在维持CSC和拉帕替尼敏感性中起着重要作用。

关键词：神经源性位点notch同源蛋白1、胃癌、癌干细胞、上皮间质转化、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂

介绍

表皮生长因子受体（EGFR）和人EGFR2（HER2）在各种类型的癌症中经常上调或突变，在癌细胞增殖、存活、迁移和分化中发挥重要作用(1,2). EGFR在肺癌、脑癌、结肠癌、胰腺癌和乳腺癌中经常发生突变或过度表达(三–6). 此外，HER2在乳腺癌、胃癌、食管癌、胰腺癌和卵巢癌中经常过度表达(7,8). EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），包括吉非替尼和厄洛替尼，在癌症治疗中单独使用或与放射或化疗联合使用(9). EGFR-TKI拉帕替尼和单克隆抗体曲妥珠单抗已被批准用于治疗HER2过度表达的乳腺癌(10). 拉帕替尼是一种有效的三磷酸腺苷（ATP）竞争性双激酶抑制剂，可抑制EGFR和HER2，并已证明对人类HER2扩增的乳腺癌细胞系具有抗增殖活性(11). 魏因贝格等(12)据报道，拉帕替尼选择性抑制HER2扩增的人胃癌细胞的增殖。然而，拉帕替尼目前对胃癌患者的治疗效果并不理想(13). 先前的一项临床试验表明，HER2靶向治疗与癌细胞的耐药性有关(14). 然而，尚不清楚这种耐药机制是否与胃癌干细胞（GCSCs）有关。

CSC假说被引入以解释多种癌症类型的发病机制。CSC具有自我更新和无限增殖的能力，这可能会启动肿瘤形成并导致肿瘤复发。CSC与大部分肿瘤细胞群的区别在于，当将少量CSC植入实验动物体内时，它们能够成功地植入新的肿瘤(15). 此外，CSC比其相应的分化癌细胞对化疗和放疗更具抵抗力(16–18). 神经源性位点notch同源蛋白（notch）信号通路在决定各种器官系统中的细胞命运中起着重要作用(19). Notch途径包括四种类型的受体（Notch1、−2、−3和−4）和五种膜蛋白配体，包括Delta样配体（DLL1、−1和−3）和Serrate/Jagged（JAG1和−2）。Notch1信号通路对维持CSCs的特征至关重要，并与各种类型CSCs（包括乳腺和胰腺CSCs）的自我更新相关(20). Hes1是Notch1通路的下游靶基因(21). Hes1可能在维持肿瘤干细胞自我更新和上皮-间充质转化（EMT）过程中发挥重要作用(22).

在本研究中，研究了Notch1信号通路在GCSCs和拉帕替尼敏感性中的作用。此外，目前的研究旨在阐明GCSC对拉帕替尼耐药的分子机制。

材料和方法

球形细胞的培养

MKN45细胞购自中国科学院（上海）型培养标本馆，以2×10的密度接种4100 mm超低连接板中的细胞/ml（Costar；美国纽约州科宁市科宁公司）。细胞生长在无血清RPMI-1640和营养混合物F-12培养基（均为Hyclone；GE Healthcare Life Sciences，Logan，UT，USA）中，并辅以B27（1:50；Hyclone；GE Hearthcare生命科学）、20 ng/ml EGF、20 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（均为R&D Systems，Minneapolis，MN，USA，5µg/ml牛胰岛素（Cell Applications，Inc.，San Diego，CA，USA）、0.5µg/ml氢化可的松（Sigma-Aldrich；Merck KGaA，Darmstadt，Germany）和青霉素/链霉素（Hyclone；GE Healthcare Life Sciences）。MKN45细胞在上述37°C、5%CO的球形培养基中培养3天2在第4天用0.05%胰蛋白酶/EDTA（Sigma-Aldrich；Merck KGaA）孵育分离。分离的MKN45细胞在上述37°C、5%CO的球形条件下培养2再在大气中放置3天，然后收获。

