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《公共科学图书馆·病理学》。2017年8月；13（8）：e1006601。
2017年8月30日在线发布。 数字对象标识：10.1371/日志.ppat.1006601
预防性维修识别码：项目编号：C5595347
PMID：28854233

中和抗体和非中和抗体对巨细胞病毒糖蛋白B的保护作用

安娜·布茨,概念化,数据管理,形式化分析,调查,方法,验证,写作——原稿,写作–审查和编辑,#1 阿斯特里德·卡巴赫,概念化,数据管理,形式化分析,调查,方法,写作——原稿,#1 约翰·斯宾德勒,概念化,数据管理,形式化分析,写作——原稿,写作–审查和编辑,1 芭芭拉·克罗夫,概念化,数据管理,形式化分析,资源,1 尼娜·路透社,调查,方法,验证,1 海因里希·斯蒂希特,概念化,数据管理,方法,可视化,写作——原稿,2 托马斯·温克勒,概念化,数据管理,资金获取,调查,监督,写作——原稿,写作–审查和编辑,三 威廉·J·布里特,概念化,数据管理,资金获取,调查,方法,验证,写作——原稿,写作–审查和编辑,4和迈克尔·马赫,概念化,数据管理,形式化分析,资金获取,调查,方法,监督,写作——原稿,写作–审查和编辑1,*
Sallie R.Permar，编辑器
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数据可用性声明

摘要

人巨细胞病毒（HCMV）是一种重要的、普遍存在的病原体，可导致免疫功能低下的个体（如器官移植受者和子宫内感染的婴儿）患上严重的临床疾病。由于可用化合物的毒性以及对可用抗病毒治疗产生耐药性的病毒的出现，抗病毒化疗仍然存在问题。抗病毒抗体可以作为一种有价值的替代策略来限制病毒性疾病在患者中的临床后果。HCMV包膜糖蛋白B（gB）是诱导病毒中和抗体的主要抗原。然而，抗gB抗体在感染过程中的作用体内仍然未知。我们使用小鼠巨细胞病毒（MCMV）模型生成并研究了一些具有不同病毒中和能力的抗gB单克隆抗体（mAbs）。发现这些单克隆抗体与MCMV gB上的类似抗原结构结合，这些抗原结构在HCMV gB中有代表性。当单克隆抗体用于免疫缺陷RAG时-/-我们观察到宿主限制持续感染的病毒载量减少，而单克隆抗体具有强大的中和能力体外以及归类为非中和性的单克隆抗体。在治疗环境中，与非中和抗体相比，中和抗体显示出更大的降低病毒负担的能力。疗效与病毒中和单克隆抗体的持续浓度相关体内而不是他们体外中和能力。中和单克隆抗体的组合进一步增强了抗病毒作用，并被发现与免疫动物的多价血清具有同样的保护作用。感染前预防性给予单克隆抗体也具有保护作用，中和和非中和单克隆抗体在预防免疫缺陷小鼠的致命感染方面同样有效。总之，我们的数据表明，有效中和抗gB单克隆抗体的治疗应用是一种改变免疫缺陷宿主CMV感染结果的策略。当感染前出现时，中和和非中和抗-gB均表现出保护能力。

作者摘要

人类巨细胞病毒（HCMV）是一个主要的全球健康问题，预防HCMV疾病的疫苗是一种公认的医疗需求。然而，迄今为止还没有获得任何疫苗的许可。开发疫苗的一个主要障碍是缺乏对疫苗应诱导的保护性反应的性质和特异性的了解。HCMV是一种复杂的病毒，在病毒包膜内含有许多抗原，可以作为保护性抗体的靶点。糖蛋白B（gB）是中和抗体的重要靶点，因此是疫苗接种或被动免疫治疗等干预策略的有趣分子。我们使用CMV（MCMV）小鼠模型系统来探讨gB特异性抗体在免疫治疗或预防中的潜力。我们的结果表明，抗gB抗体可以保护免疫缺陷宿主免受致命的感染过程。当用作既定感染的治疗时，中和抗体和非中和抗体都显示出显著的保护作用，其中中和抗体的效果更佳。在中和抗体中，保护作用与持续体内中和活性，而不是体外中和滴度。有趣的是，中和抗体和非中和抗体在预防性给药时，即在感染MCMV前一天，都显示出相当的保护作用。因此，我们的数据表明体外CMV特异性抗体的中和能力可能不能反映提供保护的抗体效应器功能体内.

