Oncol Lett公司。2017年10月；14(4): 3941–3946.
miR-590通过靶向Smad7促进HUMSCs增殖并诱导ECM合成
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刘天明
汕头大学医学院第一附属医院临床医学实验室，中国广东省汕头市515041
吴英阁
汕头大学医学院第一附属医院临床医学实验室，中国广东省汕头市515041
黄腾毅（Tengyi Huang）
汕头大学医学院第一附属医院临床医学实验室，中国广东省汕头市515041
张雪萱
中国广东省汕头市汕头大学医学院第一附属医院临床医学实验室，邮编：515041
蔡英木
汕头大学医学院第一附属医院临床医学实验室，中国广东省汕头市515041
汕头大学医学院第一附属医院临床医学实验室，中国广东省汕头市515041
*平均出资
2015年10月19日收到；2017年3月23日接受。
摘要
MicroRNA（miR）-590已被确定为多种癌症细胞系中细胞增殖、迁移和侵袭的促进剂和凋亡抑制剂。然而，其对非癌细胞的影响仍有待阐明。将miR-590转染人脐带间充质干细胞（HUMSCs），使用cell-Light 5-ethynyl-20-deoxyuridine Apollo 567试剂盒测定细胞增殖率，并使用western blot分析和免疫荧光显微镜检测细胞外基质（ECM）蛋白的存在。利用生物信息学分析和双核糖核酸酶分析，确定了新的靶点miR-590。此外，还评估了miR-590对细胞增殖和ECM增强的影响。本研究的结果表明，miR-590直接与母亲抗十足瘫痪同源基因7（Smad7）的3′-非翻译区相互作用，这是转化生长因子-β信号通路的重要因素。miR-590的过度表达在mRNA和蛋白质水平下调了Smad7的表达，随后导致细胞增殖和ECM积累。此外，以Smad7为靶点的小干扰RNA转染HUMSCs对细胞增殖和ECM的影响与miR-590的过度表达相似。本研究结果表明，miR-590通过直接靶向Smad7影响HUMSC增殖。
关键词：miR-590，《母亲对抗十足瘫痪Homolog 7》，人脐带间充质干细胞，细胞增殖，细胞外基质
介绍
组织创伤是一种典型的病理疾病，正常组织遭受结构性破坏，导致功能受损(1). 因此，伤口的快速愈合是一个需要进一步研究的重要课题。一个既定的假设是使用干细胞修复受损组织(2). 从沃顿果冻中获得的间充质干细胞（MSCs）是具有多种分化途径和自我更新潜能的成体干细胞。与其他组织源性干细胞相比，脐带很容易获得，免疫原性和生物伦理学考虑有限(三). 此外，以前的研究已经证实，microRNA（miRNA/miR）可能在伤口愈合中发挥重要作用(4,5). 然而，miRNAs在人脐带间充质干细胞（HUMSCs）中对伤口愈合的作用尚待阐明。
miRNAs是一种长度在19到25个核苷酸之间的小型非编码RNA，它通过靶向mRNA的3′-非翻译区（3′-UTR）来调节基因表达，从而导致翻译抑制或降解(6). miR-590已被确定为肾癌中通过抑制增殖相关基因和促进细胞生长的肿瘤促进剂(7)，肝细胞癌(8)，急性髓细胞白血病(9)，宫颈癌(10)和肺癌(11). 根据先前的研究，真核生物翻译延伸因子1ε1(12)，转化生长因子（TGF）β受体II(8)，S100钙结合蛋白A10(9)，聚溴1(7)与L1细胞粘附分子同源的细胞粘附分子(10)是miR-590的靶标。miR-590的下调表达诱导烟碱诱导的心房纤维化(13)；然而，miR-590对干细胞增殖和细胞外基质（ECM）合成的潜在影响在干细胞中尚不清楚。Smad7已被确定在TGFβ信号通路中发挥重要作用(14). 以往的研究表明，Smad7是成人同型性和胚胎发育中的一个重要因素，并且Smad7的异常表达通过ECM合成和肿瘤的发展与人类疾病相关(15,16). 然而，miRNA/Smad7调节在创伤疾病中的作用尚不清楚。贾等(17)证明miR-17-5p通过靶向Smad7和Liu调节成骨细胞的分化和增殖等(18)发现miR-21通过靶向Smad7影响ECM在肺部的沉积。此外，miR-195(19)，miR-16(20)，miR-132(21)，miR-15(22)和miR-92a(23)调节Smad7表达水平。本研究的结果表明，miR-590通过靶向Smad7促进HUMSCs的增殖并诱导ECM在HUMSC中的表达。miR-590可能是干细胞生长和组织修复的关键调节因子。
材料和方法
细胞培养
HUMSC人类干细胞系购自美国类型培养物收集中心（目录号：CSC-7700W；美国弗吉尼亚州马纳萨斯），并在补充有低血糖Dulbecco改良Eagle's培养基（HyClone；美国犹他州洛根市GE Healthcare Life Sciences）的MSC生长培养基（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆）中培养加上10%热灭活的胎牛血清（HyClone；GE Healthcare Life Sciences）、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素（中国海门Beyotime生物技术研究所）。细胞在37°C的加湿培养箱中在含有5%CO的大气中培养2.