致瘤性试验

从中国科学院上海实验动物中心（中国上海）获得40只4周龄雌性裸鼠（体重18–20 g）。给小鼠喂食SPF级饲料和纯净水，并将其保存在笼子中（5只小鼠/笼），房间温度恒定（22±1°C），暗/光循环12小时。对于体内实验中，将球形细胞和亲代细胞重新悬浮在PBS（Hyclone；GE Healthcare Life Sciences）中，并将其注射到小鼠的四肢皮下。本研究中使用的方案得到了重庆癌症研究所伦理委员会（中国重庆）的批准。各组小鼠接种5×10的球形或亲代细胞2, 5×10三, 5×104或5×105（5只小鼠/组）。接种第二周后每2天监测肿瘤生长。

慢病毒转染

通过用Hes1小干扰RNA慢病毒（中国上海基因制药有限公司）感染细胞，实现了对转录因子Hes1（Hes1）的抑制。使用GenePharma慢病毒转导试剂盒（上海基因制药有限公司）进行转导。Hes1 siRNA的靶序列为5′-AGATCAATGCCATGACTA-3′。细胞在20–30%汇合处的六孔板中培养，并在37°C和5%CO下培养12小时2然后用Hes1-siRNA-或加扰控制siRNA-表达慢病毒（5×10）感染细胞8TU/ml，40µl，上海基因制药有限公司）。感染后，用含有适当病毒滴度（1 ml/孔）的上清液替换培养基。在37°C下培养12小时后，用新鲜培养基替换病毒上清液。在孵育48小时后，使用2 mg/ml嘌呤霉素（美国德克萨斯州达拉斯圣克鲁斯生物技术公司）筛选受感染的细胞。通过使用倒置荧光显微镜（Leica DMI4000 B；Leica Microsystems GmbH，Wetzlar，Germany）表达绿色荧光蛋白，确认成功感染。使用蛋白质印迹法测定击倒效率，如下所述。

球形集落形成试验

将细胞接种到超低附着48-well板（Costar；Corning Incorporated）的每个孔（20个细胞/孔）中，并补充300µl含有40 ng/ml bFGF和20 ng/ml EGF的RPMI-1640。在37°C和5%CO孵育4周后2，对球体菌落/孔的总数进行计数。

细胞化学敏感性检查

培养基中培养的细胞在37°C和5%CO下培养2并用6mM 5-氟尿嘧啶（5-Fu）或5µmol/l拉帕替尼（均为Sigma-Aldrich；Merck KGaA）处理。暴露48 h后，再添加20 ml 0.5 mg/ml MTT溶液（Sigma-Aldrich；Merck KGaA）4 h，然后添加100 ml二甲基亚砜（Sigma Aldrich，Merck KGaA）15 min。低速搅拌平板5 min，使用分光光度计在570 nm波长下测量吸光度。针对每种情况对五口井进行了化验。

蛋白质印迹

根据制造商的方案，使用放射免疫沉淀分析裂解缓冲液（Beyotime生物技术研究所，中国上海）从细胞中提取免疫印迹总蛋白样品。在使用BCA蛋白质分析对蛋白质提取物进行量化后，使用10%SDS-PAGE对等量的蛋白质（40µg/lane）进行解析，然后转移到聚偏氟乙烯膜上（均为贝尤泰姆生物技术研究所）。随后用TBS-Tween-20（Beyotime生物技术研究所）中5%的非脂肪乳在4°C下封闭膜1小时。接下来，将印迹与适当的一级抗体在4℃培养12 h，然后与相应的辣根过氧化物酶（HRP）结合的二级抗体在37℃培养2 h。使用增强化学发光试剂（EMD Millipore，Billerica，MA，USA）检测信号。结果通过Quantity One软件（4.6.2版，Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA）进行分析。

针对GAPDH（目录编号560005）和锌指蛋白SNAI1（蜗牛，目录编号550589）的抗体购自BD Biosciences（美国新泽西州富兰克林湖）。针对上皮细胞粘附分子（EpCAM，目录号ab71916）、同源异型盒蛋白Nanog（Nanog，目录号ab109250）、转录因子性别决定区域Y-box 2（Sox2，目录编号ab92494）、多药耐药蛋白1（MDR1，目录号码ab170904）、，ATP-结合盒G亚家族成员ABCG1（分类号ab52617）、ABCG2（分类号ab24115）、DNA修复蛋白RAD51同源物1（RAD51，分类号ab88572）、紧密连接蛋白ZO-1（ZO1，分类号ab59720）、N-钙粘蛋白（分类号ab76057）、E-钙粘蛋白。山羊抗兔IgG单克隆抗体和山羊抗鼠HRP结合抗体（cat.no.sc-2354）购自Santa Cruz Biotechnology Inc。