介绍

人类巨细胞病毒（HCMV）是一种重要且普遍存在的人类病原体，广泛存在于各个地理位置和社会经济群体。HCMV初次感染后终生持续，其特征是周期性再激活。虽然大多数感染在免疫活性宿主中是亚临床的，但HCMV可导致免疫功能低下患者和宫内感染新生儿的严重疾病和死亡。因此，HCMV是先天性感染最常见的病毒原因，影响全球所有活产婴儿的0.5-2%[1,2]. 它是儿童感音神经性耳聋的主要传染源，也是精神发育迟滞的重要原因[三]. 此外，HCMV是实体器官或干细胞移植受者在移植早期和晚期发病和死亡的主要原因，并被认为是导致移植后晚期移植物丢失和移植受者长期存活率总体下降的移植物功能障碍的原因[4,5].

尽管与这些化合物相关的毒性以及对现有抗病毒治疗产生耐药性的病毒的出现仍然是这些患者临床护理中的一个挑战，但通过抗病毒化疗，移植患者的终末器官疾病的预防和临床疾病的治疗已经实现[6]. 对于先天性感染的婴儿，抗病毒药物治疗对受影响最严重的婴儿显示出一定的益处，但这种治疗的相对益处以及这些药物相当大的短期和未知的长期毒性，导致对其使用的建议非常有限[7].

因此，长期以来，预防性接种被认为是预防高危人群HCMV感染和疾病的首选方法。然而，预防性疫苗仍然难以捉摸[8]尤其是因为对HCMV的保护性免疫的性质还远未被了解。一般来说，病毒中和抗体的诱导已被证明与最有效的抗病毒疫苗的保护相关，HCMV也不例外[9]. 因此，确定中和抗体反应的主要靶点并表征这些抗体的保护模式将是开发有效抗HCMV疫苗的重要一步。

HCMV包膜内有两种蛋白质或蛋白质复合物被确定为中和抗体反应的最重要靶点：糖蛋白（g）B和含gH的复合物（gH/gL/gO和gH/gL/UL128/UL130/UL131A）[10]. 由于gH-五聚体复合物的UL128/UL130/UL131A组分在感染期间可诱导极强的中和抗体，因此含有gH的蛋白质复合物最近作为潜在疫苗受到关注[11]. 然而，这些抗体的活性有限，因为它们可以抑制感染体外内皮细胞、一些上皮细胞和原代细胞滋养层细胞，但在预防成纤维细胞感染方面完全无效，并显著降低了对包括滋养层祖细胞在内的其他细胞类型的中和活性[11–13]. 虽然在临床前模型中用五聚体复合物接种疫苗已反复证明能诱导中和抗体，但针对人类五聚体复合体的抗体的保护效力仍有待证明[14,15].

糖蛋白B代表疱疹病毒（包括HCMV）的病毒融合蛋白[16]. 它对于感染所有类型的靶细胞至关重要。因此，gB仍然是纳入人类疫苗的一个有吸引力的目标，并且一直是实验性疫苗接种策略的主要重点。事实上，一项针对产后HCMV阴性妇女的佐剂重组gB疫苗（gB/MF59）的疗效研究表明，其对HCMV感染的保护效果约为50%[17]. 另一项对使用相同疫苗的实体器官移植受者进行的二期研究显示，在控制高危患者的病毒血症方面有50%的疗效[18]. 此外，在恒河猴中接种gB疫苗以及随后的RhCMV挑战试验表明，血浆中的RhCMCV DNA显著减少[19]. 用表达小鼠巨细胞病毒糖蛋白B的复制缺陷型腺病毒载体进行粘膜免疫诱导粘膜和系统免疫[20]. 最后，许多使用豚鼠模型的研究表明，采用gB DNA或重组蛋白亚单位疫苗接种策略可以降低幼鼠的先天性感染和死亡率[21–23].

人类gB疫苗试验中保护作用有限的原因尚不清楚，可能有很多方面。其中一个原因可能是诱导中和抗体与非中和抗体的不良比率，在某些情况下甚至可能是竞争性结合物。现有数据表明，接种gB/MF59疫苗可诱导高滴度的结合抗体，但中和抗体的滴度更有限[24,25].

