Oncol Lett公司。2017年10月；14(4): 3947–3952.
Khat通过线粒体和MAPK相关途径促进人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡
,1 ,2 ,三 ,三和三
于璐
1中国江苏省泰州市南通大学泰州人民医院内分泌科，邮编225300
李燕燕
2中国江苏省苏州市苏州大学第一附属医院神经外科及脑神经研究实验室，邮编：215006
闵翔（音）
三华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系，湖北武汉430030
周杰（音译）
三华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系，湖北武汉430030
胡安·陈
三华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系，湖北武汉430030
1中国江苏省泰州市南通大学泰州人民医院内分泌科，邮编225300
2苏州大学附属第一医院神经外科及脑神经研究实验室，江苏省苏州市，邮编215006
三华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系，湖北武汉430030
2015年10月10日收到；2017年3月23日接受。
摘要
卡塔（Khat）(美味咖喱Forsk）是一种生长在东非和阿拉伯西南部的开花常绿植物。食用Khat与口腔癌的发生有关，但其分子水平的作用机制尚不清楚。本研究证明了阿拉伯茶提取物对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的细胞毒性作用。采用台盼蓝排斥试验、流式细胞术、荧光和电子显微镜以及western blotting分析Khat对乳腺癌细胞活性、凋亡相关蛋白表达和活性氧（ROS）水平的影响。本研究的结果表明，400µg/ml卡塔茶治疗能够诱导乳腺癌细胞死亡，凋亡调节因子Bax的蛋白表达增加，B细胞淋巴瘤2的表达减少，ROS水平以时间依赖的方式降低。此外，与未经处理的细胞相比，经khat处理的细胞中活化的c-Jun N末端和细胞外调节蛋白激酶的表达增加。线粒体通过向胞浆释放凋亡蛋白和产生过量活性氧参与细胞凋亡。本研究结果表明，khat通过MAPK激活和线粒体介导的死亡诱导MDA-MB-231细胞凋亡。
关键词：khat、MDA-MB-231细胞、凋亡、丝裂原活化蛋白激酶、线粒体介导的死亡
介绍
Khat是一种草本植物，全世界数百万人使用它的精神刺激作用，主要是在非洲和中东。卡塔茶中的生物碱是可以有效提取和口服吸收的主要成分(1). Khat含有多种药理活性化合物(2). Cathinone是新鲜卡塔叶中的一种主要生物碱化合物，相对不稳定，迅速代谢为cathine（去甲伪麻黄碱）和去甲麻黄碱(1). 此外，其他生物碱，包括苯戊苯胺和Catheduline可能发挥药理作用(三,4). 它们的大多数药理作用被认为是通过与去甲肾上腺素受体优先结合，部分通过与多巴胺和5-羟色胺受体结合，释放生物胺来介导的(5).
据报道，嚼Khat会影响男性和女性的性行为。研究表明，卡塔叶具有壮阳作用(6–8)可用于治疗早泄(9). 此外，据报道，卡塔茶是一种精神刺激剂(10). 此前也有报道称，卡塔茶用于治疗抑郁症、饥饿、疲劳、肥胖和胃溃疡(11). 卡塔叶能影响心血管、消化、内分泌、肝胆、呼吸和泌尿生殖系统(12). 以前的研究表明，卡他茶与口腔癌的发展有关(13)和肝细胞凋亡(14). 据我们所知，没有研究调查过食用卡塔茶对乳腺癌的影响。
程序性细胞死亡可能通过凋亡、坏死或过度自噬发生，其中线粒体在其调节中起着重要作用(15,16). B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）家族通过影响线粒体外膜的稳定性参与线粒体介导的细胞死亡(17). 抗凋亡Bcl-2和Bax已被证明与急性髓系白血病细胞的自发凋亡有关在体外(18). 以前的一项研究建议使用患者细胞中的Bax与Bcl-2比率来预测临床反应和结果(19). 线粒体通过向胞浆中释放凋亡蛋白和产生过量活性氧化物种（ROS）参与细胞死亡机制。线粒体呼吸链是细胞活性氧的主要来源，因此是活性氧产生作用的靶点(20).
