MicroRNA-126通过靶向IRS-1抑制糖尿病视网膜病变模型中的细胞活性和侵袭

逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

RT-qPCR使用Roche Light Cycler 480（瑞士巴塞尔Roche Diagnostics）、TaqMan MicroRNA分析（Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.）和使用TRIzol（Invitrogen；Thermo-Fisher科学公司）从10⁶细胞。根据制造商的协议，使用干环引物和TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.）将RNA逆转录到cDNA。使用TaqMan miR-126 MicroRNA分析（Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.）扩增获得的cDNA。使用以下引物通过PCR扩增67 bp cDNA产物：miR-126正向、5′-TATAAGATGAGGTTCCCGAACT-3′和反向、5′-ATATGAATTCTCAGGGCTAGATAC-3′(22). 根据Stratagene RT-qPCR仪器，反应混合物在95°C下培养10分钟，然后在95°C40个循环中培养15秒和60°C培养1分钟（Stratagene:Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA，USA）。miR-126表达归一化为U6 mRNA表达。基因mRNA表达归一化为β-肌动蛋白。所用引物如下：U6正向、5′-CTCGCGCAGCACA-3′和反向、5′-AACGCTCGAATTTGCGT-3′；β-actin正向，5′-CATCCGTAAAGACCTCTACAC-3′和反向，5′-ATGGAGCCACCGA-3′。相对基因表达使用2^-ΔΔCq方法(23). 进行了三个独立的实验。

蛋白质印迹分析

单元格（10⁷)在裂解缓冲液（50 mM Tris（pH 7.4）、150 mM NaCl、1%Triton X-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%SDS、2 mM焦磷酸钠、25 mMβ-甘油磷酸、1 mM EDTA、1 mM-Na）中进行裂解_三沃₄，0.5µg/ml亮氨酸肽）。使用Bradford蛋白质测定法（美国加利福尼亚州Hercules Bio-Rad Laboratories，Inc.）对蛋白质进行定量。总蛋白（30 mg）和预先染色的分子量标记用10%SDS-PAGE分离，然后转移到硝化纤维素膜上。在含5%脱脂奶的TBST（含0.5%Triton X-100的Tris缓冲盐水）中在4°C下隔夜封闭膜，并用抗IRS-1（分类号sc-8038；稀释度，1:400）、VEGF（分类号sc-57496；稀释度：1:500）、PI3K（分类号sc-365290；稀释度；1:400）和Akt（分类编号sc-81434；稀释度1:500）的一级抗体进行检测和β-肌动蛋白（分类号sc-130300；稀释度1:500）（均来自美国德克萨斯州达拉斯圣克鲁斯生物科技公司）在4°C下过夜。然后在TBST中清洗膜，并在室温下与二级辣根过氧化物酶结合抗体（分类号sc-516102；稀释度1:5000）孵育2 h。在与二级抗体孵育后，用TBST清洗膜。使用Odyssey CLx Western Blot检测系统（LI-COR Biosciences，Lincoln，NE，USA）测量带密度。使用Image-Pro Plus 6.0软件将每个基因的带密度归一化为相应的β-肌动蛋白密度（Media Cybernetics，Inc.，Rockville，MD，USA）。所有实验均一式三份。

转染试验

将重组质粒（2 mg）和200 pmol miR-126模拟物、miR-126-模拟对照、miR-26-抑制剂或miR-126--抑制剂对照（分类号4464066和4464084；Ambion；Thermo Fisher Scientific，Inc.）转染到3×10⁶根据制造商的协议，使用Nucleofector仪器（德国科隆隆科隆有限公司）通过电穿孔将EC和RP持续48小时。在IRS-1干扰实验中，使用HEK293基因组DNA作为PCR模板，扩增编码mir-126前miRNA的DNA片段（侧翼上游和下游30-50 nt），并将其插入表达载体pSilencer4.1CMV-puro（Ambion；Thermo Fisher Scientific，Inc.），如前所述(24). 如前所述，抗IRS-1小干扰RNA（siRNA）的DNA片段是通过退火两个互补寡核苷酸并克隆到pSilencer4.1 CMV puro载体中产生的(25). 转染后，细胞在37°C下孵育4小时后恢复。这个实验被重复了三次。