早期研究表明，被动转移MCMV感染小鼠的免疫血清可以保护受体小鼠免受同源病毒的致命攻击[26,27]. Farrell和Shellam使用靶蛋白未明确鉴定的单克隆抗体观察到免疫活性小鼠的一些保护作用[28]. 此外，Jonjic及其同事证明，B细胞和最有可能的抗体在限制重新激活病毒传播方面起着关键作用，从而限制了反复感染[29]. 我们自己以前的研究提供了证据，证明抗体可以保护受感染新生小鼠的大脑免受MCMV诱导的病理损伤[30]. 此外，我们可以证明在免疫缺陷的RAG中-/-小鼠，过继转移记忆B细胞或免疫血清，即使在感染后3天给药，也能降低器官中的病毒载量，从而显示出治疗潜力[31]. 在这些使用来自免疫供体的多克隆血清的研究中，保护性抗体的特异性和保护机制尚未确定。我们已经开始研究，以确定各种抗gB抗体在小鼠CMV模型中的保护作用。与HCMV一样，gB代表MCMV感染期间的主要抗体靶点。产生了一组抗gB的单克隆抗体，并对其进行了表征体外及其抗病毒能力体内已进行调查。我们的数据表明，中和性抗gB抗体的治疗应用比非中和性抗体更有可能限制病毒传播。当给予预防性治疗时，中和抗体和非中和抗体显示出相似的保护能力。In-vitro公司中和性抗gB抗体在限制病毒细胞间传播方面表现出更大的活性，这可能是其增强保护作用的一种机制体内.

结果

gB特异性单克隆抗体的分离

为了分析抗gB抗体的潜在保护能力体内，我们产生了许多gB-特异性单克隆抗体。本实验的主要目的是分离具有不同抗病毒能力的单克隆抗体体外，我们使用了两种实验筛选策略：

  1. 筛选来自MCMV感染动物的杂交瘤用于中和和随后鉴定gB特异性
  2. 通过免疫荧光分析筛选来自MCMV免疫动物的杂交瘤，以识别瞬时表达的gB。

这种方法分离出了一些具有不同抗病毒活性的gB-特异性单克隆抗体体外(表1). 通过病毒中和试验筛选出的单克隆抗体的50%抑制浓度（IC50）值为1–4μg/ml。这些IC50值与针对HCMV gB的人单克隆抗体相似[11,32,33]. 利用瞬时表达的gB结合试验鉴定的大多数单克隆抗体的IC50大于20μg/ml。这些单克隆抗体被归类为非中和型。

表1

糖蛋白B特异性单克隆抗体的中和能力。
抗体IgG亚类国际资本50*IC80系列*来源屏幕
18A5型IgG2a抗体>20未注明日期Balb/c公司结合
20小时7IgG3>20未注明日期Balb/c公司结合
2012年1月5日IgG2a抗体>20未注明日期Balb/c公司结合
10年上半年IgG1>20未注明日期Balb/c公司结合
97.3IgG2c1–23–5C57BL/6型纳特
11米IgG2b型1–22–4C57BL/6型纳特
27.7IgG2c1–24–6C57BL/6型纳特
11层IgG2c2–44–6C57BL/6型结合

*在MEF上测定中和作用，输入病毒50%和80%的中和浓度以μg/ml为单位。数值代表独立获得的mAb制剂的几个独立测试的平均值。n.d.：未定义为浓度高达50μg/ml时未达到80%的中和。筛选：通过结合gB或中和（nt）筛选杂交瘤上清液。在所有动物的所有检测中，MCMV157luc被用作报告病毒。当MCMVlucMCK2用作报告病毒时，中和mAb的IC50是相似的。

为了获得关于gB内结合区域的更多信息，对单克隆抗体与MCMV gB上不同抗原区域的结合进行了表征。作为生成可能含有抗体结合位点的gB片段的蓝图，我们遵循了一种用于识别HCMV gB构象表位的策略[34,35]. 首先，基于与HCMV gB的同源性和HCMV gB的晶体结构，生成了MCMV gB的三维模型[36](图1A–1C). 在氨基酸水平上，HCMV gB和MCMV gB>50%的同源性，因此可以生成MCMV gB的3D模型。MCMV gB中也发现了人类疱疹病毒gB之间保守的结构域（Dom），即DomI-V(图1A–1C). 该模型还揭示了先前在HCMV gB中鉴定的抗原结构域（AD-1、AD-4、AD-5）的整体结构相似性(图1A–1C) [32,34].

