百日咳单抗联合曲妥珠单抗联合多西紫杉醇治疗HER2阳性乳腺癌异种移植模型的作用模式

摘要

引言

人类表皮生长因子受体2（HER2，ErbB2/neu）是ErbB/HER家族蛋白的一员，在大约20%的人类乳腺癌中过度表达，与疾病的侵袭性和不良预后呈正相关(1–4). 因此，HER2靶向治疗被认为是治疗HER2过度表达乳腺癌的一种非常合理的策略。曲妥珠单抗是第一种人源化抗HER2单克隆抗体，与HER2胞外结构域（ECD）的结构域IV结合，并抑制配体依赖性HER2/HER3信号传导和HER2脱落(5,6). 曲妥珠单抗还能够通过其Fc区与免疫细胞（如自然杀伤细胞）的Fcγ受体结合，从而触发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）(7,8). 曲妥珠单抗已被批准用于治疗早期和转移性HER2过表达乳腺癌。尽管曲妥珠单抗提高了晚期HER2过度表达癌症患者的生存率(9,10)，大多数患者最终会经历渐进性疾病。因此，对于HER2过度表达的晚期癌症，需要包括曲妥珠单抗在内的新治疗方法。

Pertuzumab是一种人源化抗HER2单克隆抗体，可与HER2（结构域II）的独特表位结合(11). 由于HER2结构域II是与其他HER家族受体二聚化和信号传导所必需的区域，百日咳可抑制配体诱导的二聚化及其下游信号传导(11,12). 在之前的临床前研究中，我们发现佩图单抗和曲妥珠单抗与HER2结合而不相互竞争(13)我们和其他人已经报道，与单药治疗相比，佩图单抗联合曲妥珠单抗具有更强的抗肿瘤活性(13,14). 在一项针对HER2阳性转移性乳腺癌患者的III期临床试验（CLEOPATRA研究）中，研究表明，与曲妥珠单抗加多西他赛的组合相比，帕妥珠单抗加曲妥珠单抗加多西他赛的三药组合显著提高了无进展生存率和总生存率(15,16). 基于这一结果，佩图单抗首次被批准用于HER2阳性转移性乳腺癌联合曲妥珠单抗和化疗。

如今，佩图单抗+曲妥珠单抗+多西紫杉醇的三药联合疗法正在成为HER2阳性转移性乳腺癌的一线治疗方法。因此，进一步思考这种混合物如何损伤肿瘤细胞并改变肿瘤微环境具有巨大的临床意义。使用小鼠异种移植模型进行临床前研究是研究这些问题的简单而有效的方法。本研究的目的是通过使用人类乳腺癌异种移植小鼠模型，从癌细胞死亡和宿主免疫细胞反应方面评估三种药物组合的抗肿瘤作用。

材料和方法

结果

佩图单抗联合曲妥珠单抗联合多西紫杉醇三药联合治疗模型的建立

为了研究佩图单抗联合曲妥珠单抗联合多西紫杉醇治疗肿瘤的内部变化，我们首先利用HER2阳性的人乳腺癌细胞系KPL-4建立了小鼠异种移植模型，在该模型中，治疗可以显示出足够的疗效。在该模型中，多西他赛（10 mg/kg）、佩图单抗（20 mg/kg）或曲妥珠单抗（10 mg/kg。然而，与佩图单抗+多西他赛或曲妥珠单抗+多西他赛相比，佩图单单抗+曲妥珠抗体+多西紫杉醇的三药物组合显示出显著更强的抗肿瘤活性(图1A). 在开始治疗21天后，六分之五的小鼠接受了三种药物的联合治疗，肿瘤完全消退，而两种药物联合治疗组均未治愈。无瘤小鼠的TV、TGI%和发病率总结于表一我们还检查了作为另一种三药物组合的佩图单抗、曲妥珠单抗和紫杉醇的疗效。与佩图单抗联合紫杉醇或曲妥珠单抗联合紫杉醇相比，该组合还显示出显著增强的抗肿瘤活性(图1B).

