两株分离胆汁的基因组特征河流弧菌菌株致病性与胆盐适应的研究进展

临床分离株的表型和基因型特征

MALDI-TOF分析表明，菌株12605和3663与V（V）.河生植物来自默认的Bruker数据库（匹配得分>2.0）。BLAST将12605和3663的16个S rRNA序列与最新版本的EzBioCloud数据库进行比对¹²结果表明，这两个菌株与V（V）.河生植物NBRC 103150号^T型二者的增长曲线V（V）.河生植物分离物表明，在这两个分离物中都观察到了胆汁耐药性（参见补充图^{S1（第一阶段）}). 抗菌药敏试验表明，这两种菌株对所有测试的抗生素都敏感（见补充表^{S1（第一阶段）}).

基因组的一般特征

按照材料和方法所述，对12605和3663的基因组进行了测序。12605菌株的测序显示存在两条完整的染色体（一条染色体长度为3171566 bp，另一条长度为1680098 bp），平均G+C含量为50.1%。这两条染色体包含4395个蛋白质编码基因、113个tRNAs和37个rRNAs。菌株3663的测序显示基因组大小为4849960 bp，G+C含量为49.9%（207个连续序列）。这些连接包含4441个蛋白质编码基因、87个tRNA和12个rRNA。菌株12605和3663的基因组特征，以及其他八个参考V（V）.河生植物表中总结了菌株1.

12605和3663菌株的系统发育分析

为了进一步了解V（V）.流感病毒菌株12605和3663以及该物种内的其他菌株，其基因组序列从NCBI数据库中获得并分析。到目前为止V（V）.河生植物已保存在NCBI数据库中，包括菌株12605和3663。获得这十个变量之间总体相似性的估计值V（V）.河生植物基因组，我们计算了它们的平均核苷酸同一性（ANI）。令我们惊讶的是，与所有其他菌株（73.4–73.5%）相比，菌株NCTC 11327的ANI值显著较低（参见补充图^S2系列). 根据一些早期研究的建议，大约95-96%的ANI值被视为物种边界^13–15，表明NCTC 11327菌株可能不属于V（V）.河生植物物种。为了进一步验证这一假设，我们将NCTC 11327的16S rRNA基因与NCBI nr数据库进行了比较^16,17结果表明，它与V（V）.创伤应变CAPL-B-VVF2({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“KX904714.1”KX904714.1号). 因此，基因组序列（登录号。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“LMTE00000000.1”，“term_id”：“1111651082”，“term_text”：“LMTE00000000-1”}}LMTE00000000.1号)以……的名义存放V（V）.河生植物菌株NCTC 11327实际上是V（V）.创伤患者物种；因此，该基因组被排除在我们的分析之外。然后在剩下的九个基因组中重新计算ANI，发现它们之间的值在97.1%到100%之间，表明它们之间关系密切（参见补充图^第3章). 在菌株ATCC 33809和NBRC 103150之间，ANI值为100%的相似性最高。通过搜索NITE生物资源中心（NBRC）数据库，我们发现NBRC 103150实际上是ATCC 33809。因此，这两个基因组之间100%的ANI值证实它们实际上属于存放在两个不同培养中心的同一菌株。为了提供系统发育的高分辨率视图，基于九个物种的基因组比对构建了系统发育树V（V）.河生植物应变（图1). 不出所料，从胆汁中分离出的12605和3663菌株属于同一分支。

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图1

树状图V（V）.河生植物基于基因组BLAST的菌株。基因组BLAST文件从NCBI数据库下载，树由FigTree v1.4可视化⁴².

识别积分和共轭元素（ICE）

整合和结合元素（ICE）是在细菌中发现的一组不同的流动元素¹⁸能够实现毒力基因、抗生素抗性基因等的水平基因转移（HGT）。¹⁹为了在我们的两个胆汁分离株（12605和3663）中鉴定ICE，我们将它们的基因组与ICEberg数据库进行了比较¹⁹根据BLAST-2.3.0+²⁰程序。许多属于不同类型ICE的基因被列入了候选名单（见补充表^S2系列和^第3章). 共有15个基因属于ICEVfl公司在两个菌株中均发现Ind1（ICEberg ID 36）。确定ICE的基因Vfl公司Ind1总共存在V（V）.河生植物菌株，我们比较了ICE的完整序列Vfl公司来自GenBank数据库的Ind1({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“GQ463144”，“term_id”：“259156547”，“term_text”：“gQ463147”}}GQ463144号)九个菌株的全基因组如图所示2.这些菌株携带了大多数ICE基因Vfl公司与其他菌株相比，菌株539和560携带更多的基因。

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图2

整体元素和共轭元素ICE的比较Vfl公司Ind1和V（V）.河生植物基因组。箭头表示的基因基于ICE注释Vfl公司Ind1（加入编号{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“GQ463144”，“term_id”：“259156547”，“term_text”：“gQ463147”}}克463144).