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MCMV gB及其单克隆抗体。

（A） MCMV gB及其结构域的线性表示。代表单个结构域的区域以不同颜色显示，类似于HCMV gB晶体结构[36]. TM：跨膜区。数字表示域的开头。指出了与HCMV gB上识别的结构域相对应的抗原区域（AD）。（B） 单体gB域结构的3D带状模型根据（A）着色。（C） MCMV gB模型三聚体的可接近表面表示，两个原聚体分别着色为浅灰色和深灰色，一个单体着色如a.（D）抗gB单克隆抗体列表及其在gB上的结合区域。中和抗体以粗体显示。

为了确定单抗结合结构，通过在哺乳动物细胞中瞬时表达产生HCMV的AD-1、AD-2、AD-4和AD-5对应的蛋白区域以及gB的较大片段，并在间接免疫荧光分析中测试单抗结合[32,34,35]. 虽然没有分离出与AD-2或AD-5反应的单克隆抗体，但与AD-1结合的单克隆Ab 5F12和与AD-4结合的单抗1F11、10H10和M11(图1D). 此外，结合mAb 97.3需要表达gB的NH-末端部分（残基1-488），而18A5需要表达完整的gB蛋白以进行识别。因此，我们的单克隆抗体小组由与MCMV gB不同区域结合的具有不同中和能力的抗体组成。

gB-特异性单克隆抗体的治疗潜力体内

在第一个系列中体内实验中，我们在治疗环境中分别检测了单克隆抗体以保护其免受MCMV感染。在这些实验中，我们使用了一种与我们之前的研究类似的方案，该方案证明了通过过继转移MCMV免疫供体动物的多克隆血清来保护免疫缺陷小鼠免受MCMV感染的致命过程[31]. RAG公司-/-没有功能性B和T细胞的小鼠感染了10只5MCMV157luc的pfu和3天后用单克隆抗体或免疫血清治疗。在感染后第10天（p.i.）处死小鼠，并量化器官中的病毒载量。与对照组相比，用中和单克隆抗体治疗的动物的所有器官中的病毒载量都降低了，除肺外，所有器官的这种影响都达到了统计学意义(图2). 然而，与用MCMV-免疫供体动物的多克隆血清（补充S1图). 有趣的是，单克隆抗体治疗能够显著降低唾液腺的病毒载量，唾液腺是与啮齿动物水平病毒传播有关的主要器官。

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RAG病毒载量-/-用中和抗体治疗后的小鼠。

小鼠感染了10只5pfu MCMV157luc，并在感染后三天用所指示的mAb处理。每只动物共注射250μg IgG或200μl血清。感染10天后，通过基于荧光素酶的分析测定含有30μg蛋白质的器官匀浆等分样品中的病毒载量。RLU：相对灯光单位。统计数据：使用Bonferroni的多重比较检验进行的单向方差分析*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，****：p<000001。虚线：检测限。来自3个独立实验的代表性数据。除图中所示的统计数据外，M11/97.3与27.7/1F11在肝脏（p<0.05）、肾脏（p<0.01）和唾液腺（p<0.05）方面也存在统计差异。肺部差异无统计学意义。

尽管检测时中和活性相当，但用单克隆抗体97.3或M11治疗比单克隆抗体27.7和1F11治疗的病毒载量减少更多体外(表1) (图2). 不同的潜在解释体内当分析经单克隆抗体处理的动物的血清时，发现其活性为97.3和M11，而不是27.7和1F11体外中和后一天和四天体内行政管理。注射单克隆抗体一天后，大多数动物的血清以1:10的稀释度达到100%中和，但用抗体1F11处理的动物除外，其中只有两只动物的血清达到完全中和(图3). 抗体转移后第四天，100%体外用单抗97.3或M11处理过的动物血清仍能中和(图3). 相比之下，用mAbs 27.7或1F11处理的动物的血清显示较低水平体外只有一只动物的中和滴度超过50%。剩余血清的中和滴度在1:10的稀释度下远低于50%(图3). 因此，最可能的解释是体内与27.7相比，在97.3和M11之间具有保护作用，而1F11是指用mAbs 27.7和1F11处理的感染动物的血清中抗体浓度降低。与这一解释相一致的是，发现血清中和活性的下降与器官中病毒滴度的降低（补充S2图).In-vitro公司用免疫血清治疗的动物血清的中和滴度在第1-4天也有所下降，但在四只动物中有三只的稀释度为1:10时，中和滴度超过50%。

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过继转移单克隆抗体后血清的中和滴度。

在注射单克隆抗体或免疫血清后1天和4天，从感染小鼠中获取血清。测定中和效价体外使用MCMV157luc对小鼠胚胎成纤维细胞进行体外培养。接受相应mAb的个体小鼠用数字和颜色表示。虚线：50%中和。

在接下来的一系列实验中，对非中和单克隆抗体的抗病毒活性进行了测试体内在服用非中和性抗gB抗体后，也观察到病毒载量在每次注射10天时减少(图4). 虽然病毒载量的减少达到了统计学意义，但非中和性单克隆抗体的整体抗病毒效果不如中和性单抗显著。病毒载量的减少程度在1-10倍的范围内（补充S3图)相比之下，服用最有效的中和单克隆抗体（补充S1图). 这对于唾液腺中的病毒载量尤其明显，与对照免疫血清的活性相比，唾液腺中只有一个非中和单克隆抗体（20H7）能够显著降低病毒载量(图4).

