沉默PAR-2对食管癌细胞增殖、侵袭和转移的影响

向量的构造

从GeneBank数据库检索人类PAR-2 mRNA（基因ID，55065）的序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/55065). 在选择合适的靶位点后，合成了两个寡核苷酸序列：序列1，5′-TTCCTAACTGGCCTGGTGTGGCAAT-3′；序列2，5′-GTGTTCATGTGAAGGTGGCTGAAG-3′，同时合成了另一个非特异性序列（5′-GCCTGTACCTCTAATGTCCT-3′），所有这些序列均由OriGene Technologies，Inc.（Rockville，MD，USA）提供。shRNA的干环结构为TCAAGAG，BamHI和HindIII的限制性位点分别位于5′端和3′端。然后将序列连接到pGFP-V-RS质粒载体。将重组质粒转化为DH5α活性细胞。简单地说，将活性细胞（100µl）与pGFP-V-RS质粒载体（5µl）在冰上孵育30 min，然后在42°C下孵育45 s，并在冰上浸泡2 min。随后，添加500µl SOC培养基（中国天津中奥生物公司）并混合。将混合物在37°C和40×g下离心1 h。然后将产物转移到抗卡纳（30µg/ml）预加载溶原肉汤（LB）培养基板中，并在37°C.下培养过夜。在每个培养皿上选择三个单克隆菌落，并在37°C下接种3ml抗卡纳（最终浓度30µg/ml）LB培养基（中奥生物公司）过夜。按照制造商的说明提取质粒DNA（中国北京转基因公司）。质粒DNA定量。简单地说，将2µl质粒DNA和98µl TE缓冲液（中国天津化学试剂厂）混合。使用核酸量化器（GeneQuant 80–2114-98，英国剑桥）测定浓度，并记录260和280 nm处的吸光度比，以评估纯度。检测浓度和纯度后，将质粒命名为PAR-2 shRNA-1、PAR-2 shaRNA-2和非特异性序列。阳性菌液送往上海尚能有限公司（中国上海）进行序列技术鉴定。

细胞培养和转染

EC109细胞用RPMI-1640培养基（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA）在5%CO中培养，该培养基含有10%胎牛血清（FBS；中国北京闵海生物技术有限公司）₂培养箱温度37°C，EC109细胞用胰蛋白酶消化，在生长80-90%后传代。将PAR-2 shRNA-1、PAR-2 shRNA-2和非特异性序列转染到对数生长期的细胞中。简单地说，对数期的EC109细胞被胰蛋白酶消化并接种到6孔板（5×10⁴每口井）。当细胞生长达到80%融合时，转染细胞。细胞和转染质粒在37°C的培养箱中培养24小时。EC109细胞的空白对照未接受转染。使用显微镜数字相机DP27（日本东京奥林巴斯）观察到带有绿色荧光蛋白的pGFP-V-RS质粒。根据转染后24小时绿色荧光蛋白（GFP）的表达计算转染效率。使用1.0 mg/ml嘌呤霉素通过几代筛选稳定转染细胞。未转染的EC109细胞作为空白对照组。其他组根据转染情况命名：PAR-2 shRNA-1组；PAR-2 shRNA-2组；和非特异性序列组。

逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）

根据制造商的方案，使用TRIzol试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）分离各组对数期细胞的总RNA。该cDNA由总RNA通过逆转录系统（Biometra UNO II Thermoblock；Biomestra GmbH，Göttingen，German）逆转录合成，并保存在−20°C。逆转录条件为30℃10 min，42℃30 min，99℃5 min，5℃5 min。PAR-2和内参β-actin的引物由Omiga 2.0软件（Accelrys，San Diego，CA，USA）设计如下：PAR-2正向，5′-AGAGCTTTATGGTAAGGT-3′和反向，5′-AACATGACAGGTCGTGAT-3′，扩增长度582bp；β-actin正向，5′-TGTTGAGACCTTCAACACCC-3′反向，5′-AGCACTGTGGCGTACAGG-3′，扩增长度540 bp。PAR-2的RT-PCR反应条件使用从北京Transgen Biotech Co.，Ltd.（中国北京）购买的RT-qPCR试剂盒，反应包括94℃45秒、51℃45秒和75℃1分钟的35个循环。PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳分离，并使用GDS 8000凝胶文档系统（UVP LLC，加利福尼亚州高地，美国）进行扫描。根据β-肌动蛋白的表达计算PAR-2的相对表达。实验重复了三次。