转染
miR-590模拟和小干扰RNA（siRNAs）由广州RiboBio有限公司（中国广州）合成。Smad7 siRNA的寡核苷酸序列如下：5′-AAGCUCAAUUCGGACAAG-3′。使用脂质内酰胺进行miRNA模拟和siRNA转染®2000（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.），根据制造商的协议。在Opti-MEM无血清培养基（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）中共使用50或100 nM miR-590模拟物或阴性对照物以及50 nM siRNA进行转染。总计5×106在24孔板的每个孔中镀上HUMSC（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）。转染后36小时或48小时分别制备总RNA和蛋白质，用于进一步实验。
miRNAs和mRNAs的定量分析
根据制造商的协议，使用TRizol（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）从培养的HUMSC中提取总RNA。采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）技术，以广州瑞宝生物有限公司的引物分析miR-590的表达，并选择U6作为内部参照物。为了定量分析Smad7的表达，使用500 ng总RNA，使用第一链cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Inc.）合成随机提呈的单链cDNA，并使用SYBR-Green S混合物（CWBIO，中国北京）进行qPCR。按照前面描述的方法，将Smad7的相对量归一化为18S(24). 热循环条件为：；PCR引物序列为：18S正向，5′-GTAACCCGTGAACCCATT-3′；18S反面，5′-CACATCCAATCGGTAGTG-3′；Smad7正向，5′-CCTCTTACTCCAGATACC-3′；Smad7反面，5′-GTCTCCTCCCAGTATG-3′；U6正向，5′-CTCGCTCGGCAGCACA-3′，U6反向，5′-AACGCTCGAATTTGCGT-3′。进行了三个独立的实验。
蛋白质提取和蛋白质印迹分析
转染后48小时，使用含有2mM苯基甲基磺酰氟的放射免疫沉淀裂解缓冲液（Sigma-Aldrich；Merck KGaA，Darmstadt，德国）裂解HUMSCs。使用Bicinchoninic蛋白质检测试剂盒（Beyotime生物技术研究所）测定每个样品的蛋白质浓度，用SDS-PAGE（12%凝胶）分离等量的总蛋白质（80µg），并转移到聚亚乙烯膜（Merck KGaA）上。在室温下用含0.05%吐温-20的Tris缓冲盐水中的5%脱脂乳封闭膜1小时，在4°C下与一级抗体孵育过夜，在室温下用1X TBST缓冲液洗涤三次，每次5分钟，在室温下与二级抗体孵育1h，最后用化学发光辣根过氧化物酶（HRP）底物试剂（Merck KGaA）进行可视化。本研究中使用的抗体如下：小鼠抗β-微管蛋白（HC101；1:5000；中国北京Transgen Biotech Co.，Ltd.）、兔抗Smad7（25840-1-AP；1:4000；ProteinTech Group，Inc.，Chicago，IL，USA）、兔抗菌素I（ab209539；1:4000，Abcam，Cambridge，UK）、兔对抗纤维连接蛋白（FN）（ab6584；1:4000）；Abcam）、HRP标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG；10004302-1；1:5000；北京中山金桥生物科技有限公司，中国北京）和HRP标记山羊抗兔IgG（A21020；1:5000，北京中山金侨生物科技有限公司）。使用灰度扫描法定量蛋白质印迹（图像J v1.48；美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）。
荧光素酶检测