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RAG病毒载量-/-非中和抗体治疗后的小鼠。

小鼠感染了10只5pfu MCMV157luc，并在感染三天后使用指示抗体进行治疗。每只动物共注射250μg IgG。感染10天后，通过基于荧光素酶的分析测定含有30μg蛋白质的器官匀浆等分样品中的病毒载量。RLU：相对灯光单位。统计数据：使用Bonferroni的多重比较检验进行的单向方差分析*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，****：p<000001。虚线：检测限。来自2个独立实验的代表性数据。

我们还测试了单克隆抗体联合治疗是否会导致体内保护性活动。为了排除与同一表位竞争结合的单克隆抗体的应用，首先在竞争分析中测试了单克隆抗体，只有未表现出竞争结合的组合单克隆抗体体外（补充S4图). 动物接受两种最有效的中和抗体（97.3和M11）或两种非中和抗体（18A5和20H7）的组合或全部四种抗体的组合。在所有组合中，注射到动物体内的IgG总量为250μg/只。如图所示图5A与多克隆免疫血清的活性相比，mAbs 97.3和M11组合在降低病毒载量方面同样有效。单克隆抗体组合的病毒载量相对减少与免疫血清相当，且优于单克隆抗体单一疗法（补充S5图). 相反，联合使用非中和性单克隆抗体在减少病毒负荷方面效果较差，尽管与对照IgG2a相比，其达到了统计学意义(图5A). 同时应用中和和非中和单克隆抗体可产生中间保护作用，这可以通过减少在这四种抗体组合中转移的中和抗体的数量来实现。

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RAG病毒载量-/-抗体组合治疗后的小鼠。

（A） 小鼠感染了10只5pfu MCMV157luc，并在感染三天后使用指定的单克隆抗体组合进行治疗。（B） 小鼠感染了10只5pfu MCMV-lucMCK2，并在感染后一天使用指定的单克隆抗体组合进行治疗。每只动物总共注射250μg IgG。感染10天后，通过基于荧光素酶的分析测定含有30μg蛋白质的器官匀浆等分样品中的病毒载量。RLU：相对光单位。编号：M11+97.3；nnt:18A5+20H7；混合物：M11+97.3+18A5+20H7。MCK-：含有MCK2突变的MCMV，MCK+：携带完整MCK2基因的MCMV。统计数据：使用Bonferroni的多重比较检验进行的单向方差分析*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，****：p<000001。虚线：检测限。来自3个独立实验的代表性数据。

上述实验中使用的MCMV157luc重组病毒是Messerle等人描述的原始BAC结构的衍生物[37]. 然而，研究表明，由此产生的病毒在编码MCK2的基因中携带突变，从而导致细胞向性和体内病毒传播，特别是传播到唾液腺[38]. 为了探讨完整MCK2基因的存在是否会影响单克隆抗体保护实验的结果，用修复的MCK2基因组构建了一种新病毒（称为MCMVlucMCK2）。然后在保护实验中将该病毒与MCMV157luc病毒进行比较。重要的是，与MCK2突变病毒相比，中和mAbs 97.3与M11组合对携带完整MCK2基因的病毒具有相似的保护能力。两种重组病毒的MCMVlucMCK2向唾液腺的传播均相对减少，表明修复的基因型（MCK+）在传播过程中不影响病毒对抗体中和活性的抗体敏感性(图5B).

单克隆抗体对病毒传播的影响体外

为了确定这些抗体的潜在保护机制，我们进行了单克隆抗体介导的斑块抑制试验体外该试验被选为单克隆抗体对病毒细胞间传播影响的替代活性体内我们使用了重组病毒MCMVC3X-gfp，它是Messerle等人描述的BAC的衍生物或原始BAC[37]在HCMV IE增强子的控制下表达绿色荧光蛋白（GFP），从而可以直接观察活感染细胞[39]. 感染小鼠成纤维细胞，4小时后添加单克隆抗体或血清，并在第3天至第7天p.i.期间监测活细胞中的斑块形成。在没有抗体的情况下，p.i.第3天只观察到单个GFP表达细胞，而p.i.在第5天可以清楚地看到斑块的形成，并且在p.i.的第7天形成含有大量荧光细胞的斑块(图6). 如使用20H7或18A5单克隆抗体的检测结果所示，添加非中和单克隆抗体对斑块形成几乎没有影响（如果有的话）(图6). 在中和单克隆抗体组中，M11完全阻止了斑块的形成，而剩余的单克隆抗体明显减少了每个斑块的感染细胞数，包括单克隆抗体97.3(图6). 多克隆免疫血清对斑块内感染细胞的数量具有中间作用，而幼稚小鼠的血清在本试验中未能限制斑块的形成。