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图1。

体内三种药物组合的疗效。（A） 荷KPL-4肿瘤小鼠随机分为8组(n个=6个/组），并使用曲妥珠单抗、佩图单抗、多西他赛、曲妥珠单抗+多西他赛尔、曲妥珠单抗+佩图单单抗、珀图单抗+多西他赛尔或曲妥珠联抗+多塞他赛尔+佩图单抗进行治疗。作为对照，给予人IgG和多西他赛载体。（B） 荷KPL-4肿瘤小鼠随机分为8组(n个=6个/组），并用曲妥珠单抗、佩图单抗、紫杉醇、曲妥珠单抗+紫杉醇，曲妥珠双抗+佩图单单抗、珀图单抗+紫杉醇，或曲妥珠抗体+紫杉素+佩图单抗治疗。作为对照，给予人IgG和紫杉醇载体。数据点为肿瘤体积的平均值+标准偏差（mm^三). 统计上的显著差异如下所示^#P<0.05和*P<0.025。TRAS，曲妥珠单抗；PER，百日咳；DTX，多西紫杉醇；PTX、紫杉醇。

表一。

KPL-4 HER2阳性乳腺癌异种移植模型的抗肿瘤活性。

	肿瘤体积（mm三)
治疗	第1天	第22天	第22天TGI%	第22天无肿瘤小鼠
控制	196±24	560±206	−	0/6
曲妥珠单抗	202±42	606±168	−11	0/6
帕妥珠单抗	197±30	574±262	−3	0/6
多西紫杉醇	201±38	389±76	48	0/6
曲妥珠单抗+多西他赛	196±28	133±102	117	0/6
佩图单抗+多西他赛	202±44	106±95	126	0/6
曲妥珠单抗+百图单抗	196±25	251±66	85	0/6
佩图单抗+曲妥珠单抗+多西他赛	198±32	11±27	151	5/6

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肿瘤体积描述为平均值±标准偏差。TGI%，肿瘤生长抑制率；第1天，治疗开始日；第22天，即开始治疗后21天。

为了消除三种药物组合因抗HER2抗体总剂量较高而具有较高抗肿瘤活性的可能性，将多西紫杉醇联合曲妥珠单抗的肿瘤生长率与多西紫杉醇联合pertuzumab联合曲妥珠单抗的瘤生长率进行比较，其中每个治疗中抗HER2抗体的总剂量相等。20 mg/kg佩图单抗+10 mg/kg曲妥珠单抗+多西紫杉醇联合治疗的肿瘤消退率显著高于30 mg/kg曲妥珠单抗+多西紫杉醇联合治疗(图2).

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图2。

三重药物组合和含有相同抗体的曲妥珠单抗+多西他赛下的肿瘤生长率。携带KPL-4肿瘤的小鼠被随机分为三组(n个=6/组），并用佩图单抗（20 mg/kg）+曲妥珠单抗（10 mg/kg）+docetaxel或曲妥珠单抗（30 mg/kg）+1ocetaxel治疗。作为对照，给予人IgG和多西他赛载体。数据点为肿瘤生长率的平均值+标准差。统计显著性差异显示为*P<0.05。TRAS，曲妥珠单抗；PER，百日咳；DTX、多西他赛。

三药联合治疗后KPL-4肿瘤组织HER2信号的抑制

由于曲妥珠单抗和百日咳单抗结合到HER2分子的不同结构域并抑制HER2信号的不同方面，即配体诱导依赖性和配体诱导性，因此联合使用曲妥珠单抗和百日咳单抗有望更有效地抑制HER2信号。因此，我们在治疗后检测了HER2信号。曲妥珠单抗、佩图单抗或多西紫杉醇单独对HER2相关信号转导几乎没有影响。与单药或双药治疗的微弱抑制相比，三药联合治疗强烈抑制肿瘤组织中HER2、EGFR、HER3、ERK和AKT的磷酸化(图3).