使用3个不同的在线程序对Smad7 mRNA的3′-UTR中miR-590的潜在结合位点进行预测：TargetScan(http://www.targetscan.org),microRNA.org网站(网址：http://www.microrna.org)和miRBase(http://www.mirbase.org). Smad7 mRNA的3′-UTR片段，包括野生型（wt）或突变（mt）位点，在pCDNA3.1-luciferase载体中的萤火虫荧光素酶下游进行扩增和克隆（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）。预测结合位点的突变是使用PCR介导的位点特异性突变产生的。为了构建载体，使用了以下引物序列：Smad7的wt 3′-UTR正向5-CGCGGATCCCGCGTGCGGAGGACAGA-3和反向5-CCGCTCGAGAGTCCTTTCTCAAAGC-3。在3′UTR突变体中，来自与miR-590的核苷酸2-5互补的122–1129核苷酸序列的Smad7 3′UTR突变体被突变为与miR-580相同的序列（从ATAAGCTA到TTATGCAA）。对于转染，HUMSCs（5×106细胞/孔）接种在24孔板上，转染250 ng pCDNA3.1-核糖核酸酶-Smad7（wt和mt）、pRL-SV40-雷尼利亚和pCDNA3.1-核糖核酸酶，以及50 nM miR-590模拟或阴性对照。24小时后，在室温下使用200µl放射免疫沉淀分析裂解缓冲液（中国上海Beyotime生物技术研究所）裂解细胞15分钟，在8500×g室温下离心5分钟以收集上清液，并使用双荧光素酶报告试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊市Promega Corporation）进行分析，根据制造商的协议。进行了三个独立的实验。
5-乙炔基-20-脱氧尿苷（EdU）测定
为了测定细胞增殖，将HUMSCs悬浮在含有10%胎牛血清的低葡萄糖Dulbecco改良Eagle's培养基组成的MSC生长培养基中，并在24孔（5×104细胞/100μl）平板转染前1天。12小时后，用miR-590模拟物（10 nM）、miRNA对照物（10 nM）、siRNA-Smad7（10 nM）或siRNA-对照物（10nM）转染HUMSCs。转染后，根据制造商的协议，使用EdU DNA增殖和检测试剂盒（cell-Light 5-ethynyl-20-deoxyuridine Apollo 567试剂盒；广州RiboBio有限公司）在36小时后评估细胞增殖能力。通过计数1000个细胞中的EdU增殖细胞来确定HUMSCs的增殖百分比。随后，在480 nm的紫外光波长下，利用荧光检测DNA合成以促进细胞增殖。所有实验均单独进行，一式三份。
免疫荧光显微镜
用si-Smad7或si-control（5×10）转染后6将培养在玻璃盖玻片上的细胞在−20°C下用预冷丙酮固定10分钟。细胞在室温下分别用1%Triton X-100（PBS中）和5%牛血清白蛋白（PBS）渗透和封闭1小时。使用兔抗I型胶原多克隆抗体（稀释度1:500；ab209539；Abcam）在4°C下隔夜探测I型胶原，并使用山羊抗兔IgG-CruzFluor™594（稀释度1:1000；SC362282；Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Dallas，TX，USA）在室温下测定兔IgG 1小时。随后，在室温下用1X PBS清洗玻璃罩3×5 min。
最后，在室温下用DAPI（稀释度，1:4000；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）对细胞核染色10分钟。使用PBS中50%的甘油将盖玻片固定在玻片上，并通过荧光显微镜观察（ECLIPSE Ti-s；日本东京尼康公司；8-10个视野；放大倍数，×200）并使用SPOT诊断电荷耦合设备摄像机拍摄图像（美国密歇根州斯特林高地的SPOT RT彩色诊断仪器；在荧光显微镜下对每个玻璃盖玻片约500个细胞进行计数）。图像采集后，使用Image J v1.48软件评估荧光强度（美国国立卫生研究院）。
统计分析
所有实验数据均来自独立的三次重复实验，数据表示为平均值±标准偏差。GraphPad Prism（版本5；GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA，USA）用于数据分析。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
miR-590诱导HUMSCs增殖和ECM合成
评估了miR-590过表达对HUMSCs的影响，包括细胞形态变化、增殖和ECM合成。在用miR-590模拟物转染后，与阴性对照组相比，36小时时，在50 nM（66.00±4.20倍；P<0.0003）和100 nM（138.00±11.40倍；P<0.0001）时，HUMSCs中miR-590()而细胞形态从典型的间充质细胞转变为纤维母细胞样细胞(). Western blot分析表明，与对照组相比，miR-590的表达水平增加，导致50 nM的I型胶原和FN水平分别增加39.86±2.18和82.99±3.16%，100 nM的胶原和FN52.21±2.46和152.03±4.58%(). Cell EdU分析表明，与对照组相比，HUMSCs在50 nM和100 nM时的增殖分别增加到38.15±2.14和60.14±4.52%().