使用以下抗体稀释液：Anti-Notch1，1:1200；抗-Hes1，1:10000；抗E-钙粘蛋白，1:1200；抗N-钙粘蛋白，1:1200；抗波形蛋白，1:1200；防蜗牛，1:500；抗ZO1，1:500；反EpCAM，1:1500；抗纳米，1:1500；抗Sox2，1:1500；抗MDR1，1:1000；抗ABCG1，1:1000；抗ABCG2，1:1000；抗RAD51，1:500；抗GAPDH，1:500；和HRP-结合IgG抗体，1:7000。

逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

使用RNAiso（Takara Bio，Inc.，Otsu，Japan）从细胞中提取RNA，然后根据制造商的协议，使用PrimeScript II First Strand cDNA合成试剂盒（Takara-Bio，Inc.）合成互补DNA（cDNA）。使用CFX96™实时PCR检测系统（Bio-Rad Laboratories，Inc.）和SYBR进行PCR（每个qPCR使用100 ng cDNA）®Premix Ex Taq™II（塔卡拉生物公司）。PCR条件如下：95°C 30秒，然后是40个95°C循环5秒和60°C循环30秒。数据根据β-肌动蛋白信使RNA（mRNA）进行标准化。PCR引物序列如下：Notch1正向，5′-TGCCGAAACCAATAACCCCTC-3′和反向，5′-TGGTAGCTCATCTGGGACA-3′；Hes1正向，5′-GTGCATGAACGAGGTGACC-3′和反向，5′-GTATTAACCCCTCGCACGT-3′；β-肌动蛋白正向，5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3′和反向，5′-GTGATCTCTCTGCATCCTT-3′。qPCR根据2进行-ΔΔCq方法(23).

组织学检查

在室温下将肿瘤组织固定在10%中性缓冲福尔马林中24小时，包埋在石蜡中，然后在室温下用苏木精和曙红（均为贝尤蒂姆生物技术研究所）对切片（5 um）染色10分钟和5秒。使用倒置显微镜检查组织学差异。

统计分析

所有实验重复三次，并使用SPSS 16.0软件（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）对结果进行分析。数据表示为平均值±标准偏差。使用Student t检验（双尾）评估各组间差异的统计显著性。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。

结果

从胃癌MKN45细胞中分离的球形细胞具有CSC的特征

肿瘤含有少量具有自我更新和致瘤能力的CSC(24). 为了分离球形细胞，MKN45细胞在超低附着板和球形培养基中培养7天。随后，使用western blotting测定CSC标记的表达水平，包括EpCAM、Nanog和Sox2。与之前的研究一致，这些CSC标记在球形细胞中的蛋白表达水平显著高于亲代细胞(图1A). 此外，在球形集落形成试验中，与亲代细胞相比，球形形成细胞形成的球形明显更多(图1B).

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从MKN45细胞分离的成球细胞和亲代细胞的CSC标记物表达、成球能力和化疗敏感性。（A） CSC标记物，包括EpCAM、Nanog和Sox2，使用相对于GAPDH的蛋白质印迹进行评估。这些CSC标记在球形细胞中的蛋白表达水平显著高于亲代细胞。（B） 球形形成细胞形成的球状体明显多于亲本细胞。（C） 球状细胞对5-Fu的耐药性明显高于亲代细胞，这是由MTT法测定的细胞活性水平所表明的。数据表示为平均值±标准偏差（n=5）*P<0.05。肿瘤干细胞；上皮细胞粘附分子；Nanog，同源盒蛋白Nanog；Sox2，性别决定区Y-box 2；5-氟尿嘧啶。