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图3。

三重药物治疗后HER2信号转导的抑制。开始治疗后4天收集的肿瘤组织裂解液用于Western blotting。TRAS，曲妥珠单抗；PER，百日咳；DTX，多西紫杉醇(n个=每组4人）。

三药联用对体内肿瘤细胞凋亡的影响

在开始治疗4天后获得的肿瘤组织上进行凋亡细胞评估。与多西紫杉醇联合曲妥珠单抗或多西紫杉醇联合百日咳单抗相比，三药联合显著增加了凋亡细胞的数量(图4A和B). 我们还评估了有丝分裂期肿瘤细胞的数量，因为多西紫杉醇是一种微管蛋白解聚抑制剂。如所示图4Ctrastuzumab、pertuzumab或两者联合使用均不会增加多西紫杉醇诱导的有丝分裂期细胞数。这些结果表明，尽管有丝分裂阻滞增加，但曲妥珠单抗和佩图单抗与多西紫杉醇联合使用时仍能增强细胞凋亡诱导。根据细胞凋亡情况，与多西紫杉醇+曲妥珠单抗或多西紫杉醇+百日咳单抗的双药组合相比，三药组合通过计数Ki-67阳性评估的增殖细胞显著减少(图4D).

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图4。

凋亡和增殖肿瘤细胞的评估体内在三种药物治疗后。（A） 荷KPL-4肿瘤小鼠随机分为7组(n个每组＝6或7），并用每种药剂组合进行处理。开始治疗4天后，对凋亡的肿瘤细胞进行组织病理学评估。计数每1000个肿瘤细胞中（B）凋亡细胞、（C）有丝分裂细胞和（D）Ki-67阳性细胞的数量。比例尺显示50µm。统计上的显著差异如下所示^#P<0.05和*P<0.025。TRAS，曲妥珠单抗；PER，百日咳；DTX、多西他赛。

三药联合治疗后肿瘤组织中KPL-4细胞的细胞周期分析

三联药物组合可能会影响肿瘤中的细胞周期，因为众所周知，抗HER2抗体可诱导G1期阻滞，而多西紫杉醇可诱导治疗后的癌细胞M期阻滞在体外(19–22). 因此，我们从用曲妥珠单抗、佩图单抗、多西紫杉醇、曲妥珠单抗加多西紫杉醇或佩图单单抗加曲妥珠抗加多西紫杉醇治疗的异种移植瘤中分离出癌细胞，并分析其细胞周期分布(图5). 曲妥珠单抗或pertuzumab治疗不会导致G0/G1期细胞或其他期细胞的百分比发生实质性变化。多西他赛治疗并未增加G2/M期细胞的百分比，但增加了亚G1期细胞百分比。与TUNEL阳性细胞数量一致(图4B)与单用多西紫杉醇或多西紫杉醇联合曲妥珠单抗治疗（分别为62.2%和60.9%）相比，多西他赛联合佩图单抗联合曲妥珠单抗治疗有增加G1期亚细胞百分比（74.2%）的趋势。另一方面，在多西他赛中添加曲妥珠单抗或佩图单抗加曲妥珠单抗并不影响G2/M期人群(图5).

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图5。

肿瘤细胞的细胞周期评价体内以及三联药物治疗后活瘤细胞中有丝分裂细胞的百分比。开始治疗4天后收集肿瘤组织并分离。然后分离肿瘤细胞，用流式细胞仪检测细胞周期分布。计算每个细胞周期阶段的细胞百分比。TRAS，曲妥珠单抗；PER，百日咳；DTX，多西紫杉醇(n个=每组3人）。

百日咳、曲妥珠单抗和多西紫杉醇三药联合治疗后肿瘤组织中单核细胞的侵袭

为了检测先天免疫反应，我们检查了裸鼠异种移植瘤中肿瘤浸润单核细胞（MNC）的差异。在开始治疗4天后分析KPL-4肿瘤组织中MNC的侵袭情况(图6A和B,表二). 仅用曲妥珠单抗或百日咳单抗治疗的异种移植小鼠的肿瘤细胞周围观察到非常轻微的MNC浸润，而用多西他赛或对照组治疗的异类移植小鼠的瘤细胞周围未观察到MNC浸润。在曲妥珠单抗联合佩图单抗组中观察到肿瘤浸润性MNC显著增加。多西他赛联合曲妥珠单抗和佩图单抗联合治疗的MNC浸润明显增加(图6A和B). 根据肿瘤细胞周围的MNC浸润情况，三药联合组肿瘤细胞的单细胞坏死或凋亡显著增加，肿瘤细胞区域被结缔组织替代(表二). 早在第一次治疗后的第二天就观察到了三种药物组合诱导的MNC浸润(图6B).