miR-590转染促进HUMSC增殖和ECM沉积。（A） miR-590模拟转染导致在20 nM（66.00±4.20倍）和100 nM（138.00±11.40倍）时HUMSCs中miR-590。（B） miR-590模拟转染影响36小时时的细胞形态miR-590模拟转染对ECM蛋白表达影响的量化。（F） miR-590模拟转染对HUMSC增殖影响的量化*P<0.05 vs.NC.NC，阴性对照；人脐带间充质干细胞；ECM，细胞外基质；纤维连接蛋白；乙二胺四乙酸，5-乙炔基-20-脱氧尿苷；miR，microRNA。
Smad7 mRNA 3′-UTR中miR-590-结合位点的预测
为了识别miR-590的下游目标，3个独立的在线数据库（TargetScan、，microRNA.org网站和miRBase）用于预测潜在靶点。这三个数据库总共预测了110个假定的mRNA()其中Smad7特别令人感兴趣，因为先前的研究已经证明它在细胞增殖中的作用及其对ECM的影响(25). 在分析Smad7 3′-UTR[1520碱基对（bp）]序列后，miR-590的唯一预测结合位点被鉴定为1122-1129 bp().
miR-590直接与Smad7 mRNA的3′-UTR结合。（A）生物信息学分析使用3个独立的数据库预测了110个miR-590。（B） 根据miR-590序列，在Smad7 mRNA的3′-UTR中预测miR-590-结合位点，并扩增包含突变结合位点的片段。（C） 在pCDNA3.1-luciferase载体中，包含野生型或突变位点的Smad7 mRNA 3′-UTR片段被插入报告基因下游。质粒与miR-590模拟物或模拟对照物共转染，相对荧光素酶活性通过标准化雷尼利亚与突变位点相比，野生型序列显著降低（46.70±5.81%）*P<0.05 vs.NC.NC，阴性对照；WT，野生型；MT，突变位点；Smad7，母亲反对十足瘫痪同系物7；UTR，非翻译区；miR、微小RNA；ZNF367，锌指367；BCL7A，B细胞淋巴瘤7A；DUSP8，双特异性磷酸酶8；UNC80，未协调80；STAG2，基质抗原2。
HUMSCs中miR-590和Smad7 3′-UTR的荧光素酶分析
为了确定Smad7是否为miR-590的靶点，将wt或mt Smad7 mRNA 3′-UTR插入荧光素酶报告载体，并与miR-590。miR-590在HUMSCs中过度表达36 h后，融合到wt Smad7 mRNA 3′-UTR的荧光素酶报告质粒的荧光素酶活性显著降低（P<0.05）()而mt Smad7 mRNA 3′-UTR的荧光素酶活性不受影响().
miR-590的过度表达降低Smad7的表达
为了验证Smad7是否为miR-590的功能上游基因，分析了Smad7的mRNA和蛋白表达水平。将miR-590模拟物和阴性对照物转染到HUMSC中。分别用qPCR和蛋白质印迹分析检测转染后36和48小时Smad7的表达。miR-590的过度表达降低了36 h时Smad7 mRNA的表达水平（51.55±3.83%；). Smad7的蛋白质水平也有类似的影响（50 nM时为65.73±8.09%，100 nM时72.36±9.38%；).