在致瘤性试验中，裸鼠注射5×102-5×105球形或亲本细胞。移植5×102, 5×10三或5×104在所有小鼠中，亲代细胞始终未能形成肿瘤，而5×105亲代细胞导致1/5小鼠肿瘤形成(表一). 相比之下，移植5×102球形细胞导致2/5小鼠肿瘤形成，而5×10小鼠移植三, 5×104或5×105球形细胞导致所有小鼠肿瘤形成(表一). 随后，研究了球形细胞和亲代细胞对5-Fu的化疗敏感性，5-Fu通常用于胃癌的治疗。用MTT细胞活力测定法测定，球体形成细胞对5-Fu的化学抗性明显高于亲代细胞(图1C; P<0.05）。这些数据表明，球形细胞具有致瘤性和CSC特征。

表一。

球形细胞和亲代细胞在裸鼠体内的致瘤性一.

注射的细胞数量
肿瘤标记物的存在5×1025×10三5×1045×105
CD44细胞+2/54/55/55/5
CD44细胞负极0/50/50/51/5
一分别分离球形细胞和亲代细胞，并将其注射到裸鼠皮下。注射后8周观察肿瘤形成。每个实验重复五次。结果显示了患肿瘤的小鼠数量。CD，分化簇。

Notch1信号通路在球体形成的MKN45细胞中被激活

为了研究Notch1信号通路在CSC中的作用，分析了Notch1和Hes1在球形细胞和亲代细胞中的表达。结果表明，与亲代细胞相比，球形细胞中Notch1和Hes1 mRNA和蛋白的表达水平显著升高(图2). 这些数据表明Notch1信号通路在球形细胞中被激活。

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Notch1信号通路在球形细胞中被激活。球形细胞中Notch1和Hes1的mRNA和蛋白表达水平显著高于亲代细胞。mRNA和蛋白表达水平分别根据β-肌动蛋白和GAPDH标准化。数据表示为平均值±标准偏差（n=5）*P<0.05。Notch1，神经源性位点notch同源蛋白1；Hes1，转录因子Hes1；mRNA，信使RNA。

球形MKN45细胞对EGFR-TKI拉帕替尼耐药

接下来评估球形细胞和亲代细胞对拉帕替尼的敏感性。MTT分析结果表明，球形细胞的存活率较亲本细胞显著提高（P<0.05；图3). 因此，这表明球形细胞比亲代细胞对拉帕替尼更具耐药性。

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使用MTT细胞活性测定法测定，球形细胞对拉帕替尼的耐药性明显高于亲代细胞。数据表示为平均值±标准偏差（n=5）*P<0.05。

Hes1表达的抑制减弱了球形成细胞中CSCs的特征和对拉帕替尼的耐药性

为了检测Notch1信号通路在GCSC中的作用，用含有Hes1-siRNA的慢病毒或打乱的对照siRNA感染球状细胞。用western blot分析测定Hes1的蛋白表达水平。与对照siRNA处理和未处理细胞相比，感染含有Hes1-siRNA的慢病毒的球形细胞显著降低Hes1蛋白表达水平，而对照siRNA组与未处理对照组相比无显著影响(图4A). 同时，与对照siRNA组相比，Hes1 siRNA慢病毒感染的球体形成细胞中CSC标记物EpCAM、Nanog和Sox2的蛋白表达水平显著下调(图4B).

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抑制Hes1表达可减弱球形细胞中CSC的特性和对拉帕替尼的耐药性。（A） 与对照组和未治疗组相比，感染含Hes1-siRNA慢病毒的球形细胞中Hes1蛋白表达水平显著下调。（B） 与对照组相比，Hes1-siRNA慢病毒感染的球形细胞中CSC标记物EpCAM、Nanog和Sox2的蛋白表达水平显著降低。（C） 感染Hes1-siRNA慢病毒的球形形成细胞形成的球体明显少于对照siRNA慢病毒感染的细胞。Hes1-siRNA慢病毒感染的球形细胞对（D）5-Fu和（E）lapatinib的化疗敏感性与对照siRNA慢病毒的感染细胞相比显著增加。蛋白质表达水平标准化为GAPDH。数据表示为平均值±标准偏差（n=5）*P<0.05。Notch1，神经源性位点notch同源蛋白1；Hes1，转录因子Hes1；上皮细胞粘附分子；Nanog，同源盒蛋白Nanog；Sox2，性别决定区Y-box 2；小干扰RNA；CSC，癌症干细胞；5-氟尿嘧啶。

在球形集落形成试验中，与对照siRNA慢病毒感染细胞相比，感染Hes1-siRNA慢病毒的球形细胞形成的球形明显更少(图4C). 此外，MTT分析结果显示，Hes1-siRNA慢病毒感染细胞对化疗药物5-Fu的敏感性与对照组相比显著增加(图4D).