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图6。

三种药物治疗后肿瘤细胞周围的MNC侵袭。（A） 开始治疗后1天（第2天）或4天（第5天）收集肿瘤组织，并用苏木精-伊红染色。对MNC的侵袭进行组织病理学评估。箭头显示肿瘤细胞周围浸润MNC的示例（第5天的典型图像）。（B） 跨国公司渗透得分为0：无变化；1：非常轻微；2：轻微；3：中等；或4：标记并以图形显示。比例尺显示50µm。统计显著性差异显示为*P<0.05。TRAS，曲妥珠单抗；PER，百日咳；DTX，多西紫杉醇(n个=每组6或7）。

表二：。

开始治疗4天后对肿瘤组织进行组织病理学分析。

	对照组						TRAS组						PER组						DTX组
特性	1	2	三	4	5	6	1	2	三	4	5	6	1	2	三	4	5	6	1	2	三	4	5	6
肿瘤细胞周围MNC浸润	−	−	−	−	−	−	−	−	−	±	±	±	−	−	−	−	±	±	−	−	−	−	−	−
肿瘤细胞单细胞坏死/凋亡增加	−	−	−	−	−	−	−	−	−	±	±	±	−	−	−	−	±	±	±	±	±	±	±	±
结缔组织替代肿瘤细胞区	−	−	−	−	−	−	−	−	−	−	±	±	−	−	−	−	−	±	−	−	−	−	−	−
	TRAS+DTX组						PER+DTX组						TRAS+PER组						PER+TRAS+DTX组
特性	1	2	三	4	5	6	1	2	三	4	5	6	1	2	三	4	5	6	1	2	三	4	5	6	7
肿瘤细胞周围MNC浸润	±	±	±	±	+	+	−	±	±	±	+	+	±	±	±	±	+	+	++	++	++	++	++	++	++
肿瘤细胞单细胞坏死/凋亡增加	±	+	+	+	+	+	±	+	+	+	+	+	±	±	±	±	+	+	+	++	++	++	++	++	+++
结缔组织替代肿瘤细胞区	±	±	±	±	±	+	−	+	+	+	+	++	±	±	±	+	++	++	++	++	++	++	++	++	++

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组内的数字与动物编号相对应，无变化；±，非常轻微；+，轻微；++，中等；+++，标记。单核细胞；TRAS，曲妥珠单抗；PER，百日咳；DTX、多西他赛。

讨论

为了阐明pertuzumab和trastuzumab与多西紫杉醇联合作用的机制，在本研究中，我们建立了一个小鼠异种移植模型，在该模型中，联合治疗显示出显著的抗肿瘤疗效，即使每种药物的剂量设置为自身无疗效或疗效较弱的剂量(图1A). 三药联合治疗的疗效显著高于曲妥珠单抗+多西他赛或百日咳单抗+多西他赛的双药联合治疗(图1A). 值得注意的是，在使用三联药物联合治疗期间，六分之五的小鼠观察到肿瘤完全消退。当紫杉醇与帕妥珠单抗和曲妥珠单抗联合使用时，也获得了类似的结果(图1B)这表明，除多西他赛外，其他化疗药物也可获得临床试验中报道的类似联合效应(23). 此外，通过检查多西他赛联合曲妥珠单抗的疗效，并与多西他赛尔联合百日咳单抗联合曲妥珠单抗的效果进行比较，当每种联合药物均含有等效总剂量的抗HER2抗体时，研究表明，三种药物组合的显著抗肿瘤效果不仅是因为抗HER2抗体的总剂量较高，而且是因为百日咳、曲妥珠单抗和多西紫杉醇的协同生物效应(图2). 基于这些发现，我们使用新建立的异种移植模型，从HER2信号抑制、细胞周期分布和MNCs向肿瘤组织的浸润等方面研究了三药结合的作用机制。