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抗体存在时牙菌斑形成。

用2000 pfu/孔MCMV C3X-gfp感染96孔板中的小鼠胚胎成纤维细胞。感染后4小时取出接种物，并添加指示的抗体。感染后第3、5和7天在活细胞中监测斑块的发展。单克隆抗体浓度：20μg/ml，血清稀释度1:100。第7天从5-7个斑块中统计感染细胞数，发现（平均值和范围）：无抗体：25.5（17-38）；免疫血清：4.6（3-7）；非免疫血清：10.9（4～18）；M11：1.4（1–2）；97.3: 7.0 (4–11); 20时7分：14.0秒（5-29秒）；18A5（10–18）。统计：（使用Bonferroni多重比较试验的单向方差分析）M11与无抗体：p<0.001；M11与20H7相比：p<0.01；M11对18A5：p>0.01；M11与血清免疫：未另行说明。；M11与血清初始值：不另作说明。

gB-特异性单克隆抗体的预防能力

接下来，我们测试了感染前转移的单克隆抗体组合的保护能力。RAG公司-/-在感染10只小鼠前一天，给予小鼠250μg总IgG4pfu MCMV157luc公司。在第10天、第17天和第24天采集血液，并通过实时定量PCR（qPCR）对病毒DNA进行定量。在PBS处理的小鼠中，DNA拷贝数从第10天的约500拷贝增加到第24天的>40000拷贝/微克总DNA，表明病毒血症正在持续(图7). 在免疫血清处理的小鼠中，在一些动物中可以检测到低拷贝数（2-10）的病毒DNA。应用单克隆抗体组合，无论是中和还是非中和，都能在p.i.的任何时间点清除血液中的病毒DNA(图7A). 接下来，我们利用MCK2+病毒（MCMVlucMCK2）重复了该实验，以确定MCK2病毒基因的存在是否会导致感染小鼠的病毒复制和发病机制发生改变，从而改变预防方案中使用的单克隆抗体的抗病毒活性。与MCK2-病毒相比，感染MCK2+病毒导致血液中病毒DNA拷贝数增加。受感染动物血液中MCK+病毒拷贝数的增加并不意外，因为MCK2已被证明会增加受感染白细胞的数量，并促进单核细胞/巨噬细胞的募集和感染[40–42]. 然而，重要的是，应用中和或非中和单克隆抗体后，动物体内的病毒载量与免疫血清的活性相似，这再次表明预防性使用这两类抗体时具有相似的抗病毒活性。(图7B)

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预防性应用后单抗组合的保护能力。

在感染10只小鼠前一天，每只小鼠共注射250μg IgG（M11+97.3或18A5+20H7）或200μl血清/PBS4MCMV157luc（A）或MCMVlucMCK2（B）的pfu。在指定的时间点采集血液并进行qPCR。抗体治疗组n=4，PBS治疗组n=3。数值代表一组内所有小鼠的平均值（SEM）和每个样品的重复测定值。MCMV基因组拷贝数为每1μg总DNA的拷贝数。检测限：1拷贝/50ng总DNA。

在第二种实验方法中，在感染原始MCMV157luc病毒并预防性服用另一组抗gB单克隆抗体（即疗效较差的中和性单克隆抗体1F11或非中和性单抗5F12）后监测存活率。用对照IgG2a治疗的小鼠在第40天p.i.死于感染（补充S6图). 相比之下，大约80%接受gB-特异性单克隆抗体或免疫血清的小鼠在感染后存活到第100天。同样，在预防性给药时，非中和性单克隆抗体5F12在延长感染小鼠生存期方面与中和性单抗1F11同样有效。