蛋白质印迹分析

每组实验细胞（PAR-2 shRNA-1 EC109细胞、PAR-2 shoRNA-2 EC109、非特异性序列转染EC109和EC109）用RIPA裂解液（中国海门贝约泰生物技术研究所）进行裂解，并在3000×g和4°C下离心10 min获得上清液。使用BCA试剂盒（Beyotime生物技术研究所）通过双钦酸法检测蛋白质浓度。将总蛋白（80µg）加载到10%SDS-PAGE的每个孔（共六个孔）上，然后转移到聚偏氟乙烯膜上。用TBST清洗膜，并用5%脱脂牛奶在37°C下封闭2 h。将一级抗体（兔单克隆抗体；分类号6976；Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA，USA；稀释度1:1000）在37°C下培养2 h，然后在4°C下培养过夜。然后用TBST清洗四次，每次15分钟。然后添加二级抗体（山羊抗兔；稀释液，1:1000，中国北京中山金桥生物科技有限公司），并在4°C下孵育2 h，然后用TBST洗涤15 min四次。最后，采用增强化学发光+试剂（北京鼎国长生生物科技有限公司，中国北京）开发膜。使用Quantity One 4.62软件（美国加利福尼亚州Hercules的Bio-Read Laboratories，Inc.）对显影胶片进行扫描和分析。β-actin作为内部对照，计算PAR-2的相对表达。

MTT分析

MTT试验中，包括三组EC109细胞：阴性对照组（用非特异性序列载体转染）；转染试剂组（仅添加转染试剂）；和PAR-2 shRNA组（PAR-2下调组）。不同组的EC109细胞在含有10%FBS的RPMI-1640培养基中培养，37°C，5%CO₂24 h，用对数生长期细胞进行MTT检测。每组细胞接种在96个板（2×10）上^三每口井）。在24、48和72 h将浓度为5 mg/ml的20µl MTT溶液添加到每个孔中。在37°C下培养4 h后，添加200µl二甲基亚砜以结束反应。使用ELISA分析仪（Biomad，Sacremento，CA，USA）分析样品，并在490 nm波长下测量每个孔的吸光度。抑制生长率的计算公式为：比值（%）=[吸光度（A）对照-A实验]/（A对照-A空白）×100。用生长抑制率绘制细胞生长抑制曲线。

流式细胞术细胞周期分析

将对数期细胞接种到密度为1×10的培养瓶中⁵/ml，37°C，5%CO，24小时₂然后用不含FBS的培养基替换培养基，在37°C和5%CO的条件下再培养24小时₂在室温下通过300×g离心3 min收集细胞，并用预冷PBS洗涤两次。添加70%预冷乙醇，在4°C下固定过夜。将细胞保存在4°C下并进行碘化丙啶染色，然后使用BD流式细胞仪（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）检测细胞周期，并使用ModFit LT for Windows 3.2版（Verity Software House，Topsham，ME，USA。

Transwell迁移和Matrigel侵入分析

使用Transwell小室（EMD Millipore，Billerica，MA，USA）进行迁移和入侵测定。基质在4°C下解冻，并与1:4比例的无血清培养基混合，作为人工基底膜。将带有8µm微孔膜的Transwell培养箱置于24孔培养板中，上部培养箱均匀覆盖40µl人工基底膜（BD-Matrigel™basement membrane Matrix；BD-Biosciences），以1:4的比例与RPMI-1640混合。在培养箱中37°C下凝集1小时后，水分从Matrigel中吸收，形成基质屏障。

将细胞接种到上部室中（2×10⁵细胞/孔），同时将600µl含有10%FBS的培养基添加到腔室底部。每个孔有3个重复。在37°C和5%CO条件下培养后₂细胞在室温下用10%甲醛固定30min，用PBS洗涤，室温下用曙红染色5min。将无法通过膜的细胞擦拭干净。在自然干燥之后，将膜干燥并移到载玻片上，然后用中性香脂密封。最后，在光学显微镜（奥林巴斯BX41；奥林巴斯公司）下用5个随机视图拍摄细胞图像。计算底部腔室中迁移/侵入细胞的数量，并使用3次重复的平均值。迁移分析中的实验步骤不包括使用Matrigel。细胞悬浮液的密度为1×10⁵/毫升。