首先，我们分析了与这两种抗体相关的信号转导。研究发现，与单独使用或联合使用曲妥珠单抗和多西紫杉醇相比，佩图单抗联合使用曲妥珠单抗联合多西紫杉醇能够更强烈地降低肿瘤组织中EGFR、HER3及其下游因子AKT和ERK的磷酸化。百日咳单抗与曲妥珠单抗联合应用，通过抑制配体诱导的和配体依赖的HER2-HER3复合物的形成，可以互补性抑制HER3-AKT信号(5). 也有报道称，抑制HER3-AKT通路激活caspase-3并诱导HER2阳性乳腺癌和胃癌细胞株的凋亡(5,24,25)EGFR-ERK通路抑制诱导G1受体(26). 因此，在本模型中，凋亡细胞(图4B)增加，Ki-67阳性细胞(图4D)经三重药物治疗后降低。这些结果表明，这种强大的抗肿瘤活性和促凋亡活性至少部分是由于增强了三重药物治疗引起的HER3-AKT和EGFR-ERK信号的抑制。

其次，我们分析了肿瘤细胞的细胞周期分布，因为增加紫杉醇诱导的细胞周期阻滞可能是另一种作用机制。本研究表明，多西紫杉醇（一种微管蛋白解聚抑制剂）在开始治疗4天后显著增加了亚G1期的细胞数量，与多西紫杉醇或多西紫杉醇加曲妥珠单抗治疗后的细胞数相比，在多西紫紫杉醇中添加pertuzumab和trastuzumab大大增加了亚G1细胞和TUNEL阳性细胞的数量(图4A和B、和​和5）。5). 然而，多西紫杉醇和三药物联合组有丝分裂期的细胞数量没有变化，这表明三药物联合可在有丝分裂阻滞后立即促进细胞凋亡的诱导。

第三，我们分析了肿瘤组织中MNC的浸润，因为肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）已被证明是早期乳腺癌的预测治疗标记物(27)以及HER2阳性乳腺癌(28). 尽管在FinHER试验中，较高水平的TIL与更大的曲妥珠单抗获益相关(29)trastuzumab治疗后TIL数量的变化以及NK细胞或巨噬细胞等MNC向肿瘤组织浸润的变化尚未明确分析。在这里，我们首次证明了曲妥珠单抗加佩图单抗在开始治疗4天后增强了肿瘤细胞周围的MNC浸润。此外，与曲妥珠单抗和百日咳单抗联合用药相比，三药联合用药显著增加了MNC的浸润。值得注意的是，早在第一次治疗后的第二天，即肿瘤生长抑制变得明显之前，就观察到三种药物联合治疗后的MNC浸润。这些结果表明，增强肿瘤组织中MNC的招募有助于抑制三药联合用药中的肿瘤生长，可能通过ADCC(13,14). 事实上，已经表明被NK细胞杀死的KPL-4细胞的数量在体外取决于抗体的数量(14). 此外，据报道，多西紫杉醇可提高乳腺癌患者的血清IL-2水平并增强NK细胞活性(30). 因此，我们认为曲妥珠单抗、多西紫杉醇和百日咳单抗的三种药物组合可以协同增强ADCC活性，并有助于KPL-4异种移植小鼠模型的肿瘤缩小。虽然无胸腺裸鼠确实保留NK细胞，但必须承认，以裸鼠为宿主的异种移植模型在免疫系统方面是不够的。为了从免疫反应的角度更准确地研究三药物组合的作用机制，应使用适合评估的模型，例如使用人源化小鼠的模型。

总之，pertuzumab与曲妥珠单抗和多西紫杉醇三药联合治疗HER2阳性乳腺癌模型的协同效应被认为是通过两种机制的结合产生的：抗HER2抗体抑制HER2信号通路促进多西紫杉醇诱导的细胞凋亡有丝分裂阻滞；多西他赛增强了单核细胞对肿瘤组织的浸润，这种浸润的增加可能上调了抗体依赖性细胞毒性。这是首次报道揭示三联药物联合疗法优越的抗肿瘤作用机制。

致谢

参考文献