Khat诱导的肝细胞凋亡主要通过持续激活c-Jun NH2-末端激酶（JNK）信号通路进行调节，部分通过细胞外信号调节激酶（ERK）信号级联进行调节(14). JNK和ERK是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的一部分。本研究的目的是研究卡塔茶对乳腺癌细胞MDA-MB-231活力和凋亡的影响。
材料和方法
Khat提取
Khat植物是从也门萨那当地市场购买的。夏季采集带有软茎的新鲜卡塔叶，称重，用蒸馏水清洗三次，并在干净、干燥、远离阳光的房间中干燥三天。随后，对叶片进行称重，将其包装在一个紧密的铝箔袋中，并在4°C下储存。将干燥的卡塔叶（100 g）切成段（5 mm），溶于100 ml 95%乙醇中，在5031×g下室温离心5 min。使用滤纸过滤上清液。将乙醇（100 ml）添加到剩余的叶子中，并重复该过程。使用旋转蒸发器（LabTech，Inc.，Hopkinton，MA，USA）在30°C下以0.44×g的速度浓缩提取的乙醇阿拉伯茶悬浮液，直至70%的乙醇溶剂蒸发。用100 ml蒸馏水稀释粘性溶液，并在室温下以201×g搅拌60 min。过滤后的液体在−70°C下储存24小时，然后使用冻干设备（美国宾夕法尼亚州沃明斯特市冻干技术公司）进行干燥。一般来说，100 g干叶产生8 g卡塔叶提取物粉末。卡他叶中的主要生物碱是卡他碱、卡他酮和去甲麻黄碱。新鲜卡塔叶中卡西酮、卡西酮和去甲麻黄碱的平均浓度分别为0.95、1.98和0.54 mg/g(21–23). 将冷冻干燥的阿拉伯茶提取物溶解在Hank的平衡盐溶液中（HyClone；GE Healthcare Life Sciences，Logan，UT，USA，不含Ca2+或镁2+以达到200µg/ml的最终浓度，并使用孔径为0.2µm的过滤器进行消毒。
细胞培养和治疗
MDA-MB-231细胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle’s培养基（HyClone；GE Healthcare Life Sciences）中培养（浙江天航生物科技有限公司，中国浙江杭州），并保存在37°C、5%Co的增湿培养箱中2当达到60-70%的融合率时，用400µg/ml的卡塔茶处理细胞，并在37°C下培养4、8、16或24小时。对照组细胞未经卡塔叶处理。
细胞活力分析
将细胞接种到6孔板中，60–70%汇合，37°C过夜。随后将细胞暴露于不同浓度的Khat（20、200、300和400µg/ml）中4、8、16和24小时。使用0.25%胰酶液（不含EDTA）消化细胞，收集所得悬浮液，并在室温下在168×g下离心5分钟。然后在倒置光学显微镜下评估之前，用0.2%台盼蓝或在室温下5分钟对细胞进行染色。带有蓝色标记细胞核的细胞被认为已经死亡。
膜联蛋白V/碘化丙啶（PI）染色分析
根据制造商的方案，使用Annexin V荧光素异硫氰酸盐（FITC）凋亡检测试剂盒（中国江苏省南京市江苏凯根生物科技有限公司）评估细胞凋亡。药物处理后，用0.25%胰酶液（不含EDTA）消化6孔板中的细胞，收集悬浮液并在室温下以168×g离心5分钟，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，并用5µl FITC-结合的Annexin V和5µl PI染色溶液在500µl染色缓冲液中再次悬浮。将细胞在冰上培养30分钟，并在1小时内使用FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA）进行分析。使用ModFit V3.2软件（BD bioscience）分析细胞凋亡率。检测未治疗对照组基底细胞凋亡和坏死率。在≥3个独立实验后测定细胞凋亡率，每个实验一式三份。
Hoechst 33258对凋亡细胞的染色
用阿拉伯茶处理细胞，并将其固定在含4%甲醛的Hoechst 33258（10µg/ml）中。在37°C下用400µg/ml卡塔茶培养不同时间（0、4、8、16和24小时）后，用入射光荧光显微镜放大×200倍检查核形态，以评估凋亡特征。凋亡细胞被确定为染色强烈、浓缩和碎裂的细胞核部分。
透射电子显微镜
细胞与400µg/ml khat孵育16小时，并通过透射电子显微镜观察。将细胞固定在含有2%戊二醛的0.1 M二甲氨基甲酸钠缓冲液（pH 7.4）中。细胞用二碳酸钠缓冲液冲洗，并在1%四氧化锇中后固定。细胞用梯度乙醇脱水（50、70和90%，每次10分钟），并嵌入环氧树脂中。切片用3%醋酸铀酰和柠檬酸铅双重染色。在JEOL 1230透射电子显微镜（日本东京JEOL有限公司）下检查细胞，并使用Agfa Arcus II扫描仪（中国上海Agfa公司）和Adobe Photoshop软件（7.0.1版；英国Maidenhead Adobe Systems Europe有限公司）制作显微照片。