miR-590转染抑制Smad7的mRNA和蛋白表达水平。（A） miR-590模拟物和Smad7 siRNA转染分别将Smad7 mRNA的表达下调至51.55±3.83和43.72±6.48%。（B） miR-590模拟物或Smad7 siRNA转染对Smad7影响的Western blot分析。（C） miR-590模拟物或Smad7 siRNA转染对Smad7蛋白表达影响的量化*P<0.05 vs.NC.NC，阴性对照；miR，microRNA；Smad7，母亲反对十足瘫痪同系物7；si/siRNA，小干扰RNA。
Smad7 siRNA促进HUMSCs增殖和ECM增强
评估Smad7作为miR-590功能靶点的重要性。用Smad7 siRNA或干扰对照转染HUMSCs 36或48h，mRNA（43.72±6.48%；)蛋白质（67.49±6.01%）；)Smad7 siRNA可显著降低Smad7水平。EdU分析和免疫荧光显微镜分别用于评估HUMSCs的增殖能力和ECM表达。与对照组相比，36小时后HUMSCs的增殖能力增加到30.17±2.31%(). 免疫荧光分析发现Smad7表达降低促进了I型胶原的上调，与对照组相比，I型胶原比例增加到67.86±8.18%().
Smad7 siRNA诱导HUMSC增殖和ECM合成。（A） 细胞增殖分析表明，Smad7 siRNA转染在36 h时促进了HUMSC的增殖（30.17±2.31%）。（B） 免疫荧光显微镜分析表明，与阴性对照组相比，Smad7 siRNA转染后48 h增加了I型胶原沉积（67.86±8.18%）*与阴性对照组相比P<0.05；Smad7，母亲对抗半睡半醒同性恋7；si/siRNA，小干扰RNA；人类脐带间充质干细胞；ECM、细胞外基质；EdU，5-乙炔基-20-脱氧尿苷。
讨论
创伤是一种主要的手术结果，因此有效的伤口愈合问题是研究人员和临床医生研究的重点。伤口愈合涉及一系列相互重叠、相互关联的病理改变。例如，许多细胞和ECM组件参与重建(26). 在组织工程中，干细胞治疗是典型的研究方法。干细胞治疗理论，包括细胞置换(27)和ECM增强(28)可能解释了有效伤口愈合的潜在机制。miRNAs是一种小的非编码RNA，通过与mRNA的3′-UTR直接结合来调节基因表达(29). 越来越多的研究表明，miRNAs在许多生物学过程和病理疾病中起着至关重要的作用，而以前的研究表明miRNA参与细胞增殖、凋亡、分化和纤维化(29,30). 然而，miRNAs参与干细胞治疗创伤修复的独特作用和潜在分子机制尚待阐明。
在过去的几十年（2005年至2015年）中，miR-590已被确定用于多种疾病，包括动脉粥样硬化(31)、心肌炎(32)，肝细胞癌(8)和肾癌(7). 在本研究中，评估了miR-590对HUMSCs的影响，包括增殖和ECM积累。创伤愈合是一个复杂的过程，涉及局部未损伤细胞的增殖、迁移、分化和ECM积累。在糖尿病溃疡（一种经典的伤口愈合模型）中，miR-198通过靶向纤溶酶原激活物尿激酶、透明相关的formin 1和层粘连蛋白亚基γ2显著增加和抑制迁移能力(33). 考虑到快速伤口愈合至关重要，而干细胞治疗被认为很有前景，因此需要研究miR-590对伤口愈合的影响。在本研究中，miR-590的过度表达促进了HUMSCs中的细胞增殖，并且通过免疫荧光显微镜证实了ECM的增强。为了解释miR-590的作用，使用生物信息学分析确定了miR-590。值得注意的是，Smad7被确定为潜在目标之一，并被选中进行进一步调查。进一步的实验发现，miR-590的过度表达在mRNA和蛋白质水平上抑制了Smad7的表达水平。根据荧光素酶分析，预测的Smad7 mRNA 3′-UTR上miR-590的一个结合位点被认为是一个功能位点。在鉴定Smad7作为miR-590新靶点的基础上，评估了Smad7 mRNA在细胞增殖和ECM合成中的作用。与miR-590过表达相比，Smad7 siRNA的转染对HUMSCs中细胞增殖和ECM促进的刺激相似。
总之，本研究结果表明miR-590通过靶向Smad7诱导干细胞增殖。因此，未来的研究可能能够确定miR-590是否调节其他基因以促进干细胞分化或迁移。
致谢
本研究由国家自然科学基金资助（批准号81302540）。
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