毒力相关基因的鉴定

通过将ORF编码的蛋白质序列与毒力因子数据库（VFDB）进行比对，进一步筛选推定毒力相关基因的基因组。两个基因组都被发现含有许多假定的毒力因子（见补充表^S4系列和^第5章). 此外，在这两个基因组中都发现了包括GroES、GroEL和HspA同源物在内的热休克蛋白的多个拷贝，这些蛋白被证明对细菌的生存和在幽门螺杆菌 ²¹与之前的研究一致，在这些基因组中还发现了鞭毛生物合成蛋白的同源物（FliD、FliE、FliF、FliG、FliH、FliI、FliJ、FliK、FliL、FliM、FliN、FliO、FliP、FliQ、FliR和FliS）²²此外，我们搜索了12605和3663的原噬菌体区域的基因组，发现这两个菌株都含有几个原噬菌器区域（见补充表^S6系列). 噬菌体样序列被认为可以提高细胞粘附力和获得抗生素耐药性的能力，从而使细菌能够在新环境中生存并成为病原体²³.

胆汁抵抗相关基因的鉴定

已经证明胆汁盐具有强大的抗菌性能，可对细菌造成损害²⁴为了在胆汁中生存并导致人类胆囊炎，细菌必须克服这一障碍。作为对胆汁盐暴露的反应，细菌可以诱导外排系统，提高对胆汁毒性的抵抗力，增强运动能力，重塑外膜蛋白，甚至促进生物膜的形成²⁵ToxR是一种膜相关转录因子，被发现在胆汁抵抗中起主要作用V（V）.河生植物和其他弧菌属物种²⁶另一种蛋白GltK是一种谷氨酸/天冬氨酸转运系统通透酶蛋白，也被证明与胆汁抵抗有关²⁷对12605和3663菌株的基因组分析表明，这两个基因组中都存在编码ToxR和GltK的基因。此外，12605和3663的基因组中都编码了相当数量的推定胆汁抵抗相关蛋白，如DamX（一种参与胆汁抵抗的内膜蛋白）、脂多糖转运蛋白、膜转运系统和聚合酶西格玛因子。这些基因可能在12605和3663在胆囊中的存活中发挥重要作用。

分离物的鉴定

这两个菌株都是从含有5%羊血的米勒-欣顿肉汤琼脂中分离出来的。如前所述，通过MALDI-TOF MS分析对菌株3663和12605进行初步鉴定³⁵使用Microflex MALDI-TOF质谱仪对隔夜培养的培养物进行分析（德国BrukerDaltonics）。然后使用MALDI Biotyper 2.0数据库（德国BrukerDaltonics）分析原始光谱。通过PCR和测序获得了两株菌株的16S rRNA核苷酸序列。然后将序列与NCBI数据库和EzTaxon-e数据库进行比较。

生长条件和胆汁治疗

V（V）.河生植物菌株在37°C的FEM培养基中厌氧生长（10 g Bacto-Peptone（Difco）和40 g NaCl调节至pH 8.5，每升），有或没有0.3%牛胆汁溶液处理；进行了三次生物复制。

药物敏感试验

采用纸片扩散法检测阿米卡星、氨曲南、环丙沙星、美罗培南、哌拉西林、庆大霉素、左氧氟沙星、头孢吡肟、阿莫西林/克拉维酸、亚胺培南、头孢噻肟，头孢他啶、氯霉素、头孢哌酮和米诺环素的敏感性，并参考先前的研究进行解释⁹.大肠杆菌对照组为ATCC 25922。

排序、装配和注释

使用PacBio RS II测序系统对12605菌株进行全基因组测序，并通过SMRT分析2.2.1进行基因组组装³⁶使用Illumina Hiseq对3663菌株进行全基因组测序。2000测序器（Illumina，美国），具有高通量2×100 bp对末端测序策略。在分析之前，对读取集进行了过滤，包括删除具有低质量基本调用或与Illumina适配器相似的读取。随后，用天鹅绒修剪并组装了未加工的轴承。PAGIT流用于组装contigs和纠正前面描述的测序错误³⁷两个基因组最终由RAST服务器进行注释³⁸.

整合结合元件（ICE）和毒力相关基因的鉴定

使用BLAST-2.3识别积分和共轭元素（ICE）。0+程序²⁰针对ICEberg数据库¹⁹e值截止值为1e-10，身份阈值为60%。使用BLAST-2.3注释毒力因子。0+程序²⁰针对毒力因子数据库（VFDB）³⁹e值截止值为1e-10，身份阈值为80%。通过PHAST鉴定推定噬菌体序列⁴⁰.

比较基因组分析

ANI值V（V）.河豚使用OrthoANI计算菌株⁴¹基因组BLAST文件V（V）.河豚菌株从NCBI下载(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/2299)并使用FigTree v.1.4可视化树状图⁴²使用Mauve进行多基因组比对⁴³和BLAST环形图像生成器（BRIG）⁴⁴对于泛基因组计算，如前所述使用PGAP v1.12⁴⁵.根据直系群簇（COG）对直系群的功能进行分类⁴⁶.

本研究部分资金来自国家基础研究计划（编号：2015CB554201）；国家自然科学基金项目（No 81361138021、81711530049、81301461和41406140）；国家重点研发计划项目（Nos 2016YFD0501105）；浙江省重点研发计划项目（No.2015C03032）；浙江省自然科学基金项目（编号：LY17H190003）；传染病诊断与治疗国家重点实验室（2010KF04）开放基础。