蛋白质印迹分析
收集细胞并在放射免疫沉淀缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，1%Nonide P-40，0.25%脱氧胆酸钠，50 mM NaF，1 mM Na3VO4，5 mM焦磷酸钠和蛋白酶抑制剂片[江苏科根生物科技有限公司]）中在冰上溶解30分钟。将细胞裂解液在39514×g下在4°C下离心10 min，并将上清液用于蛋白质印迹。使用BCA蛋白质分析试剂（Pierce；Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA）测定总蛋白质浓度。在添加SDS负载缓冲液后，在100°C下对裂解产物进行变性。蛋白质在4–20%SDS-PAGE凝胶上分离，然后转移到硝化纤维素印迹膜上。在室温下，用5%的非脂肪干乳在1X TBST中封闭膜>1小时后，用1:1000稀释的一级抗体[p-JNK（目录号sc-135642）、JNK[目录号sc-1648）、p-ERK（目录编号sc-81492）、ERK（分类号sc-271270）、Bcl-2（目录号sc-7382）、Bax（目录号sc-7480）孵育膜和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（分类号sc-73548）；所有位于美国加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术有限公司]在4°C下，在1X TBST中用5%的非脂肪干乳稀释12小时以上。用1:3000稀释二级抗体（亲和纯化山羊抗兔IgG（分类号GB23303）、山羊抗鼠IgG，分类号GB33301）、Servicebio Biotechnology，Ltd.，武汉，Huber，中国）结合辣根过氧化物酶，在室温下检测膜结合一级抗体1h。使用ECL化学发光试剂盒（Servicebio Biotechnology，Ltd.，中国湖北武汉）对印迹进行可视化，并使用ChemiDoc XRS凝胶成像设备（Bio-Read Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA）对印痕进行分析。
ROS生成的测量
如前所述，使用流式细胞术和二氯荧光素二醋酸盐（DCFH-DA）测量活性氧的产生(24). 用卡塔茶（400µg/ml）处理细胞4、8、16和24小时，用胰蛋白酶-EDTA解离，用冷PBS洗涤两次，并悬浮在PBS（1×106细胞/ml）。将细胞悬浮液（500µl）转移到试管中，并在37°C下与最终浓度为5µM的DCFH-DA孵育30分钟。通过测定1×10的DCF荧光强度来评估ROS生成4流式细胞术检测细胞。
统计分析
数据以平均值±标准偏差表示，并使用SPSS软件（版本17.0；SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行分析。采用单因素方差分析（随后进行Student-Newman-Keuls事后检验）来分析组间差异的显著性。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
Khat处理对MDA-MB-231细胞活力的影响
通过检测MDA-MB-231细胞的活性来评估Khat的抑制作用。如所示在20、200、300和400µg/ml浓度的Khat处理后，MDA-MB-231细胞的活性受到了剂量和时间依赖性的抑制，在处理8小时后，400µ/ml浓度的影响最大。因此，选择400µg/ml Khat浓度用于后续实验。
Khat处理对MDA-MB-231细胞活力的影响。用不同浓度的卡塔叶处理MDA-MB-231细胞一段时间（0、4、8、16和24小时），用台盼蓝排除法测定细胞活力。
卡他茶对MDA-MB-231细胞凋亡的影响
为了研究400µg/ml khat对MDA-MB-231细胞凋亡的影响，在使用流式细胞术检测之前，用膜联蛋白V和PI对细胞进行双重染色。在无血清培养24小时后，MDA-MB-231细胞在细胞凋亡检测之前暴露于400µg/ml卡塔茶中4、8、16和24小时。如所示对照组和细胞在khat作用4、8、16和24h后的凋亡率分别为7.76±2.86、9.7±1.59、10.58±2.03、13.2±4.14和25.3±5.09%。在指定的每个时间点，用Hoechst 33258对处理过的细胞进行染色。对照组细胞核规则、圆形(). 相比之下，大多数khat处理的（400µg/ml；16小时）细胞的细胞核被浓缩和碎裂，这是凋亡细胞的特征(). 在电子显微镜下观察，经khat处理的细胞出现染色质凝聚和细胞核收缩，这进一步证实了细胞凋亡().