综上所述，这些数据表明，感染前抗体的存在可以产生显著的保护能力，这在很大程度上独立于体外抗体的中和活性。

讨论

我们之前已经证明，MCMV感染动物的血清可以保护B和T细胞缺陷宿主免受致命的MCMV感染，从而证明免疫血清中存在的被动获得的抗体具有保护作用体内在没有德诺沃对MCMV的适应性反应[31]. MCMV感染期间诱导的抗病毒抗体反应是复杂的，包括对大量病毒结构蛋白和病毒编码非结构蛋白的抗体反应。只有其中一些反应是可以测量的体外和/或体内抗病毒效应器活性，研究最充分的抗病毒反应是针对包膜糖蛋白。在MCMV和HCMV感染后，可以证明抗gB、gH/gL和gM/gN抗体反应，并且抗gB，gH或gN抗体已被证明可以中和病毒体外[10]. 在HCMV的病例中，针对由gH/gL/UL128/UL130-131a组成的五聚体复合物的抗体显示出强大的效力体外利用上皮细胞和内皮细胞靶点以及有限数量的其他细胞类型进行检测时的中和活性，但在更宽容的细胞类型（如成纤维细胞）中没有[11–13]. 虽然我们已经从MCMV感染小鼠中分离出抗gH和抗gN病毒中和抗体，但当前研究的目的是评估gB特异性单克隆抗体的保护潜力，以模拟gB抗体在HCMV感染期间的作用，因为gB是HCMV传染期间诱导抗体的主要抗原。此外，我们研究了体内中和性和非中和性抗gB抗体的活性，因为这两种抗体都是在HCMV感染期间诱导的[32].

选择用于研究的抗体包括两组分类的单克隆抗体体外中和或非中和抗体体外这些活性作为MCMV感染小鼠的抗gB反应样本具有代表性。这种不同的抗病毒活性也与描述HCMV抗病毒中和和非中和抗gB抗体的研究数据一致[32]. 此外，MCMV gB特异性单克隆抗体识别的抗原区域与抗-HCMV gB单克隆抗体的抗原区域相似，进一步支持MCMV感染小鼠抗gB抗体反应的保护活性研究结果的相关性，作为抗gB疫苗在HCMV感染中作用的模型[32,43].

在旨在确定抗gB单克隆抗体治疗潜力的实验中，我们采用了一种严格的方案，即在免疫缺陷RAG感染后三天给予gB单抗-/-10只老鼠5MCMV157luc的pfu。每只动物体内转移的抗体量大致相当于10毫克/千克，这是一种人类临床使用的抗体浓度[44,45]. 在RAG中-/-除了B细胞和T细胞缺陷外，由于m157基因的缺失，NK细胞对病毒的控制在很大程度上被消除了，该基因编码NK活化配体[46]. 在感染后10天的实验时间范围内，巨细胞病毒已传播到包括唾液腺在内的所有器官，唾液腺是巨细胞病毒免疫逃避和持续存在的特殊解剖部位，与巨细胞病毒的水平传播有关[47]. 中和单克隆抗体单用治疗显示，除肺部外，所有受试器官的病毒载量均显著降低。有趣的是，通过被动转移病毒中和抗体，唾液腺中的病毒载量也显著降低，这表明在继发性病毒血症期间抑制了病毒传播[48]. 病毒载量的减少与治疗动物血清中保持的单克隆抗体浓度定量相关。接受单克隆抗体的动物表现出加速体内与使用抗体治疗的动物相比，血清浓度的下降（如27.7和1F11）受到的保护较差，抗体维持了持续的单抗浓度。我们只能推测不同单克隆抗体血清衰变差异的原因体内因为这个过程很复杂，但明显的机制可能包括非靶向结合和/或免疫复合物的形成，从而提高IgG的清除率[49]. 在以下方面存在显著差异体内在其他系统中也观察到了输入IgG的半衰期[50]. 无论MCMV感染小鼠血清中mAb清除增加的机制如何，我们的研究结果表明，在感染小鼠中，单克隆抗体单一治疗可使循环MCMV中和抗体持续高滴度，从而显著保护免疫缺陷小鼠免受致命MCMV的感染。重要的是，这一发现确立了体内抗病毒抗体的特性，这是对病毒传播进行最佳保护所必需的，并认为简单地将抗体分为中和和非中和体外化验可能不能完全预测体内抗病毒活性。

使用非中和抗体的研究结果表明，强效抗体并非绝对必要体外中和活性以实现保护体内虽然非中和性单克隆抗体给药后病毒载量的减少小于中性单克隆抗体转移后的减少，但18A5和20H7等抗体的病毒载量减少仍具有统计学意义（与补充S1（第一阶段）和第3章图）。与中和单克隆抗体治疗后的结果类似，我们观察到单克隆抗体在减少单克隆抗体处理动物的病毒载量方面的不同活性。差动保护是否也基于体内单个单克隆抗体的血清浓度无法测定，因为我们没有定量分析来具体量化这些单克隆抗体在血清中的浓度。无论如何，非中和性单克隆抗体提供了显著的保护体内在没有明显的体外中和活性。以前也观察到非中和抗体可以保护病毒感染[51]最近已成为研究抗流感病毒和艾滋病毒感染的保护性抗体的一个重要领域[52,53].