双荧光素酶报告分析

使用TargetScan 3.4版预测目标基因(网址：http://www.targetscan.org/) (26). 将含有预测miR-126结合位点[IRS1-wild type（wt）]的IRS-13′-非翻译区（3′-UTR）的DNA片段（414 nt）克隆到pGL3-promoter质粒（美国威斯康星州麦迪逊市Promega Corporation）中，并用4 nt片段替换miR-126-结合位点，以产生突变的3′UTR pGL3-reporter质粒（IRS1-mut）如前所述(16). 使用Trans Messenger转染试剂（德国希尔登Qiagen GmbH）将带有正常和/或突变IRS-1 3′-UTR的重组报告载体与miR-126模拟物、miR-126-模拟对照物、miR-126抑制剂或miR-126--抑制剂对照物共同转染到EC细胞中。根据制造商的协议，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒（分类号RG027；中国海门贝尤泰姆生物技术研究所）进行荧光素酶检测。所有实验均一式三份。相对荧光素酶活性归一化为对照细胞。

细胞活力测定

使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）分析评估细胞活力。简单地说，以指数增长的细胞被收获并以2×10的速度接种到96个培养皿中^三分别在MEM培养基中培养24、48、72、96和120小时。随后，丢弃MEM，并添加含有MTT的新鲜培养基（PBS中的5 mg/ml MTT；中国上海桑根生物技术有限公司），并额外培养细胞4小时。使用二甲基亚砜溶解生成的甲素晶体，并使用ELISA读卡器每24小时测量一次490 nm处的吸光度（BioTek Instruments，Inc.，Winooski，VT，USA）。所有实验重复5次。

侵入试验

用MEM清洗Transwell入侵室（美国纽约州科宁市科宁公司），并添加20µl Matrigel（1 mg/ml）（美国新泽西州富兰克林湖BD Biosciences），以均匀覆盖聚碳酸酯膜（8µm孔径）的表面，形成Matrigel膜。该腔室分为上腔室和下腔室。对于侵入分析，EC和RP（4×10⁵)隔夜无血清培养，接种到含有10%FBSon的MEM培养基中。底室中MEM含有10%的FBS，作为化学引诱剂。在37°C下培养48小时后，用棉签从顶室取出细胞，并在室温下用4%甲醛固定入侵细胞15分钟，然后用0.1%结晶紫溶液染色10分钟。我们随机评估了5个视野。入侵细胞是用倒置显微镜拍摄的。我们随机评估了5个视野，并使用ImageJ软件（版本1.48；美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）计算和量化细胞总数。结果显示为平均值±标准偏差，每组重复实验三次。

miR-126在从小鼠DR模型获得的EC和RP中靶向IRS-1

由于DR模型中EC和RP的miR-126水平降低，因此研究了其与这两种细胞类型生物学的关系。miR-126模拟物用于扩增miR-126s的表达，而miR-126的合成抑制剂用于抑制内皮细胞和视网膜色素瘤中内源性miR-126斯的表达。该miR-126模拟物或抑制剂的有效性通过qPCR检测得到证实(图2A和B). 生物信息软件程序TargetScan预测IRS-1被miR-126靶向。根据结果，在IRS-1基因的3′-UTR中观察到miR-126的潜在结合靶点(图2C). 为了在实验上确认IRS-1是EC中miR-126的真实靶点，将IRS-1-wt或IRS-1-mut质粒与miR-126-模拟物或模拟对照物一起转染到EC中。转染48小时后，结果显示，与其他三组相比，miR-126模拟组IRS-1-wt中的荧光素酶活性显著降低(图2D). IRS-1-wt和IRS-1-mut荧光素酶报告载体与miR-126抑制剂或抑制剂对照共同转染到内皮细胞。结果表明，miR-126抑制剂转染逆转了ECs中野生型IRS-1 3′UTR荧光素酶表达水平的降低(图2E). 综上所述，这些数据表明IRS-1是miR-126的靶点。

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图2。

miR-126和IRS-1之间的靶向关系。（A） 通过RT-qPCR测定miR-126模拟物或模拟对照物共同转染的内皮细胞和视网膜色素瘤中miR-126的表达水平。（B） 使用RT-qPCR评估miR-126抑制剂或抑制剂对照共同转染的内皮细胞和视网膜色素瘤中miR-126的表达水平。（C） wt和mut IRS-1 3′-UTR含有R-126的靶序列。（D） ECs与含有wt或mut IRS-1 3′-UTR的miR-126模拟或模拟对照荧光素酶报告载体共同转染。（E） 对转染miR-126抑制剂或抑制剂对照的内皮细胞进行类似的荧光素酶分析。荧光素酶活性表示为归一化为肾小球荧光素酶的萤火虫荧光素素酶。数据表示为三个实验的平均值±标准偏差*与其他组相比，P<0.05。miR-126，microRNA-126；IRS-1，胰岛素受体底物-1；内皮细胞；视网膜周细胞；RT-qPCR、逆转录定量聚合酶链反应；wt，野生型；突变突变株；3′-UTR，3′-非翻译区。