利用Annexin V和PI染色分析细胞凋亡。（A） 用Annexin V和PI对MDA-MB-231细胞进行双重染色，并用流式细胞仪进行分析。四个群体分别为非凋亡死亡细胞（Q1）、晚期凋亡细胞（Q2）、存活细胞（Q3）和早期凋亡细胞（Q 4）。（B） 用400µg/ml卡塔叶处理细胞，在0到24小时之间的凋亡率。PI，碘化丙啶。
未经处理和khat处理的MDA-MB-231细胞16 h的形态和超微结构特征。未经处理的对照细胞在（A）倒置对比光显微镜（放大倍率，×20）下观察，（B）荧光显微镜下用Hoechst 33258（DNA荧光色素）染色（放大倍度，×20和（C）电子显微镜（放大倍数，×200）。在（D）倒置对比光显微镜（放大倍率，×20）、（E）荧光显微镜（放大倍率，×2 0）和（F）电子显微镜（放大倍数，×2 00）下观察Khat处理的细胞。
Khat治疗对凋亡相关蛋白表达和MAPK活化的影响
用western blot分析测定卡塔茶治疗前后MDA-MB-231细胞中caspase-9的表达。Khat治疗后未检测到caspase-9的表达(). 与未经处理的细胞（即0小时时的细胞）相比，在用400µg/ml卡塔茶培养不同时间（0、4、8、16和24小时）后，促凋亡蛋白Bax的表达显著增加。相反，与0小时的表达水平相比，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低。
凋亡相关蛋白和MAPK（p-JNK、JNK，p-ERK、ERK）的表达。MDA-MB-231细胞与400µg/ml卡塔培养4、8、16和24小时；western blotting检测凋亡和MAPK相关蛋白表达。丝裂原活化蛋白激酶；p、 磷酸化；ERK，细胞外信号调节激酶；JNK，janus激酶；凋亡调节因子Bax；Bcl-2，凋亡调节因子Bcl-2。
随后通过测量活化形式JNK和ERK的表达，研究了MAPKs在khat诱导MDA-MB-231细胞凋亡中的作用与0、4和8h相比，16和24h的p-JNK条带的强度似乎较小。4h的p-ERK条带强度高于0h。同样，24h的条带强度大于16h，而JNK和ERK的总表达没有改变。因此，与未经处理的细胞（即0 h时的细胞）相比，用卡他处理细胞时，p-JNK和p-ERK的表达增加。MDA-MB-231细胞中ERK和JNK信号的激活可能介导细胞对卡塔茶治疗的凋亡反应。为了证实JNK和ERK在khat诱导的凋亡中的可能作用，测定了JNK抑制剂（SP600125）和ERK抑制剂（PD98059）对MDA-MB-231细胞活性和凋亡率的影响。如所示与未经处理的细胞相比，SP600125和PD98059处理显著逆转了khat诱导的细胞死亡。这些结果表明JNK和ERK参与了khat诱导的MDA-MB-231细胞凋亡。
细胞外信号调节激酶（PD98059）和c-Jun NH2-末端激酶（SP600125）抑制剂显著降低了卡塔诱导的MDA-MB-231细胞凋亡。（A） 用台盼蓝排斥试验（B）检测细胞活力。用流式细胞仪分析细胞凋亡*与未经PD98059和SP600125处理的细胞相比，P<0.01。
卡塔叶处理对活性氧生成的影响
活性氧被认为是细胞凋亡的潜在调节因子(25). 因此，在本研究中，测定了khat处理的细胞中ROS的水平。用400µg/ml khat处理MDA-MB-231细胞4、8、16和24小时，并进行流式细胞术检测ROS。如所示用400µg/ml卡塔茶处理4小时后，细胞中的ROS生成量高于对照细胞（0小时细胞）。然后，8-24小时组的ROS生成量下降。卡塔叶引起活性氧生成的时间依赖性下降。