RT-PCR和western blot分析PAR-2在不同EC109细胞系中的表达

为了检测转染后PAR-2 mRNA的表达，对不同组进行RT-PCR。如所示图2APAR-2 shRNA-1组、PAR-2 shoRNA-2组、非特异性序列组和空白对照组的谱带强度分别为0.35±0.03、0.43±0.04、0.44±0.04和0.45±0.41。与其他三组相比，PAR-2 shRNA-1组PAR-2显著下调（P<0.05）。在PAR-2 shRNA-2组、非特异性序列组和空白对照组中，PAR-2 mRNA表达无显著差异（P>0.05）。结果表明，构建的PAR-2 shRNA-1重组载体能有效沉默PAR-2 mRNA。

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图2。

用RT-PCR和western blot检测不同EC109细胞系中PAR-2的表达。（A） RT-PCR法检测不同EC109细胞系PAR-2 mRNA的表达。（B） Western blot分析检测不同EC109细胞系中PAR-2的蛋白表达。（C） 转染EC109细胞后PAR-2 mRNA表达水平的RT-PCR分析。1、PAR-2 shRNA-1组；2、PAR-2 shRNA-2组；非特异性序列转染组；4、对照组。（D） 转染EC109细胞后PAR-2蛋白表达水平的Western blot分析。1、PAR-2 shRNA-1组；2、PAR-2 shRNA-2组；非特异性序列转染组；4、对照组*与对照组相比P<0.05，**P>0.05与对照组。逆转录聚合酶链反应；蛋白酶激活受体2；小发夹RNA。

为了检测重组载体转染后PAR-2蛋白的表达，对不同组进行了western blot分析。如所示图2BPAR-2 shRNA-1、PAR-2 shoRNA-2、非特异性序列和空白对照组的灰度分别为0.96±0.01、1.04±0.02、1.05±0.04和1.09±0.04。与其他三组相比，PAR-2 shRNA-1组的PAR-2显著降低（P<0.05）。在PAR-2 shRNA-2组、非特异性序列组和空白对照组中，PAR-2蛋白表达无显著差异（P>0.05）。结果表明，构建的PAR-2 shRNA-1重组载体能有效沉默PAR-2的表达，这与PAR-2 mRNA的表达一致。

MTT法测定EC109细胞活力

为了研究PAR-2对细胞活性的影响，采用MTT法检测转染后增殖的变化。如所示图3PAR-2 shRNA组EC109细胞增殖明显低于阴性对照组（P<0.05），转染后24、48和72h的生长抑制率分别为5.92、24.89和32.28%。转染试剂组与阴性对照组比较，差异无显著性（P>0.05）。结果表明，沉默的PAR-2可以抑制EC109细胞株的细胞增殖，而转染试剂和阴性质粒对EC109的细胞活力没有明显的抑制作用。

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图3。

MTT法检测PAR-2 shRNA对不同EC109细胞系活力的影响*与PAR-2 shRNA组相比，P<0.05。蛋白酶激活受体2；shRNA，小发夹RNA。

流式细胞术检测PAR-2诱导的细胞周期变化

为了研究沉默的PAR-2对EC109细胞周期的影响，采用流式细胞术检测细胞周期的变化。如所示图4PAR-2 shRNA转染EC109细胞后，观察到S期阻滞。24、48和72 h后，PAR-2 shRNA转染细胞和正常培养细胞S期细胞百分比分别为19.37±2.19、16.93±2.56和18.74±2.92%，32.79±4.06、26.54±1.37和33.45±2.46%。PAR-2 shRNA转染的EC109细胞S期细胞比例显著低于转染的EC109细胞（P<0.05），这表明沉默的PAR-2抑制了EC109细胞的细胞周期。

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图4。

流式细胞术检测PAR-2 shRNA对不同EC109细胞系细胞周期的影响。（A） PAR-2 shRNA处理EC109细胞24小时（B）。（C） 用PAR-2 shRNA处理EC109细胞72小时（D）对照组（不转染）24小时（E）对照组不转染48小时（F）对照组未转染72小时（PAR-2，蛋白酶激活受体2）；shRNA、小发夹RNA。