为了研究Notch1信号通路对球形细胞对EGFR-TKIs敏感性的影响，评估Hes1-siRNA慢病毒感染的球形细胞对拉帕替尼的敏感性。MTT分析数据表明，Hes1-siRNA慢病毒感染的球形细胞的存活率与对照siRNA慢病毒的感染细胞相比显著降低（P<0.05；图4E). 这些数据表明，Hes1表达的抑制减弱了CSC的特征，并增加了球形细胞对拉帕替尼的敏感性。

抑制Hes1可预防EMT并降低球形MKN45细胞中化疗耐药相关蛋白的表达

为了进一步研究Notch1信号通路对球形细胞敏感性的分子机制，我们检测了EMT标记和耐药相关蛋白的表达。Western blot分析表明上皮标记物E-cadherin和ZO1的表达水平显著上调，而间充质标记物N-cadherin、，与对照组相比，Hes1-siRNA慢病毒感染的球形细胞中的波形蛋白和蜗牛显著下调(图5A). 此外，Hes1-siRNA慢病毒感染的球形细胞中，耐药相关蛋白MDR1、ABCG1、ABCG2和RAD51的表达水平显著降低(图5B). 总之，这些结果表明，抑制Hes1可以削弱EMT，并降低球形MKN45细胞中耐药相关蛋白的表达。

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Hes1-siRNA慢病毒感染导致球形MKN45细胞中EMT受损，化疗耐药相关蛋白表达降低。（A） 与对照组相比，感染Hes1-siRNA慢病毒的球形细胞中的EMT受损，表现为EMT相关蛋白蜗牛、N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达水平显著降低，E-钙粘素和ZO1的表达水平增加。（B） 与对照组相比，Hes1-siRNA慢病毒感染的球形细胞中，耐药相关蛋白MDR1、ABCG1、ABCG2和RAD51的表达水平显著下调。蛋白质表达水平标准化为GAPDH。数据表示为平均值±标准偏差（n=5）*P<0.05。Notch1，神经源性位点notch同源蛋白1；Hes1，转录因子Hes1；小干扰RNA；蜗牛锌指蛋白SNAI1；MDR1，多药耐药蛋白1；ATP结合盒G亚家族成员；RAD51，DNA修复蛋白RAD51同源物1；紧密连接蛋白ZO-1；EMT，上皮-间充质转化。

讨论

CSC假说表明，癌症是由寿命不确定的干细胞亚群维持的，这增加了以CSC为靶点可能提供癌症治疗方法的可能性(25). 将细胞在非粘附条件下培养在无血清培养基中，并辅以bFGF和EGF的球状形成试验是鉴定单个实体肿瘤组织样本或癌细胞培养物中干细胞的实用方法(26,27). 在本研究中，通过在规定的无血清培养基中培养人胃癌细胞株MKN45，培养出球形细胞。与亲代细胞相比，球形细胞能够产生更多的球形体。这一现象表明，球形细胞能够自我更新和增殖，这是CSC的重要特征(25). 耐化学性是CSC的另一个重要特征(18). 为了评估自我更新的球形细胞是否具有假定的CSC化疗耐药特性，检查了球形细胞对化疗药物的敏感性。通过细胞活性测定，球形细胞对5-Fu的抗性明显高于其亲代细胞。异种移植通常被认为是评价肿瘤细胞致瘤性的金标准。在致瘤性试验中，向裸鼠注射球形或亲代细胞。只有500个球体形成细胞能够在小鼠体内产生肿瘤。此外，与亲代细胞相比，球形细胞在较短的时间内生成体积较大的皮下肿瘤。为了进一步研究球形细胞的CSC特性，研究了CSC标记Sox2、Nanog和EpCAM的表达。Western blot分析表明，球形细胞中Sox2、Nanog和EpCAM的表达水平显著高于亲代细胞。总之，来自人类胃癌细胞系MKN45的球形细胞具有GCSC特性，这与以前的研究一致(28).