卡塔叶处理对活性氧生成的影响。使用流式细胞术评估卡塔处理（400µg/ml）MDA-MB-231细胞中的ROS生成。400µg/ml khat处理4 h的细胞中的ROS生成高于对照细胞，然后在8-24 h组中降低*与对照细胞相比，P<0.01。活性氧。
讨论
在本研究中，细胞活力测定表明，卡塔茶处理以时间和剂量依赖的方式抑制MDA-MB-231细胞的活力。流式细胞术分析表明，400µg/ml khat以时间依赖性的方式诱导MDA-MB-231细胞凋亡，这与细胞活性测定一致。
凋亡是癌症抑制的主要机制，其特征是与caspase调节的生化过程相关的形态学和超微结构变化(26,27). 卡塔茶含有复杂的植物化学成分，含有能够诱导细胞凋亡和对抗癌细胞的黄酮类化合物(28). 在本研究中，Hoechst 33258染色和透射电镜结果表明，khat诱导MDA-MB-231细胞凋亡，并引起形态学变化，包括微绒毛丢失、细胞膜起泡、核染色质凝聚、细胞溶质室空泡化和凋亡小体形成。
MAPK信号通路包括ERK、JNK和p38通路，它们参与细胞生存、增殖和凋亡。本作者以前的一项研究表明，经khat和未经处理的肝细胞中p38的表达没有显著差异(29). 因此，在本研究中，我们检测了经khat处理的乳腺癌细胞中ERK和JNK的表达水平。以前已经证明ERK的激活与细胞周期进展和增殖有关(30)而JNK通常在应激和诱导细胞凋亡的毒物作用下被激活(31). 先前的报告表明，持续的JNK激活导致细胞凋亡(32,33). 在本研究中，蛋白质印迹表明，用khat处理后，p-JNK和p-ERK的水平以时间依赖的方式增加，而用JNK和ERK抑制剂处理显著逆转了khat诱导的细胞死亡。这些结果表明，khat诱导的乳腺癌细胞凋亡主要由JNK信号通路的激活介导。
众所周知，Bcl-2蛋白是细胞凋亡的抑制剂(34)Bax是细胞凋亡的促进剂(35). 本研究结果表明，在khat处理的MDA-MB-231细胞中，Bcl-2表达降低，Bax增加，且呈时间依赖性，Bax/Bcl-2比率增加。先前的一项研究报告称，Bax/Bcl-2比率可能是比单独启动子更重要的凋亡指标(36). 线粒体介导的凋亡信号通路由Bcl-2家族的抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl和髓细胞白血病1）和促凋亡蛋白（Bax、Bcl2-细胞死亡相关激动剂和Bcl-2同源拮抗剂/杀伤剂）调节(17–20). 因此，本研究结果表明，卡塔茶通过线粒体介导的凋亡途径诱导MDA-MB-231细胞凋亡。此外，在MDA-MB-231细胞中未检测到caspase-9蛋白表达，表明khat诱导的凋亡不受经典凋亡途径的调控。
在人类中，氧化应激已被确定与各种病理有关，包括癌症、动脉硬化、II型糖尿病、缺血/再灌注损伤、慢性炎症过程和各种神经退行性疾病(37). 过量的活性氧可诱导大分子氧化，并已被证实与衰老、线粒体DNA突变和细胞死亡有关(38). 线粒体产生的活性氧在细胞色素c和其他促凋亡蛋白的释放中起着重要作用，可触发半胱氨酸蛋白酶激活和凋亡(20). 在本研究中，与对照细胞相比，经卡他治疗的乳腺癌细胞中的ROS水平更高。这一结果进一步表明，khat诱导的凋亡受线粒体介导的凋亡途径调控。
综上所述，本研究结果表明，khat通过持续激活JNK和线粒体介导的凋亡途径导致MDA-MB-231细胞凋亡。据我们所知，这是第一项证明khat可以通过诱导乳腺癌细胞凋亡来抑制乳腺癌的研究。
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