miR-126抑制内皮细胞和视网膜细胞的侵袭和生存能力

为了进一步探讨miR-126对内皮细胞和视网膜色素瘤的影响，本研究检测了miR-126的过度表达或抑制是否能够影响细胞生存能力。EC和RP转染miR-126模拟物、模拟对照、miR-126-抑制剂或抑制剂对照。miR-126模拟物和抑制剂对IRS-1表达的有效性通过在EC和RP中的蛋白质印迹得到证实(图3A和B）。与模拟对照组相比，miR-126模拟物转染显著降低IRS-1蛋白水平，与抑制剂对照组相比miR-126-抑制剂转染显著增加IRS-1蛋白质水平(图3C)与模拟对照组相比，miR-126模拟物转染显著减少了侵袭性EC和RP的数量（P<0.05；图3D)与抑制剂对照组相比，miR-126抑制剂转染增加了侵袭性EC和RP的数量（P<0.05；图3D). 此外，与模拟对照组相比，miR-126的过度表达降低了EC的生存能力，而与抑制剂对照组相比miR-26的抑制提高了EC的存活能力(图3E). 与模拟对照组相比，在RP中也获得了类似的MTT结果，miR-126的过度表达降低了细胞存活率(图3F). 此外，经miR-126抑制剂治疗后，RP活性增加(图3F). 这些结果表明miR-126抑制了内皮细胞和视网膜色素瘤的侵袭和存活。

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图3。

miR-126对内皮细胞和视网膜色素瘤侵袭和存活的影响。用miR-126模拟物、模拟对照、miR-126-抑制剂或抑制剂对照转染内皮细胞和视网膜色素细胞。Western blotting检测与miR-126模拟物、模拟对照、miR-126-抑制剂或抑制剂对照共转染的（A）EC和（B）RP中IRS-1的表达水平。（C） EC和RP中的相对蛋白表达归一化为β-肌动蛋白。（D） 入侵的EC和RP的数量。使用MTT分析在指定的时间点测定（E）EC和（F）RP的活性。所有实验重复三次，重复三次*与模拟对照组相比P<0.05；^#与抑制剂对照组相比，P<0.05。miR-126，microRNA-126；内皮细胞；视网膜周细胞；IRS-1，胰岛素受体底物-1。

miR-126通过下调IRS-1抑制PI3K/Akt通路

VEGF是一种血管生成因子，参与维持血管内稳态(27)和糖尿病视网膜病变(28). 据报道，胰岛素诱导的VEGF表达是通过激活胰岛素受体下游的PI3K/Akt介导的(29).

因此，研究了miR-126过度表达和抑制对IRS-1和PI3K/Akt通路表达的影响。采用western blotting分析检测PI3K/Akt通路相关基因的表达水平，包括PI3K、Akt和VEGF。结果表明，与转染模拟对照组的细胞相比，转染miR-126模拟物可有效降低这些蛋白的表达，而转染miR-126抑制剂可提高EC中这些蛋白质的表达（P<0.05；图4). 在RP中也进行了Western blotting分析，与模拟对照组相比，miR-126模拟物转染后检测到这些蛋白的表达降低。此外，与抑制剂对照组相比，miR-126抑制剂转染显著增加了这些蛋白的表达水平（P<0.05；图4). 这些数据表明，PI3K/Akt通路的激活被ECs和RP中miR-126的过度表达所抑制。

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图4。

miR-126通过靶向IRS-1调节PI3K/Akt通路。用miR-126模拟物、模拟对照、miR-126-抑制剂或抑制剂对照转染内皮细胞和视网膜色素细胞。通过蛋白质印迹法测定（A）EC和（B）RP中IRS-1和PI3K/Akt途径蛋白的蛋白表达水平。（C） （C）EC（D）和RP中的相对蛋白表达水平归一化为β-肌动蛋白。数据表示为三个实验的平均值±标准偏差*与模拟对照相比，P＜0.05；^#与抑制剂对照组相比，P<0.05。miR-126，microRNA-126；PI3K，磷脂酰肌醇3-激酶；蛋白激酶B；IRS-1，胰岛素受体底物-1；内皮细胞；视网膜周细胞；血管内皮生长因子。