Notch信号通路在胚胎和出生后发育的细胞过程中起着重要作用，包括干细胞更新、细胞命运决定和凋亡(15). 然而，Notch信号通路的失调也有助于肿瘤的发生(29). Notch配体与其受体的相互作用促进Notch受体的γ-分泌酶依赖性裂解并释放Notch胞内结构域，从而激活信号通路并诱导靶基因，包括Hes1(30). Notch1信号通路在CSC维持中的作用已在临床前模型和临床研究中描述(31,32). 使用增益和损失功能方法，CSC的维持被归因于通过Hes1的Notch信号调节，该信号调节决定细胞命运(33). 在本研究中，球形细胞中Notch1及其下游靶点Hes1的表达显著高于亲代细胞。

据我们所知，Notch1信号通路在GCSCs拉帕替尼耐药中的作用之前还没有研究过。因此，在本研究中，评估了球形细胞和亲代细胞对拉帕替尼的敏感性，结果表明球形细胞对拉帕替尼的耐药性明显高于亲代细胞。为了研究影响拉帕替尼耐药中Notch1信号通路的潜在分子机制，通过Hes1-siRNA慢病毒转染抑制Hes1的表达。Hes1表达下调后，与相应的对照siRNA组相比，球形细胞的CSC特性显著受损，CSC标记的表达水平显著下调。

EGFR家族蛋白的激活受配体结合调节，HER2除外，HER2独立于配体结合而二聚化(34,35). 一旦发生二聚反应，细胞内酪氨酸激酶被完全激活，并诱导其酪氨酸残基的自磷酸化。这些磷酸化酪氨酸作为几种衔接蛋白的对接位点，包括生长因子受体结合蛋白2和SHC衔接蛋白，它们通过蛋白质相互作用和翻译后修饰进一步转导信号通路(36). 长期以来，在遗传学研究中观察到EGFR/HER2和Notch信号通路之间的交叉调节(37). 例如，Notch1信号通路的激活与表达突变EGFR的PC9细胞中的EGFR-TKI抵抗相关(38). 在本研究中，选择了MKN45细胞，因为HER2在这些细胞中高度激活(39). 研究表明，Hes1的抑制显著增加了球体形成细胞对拉帕替尼的敏感性。

为了进一步研究Notch1信号通路在拉帕替尼耐药中的作用，检测了EMT和耐药相关蛋白表达水平。在EMT期间，上皮细胞失去了一些上皮特性，包括E-cadherin和ZO1的表达，并获得了间充质细胞典型的特性，包括波形蛋白的表达(40). 在本研究中，Hes1的抑制降低了Snail的表达，并损害了球体形成细胞中的EMT。此外，众所周知，CSC可以通过上调药物外排转运体基因和各种多药耐药基因的表达来有效增加耐药性(41). 从癌细胞球形培养物中分离出的CSC先前被证明具有ABCB1基因的高表达，并被鉴定对各种化疗药物具有显著的耐药性(42). 在本研究中，Hes1抑制后，耐药相关蛋白MDR1、ABCG1、ABCG2和RAD51的表达水平显著下调。这些结果表明，通过抑制Hes1抑制Notch1信号通路可以防止CSCs逃避HER2靶向治疗，并可能增加GCSCs对EGFR-TKIs的敏感性。

本研究结果支持了从人胃癌细胞中分离出的球形细胞具有CSC特性的观点。此外，还证明了Notch1信号通路在GCSCs中的作用。此外，通过siRNA敲除抑制Hes1可以显著损害GCSCs的干细胞，并增加GCSCs对EGFR-TKIs的敏感性。未来，使用EGFR/HER2和Notch信号通路抑制剂的联合策略可能成为胃癌患者的治疗选择。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（批准号81172387）和国家自然科学重庆基金（批准编号C2011BB5119）的支持。

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