与我们的单克隆抗体小组的保护相关的效应器功能可能很复杂，目前尚不确定。抗体Fc片段与Fc受体承载细胞的相互作用，导致抗体依赖细胞介导的细胞毒性（ADCC）或抗体依赖细胞吞噬作用（ADCP）可能是重要的机制（综述于[54]). 然而，单个Fc受体分子对不同IgG亚类分子的亲和力已被证明是不同的。因此，对于我们的代表不同IgG亚类的单克隆抗体小组，Fc-受体相互作用的贡献可能不同。例如，20H7作为IgG3，不会与任何已知的Fc受体结合[55]. 此外，CMV还表达病毒编码的Fc受体分子，这可能会使Fc受体依赖性抗病毒抗体活性对我们的研究结果的解释更加复杂（参见[56]).

最后，除了Fc受体结合，补体激活体内也可能对我们小组中的一些单克隆抗体有效。然而，单个IgG亚类的补体结合和激活也不同（参见[57]). 此外，包括巨细胞病毒在内的疱疹病毒已经开发出许多策略来逃避补体介导的功能。其中包括在病毒粒子中加入补体控制蛋白或抑制补体介导的裂解[58,59].因此，需要进行额外的研究来阐明我们小组中代表的单克隆抗体提供保护的机制。

病毒传播的潜在重要机制体内是通过细胞间传播，这种机制可能受到抗病毒抗体的限制。疱疹病毒，包括巨细胞病毒，被认为有能力传播到邻近的细胞而不必通过细胞外空间传播[60]. 如果是巨细胞病毒感染，体内细胞间传播被认为是病毒传播的主要途径。然而，巨细胞病毒在细胞间传播的途径和分子机制体内仍然定义不清[61,62]. 不管细胞间传播的机制如何，体外使用斑块形成/扩张的研究被认为是细胞间传播的替代物。我们的数据表明，MCMV的细胞间传播可以被一组中和活性相当的单克隆抗体中的抗病毒抗体子集抑制体外对于无细胞病毒，这表明抑制细胞间传播所需的单克隆抗体活性可能与中和无细胞病毒感染所需的抗体特性不同。与病毒中和单克隆抗体的附加效应器功能相一致的是，M11和97.3的组合在体内保护作用大于单独转移的抗体。然而，协同作用体外无法证明这两种抗体之间的病毒中和作用（补充S7图). 此外，当两种抗体联合使用时，血清中和能力以及浓度体内中和活性与用单个抗体（补充S7图). 然而，当与体外斑块形成抑制试验表明它们的作用方式体内除中和游离病毒外，可能有所不同，并可能与单克隆抗体组合的保护活性增加有关。最后，我们的研究结果还表明，抑制斑块形成体外可能代表一种更具信息量的预测分析体内保护比中和能力由体外使用无细胞病毒进行检测。

也许这项研究中最有趣和最出乎意料的发现之一是，对于所测试的单克隆抗体组体内当这些单克隆抗体用于预防方案时，非中和和中和单克隆抗体之间的抗病毒活性。此外，使用来自这些单抗组合的单抗进行单药治疗，也能显著保护RAG患者免受致命感染-/-老鼠。虽然这些结果需要进一步研究，以确定该模型系统中中和和非中和抗体提供的保护机制，但有几种可能的解释可以解释这些结果。重要的是，在治疗方案中使用单克隆抗体时，初级病毒接种和已确定的感染之间的抗体-病毒相互作用存在根本区别。在我们的实验中，病毒通过腹腔接种，游离病毒在最初的几个小时内通过造血途径传播到脾脏和肝脏[63]. 因此，传播病毒与循环抗病毒IgG接触。由于中和和非中和单克隆抗体都能与游离病毒结合，因此通过Fc介导的抗体效应器功能可以防止第一个感染细胞靶点的感染。当抗体包被的病毒被运输到富含携带Fc受体细胞的脾脏等结构时，它可以通过Fc介导的效应器功能被清除。在这些早期感染事件中，抗体是否具有中和功能对其保护作用的重要性可能较小。病毒中和活性在控制病毒在感染期间（即在受感染组织中的细胞间传播和/或继发性病毒血症期间）的后期传播中发挥更重要的作用。

使用佐剂gB在人类中进行的疫苗接种试验提供了相互矛盾的证据，证明其对HCMV的社区获得具有保护作用[17]. 在初始报告中，三剂gB疫苗限制了一组女性获得HCMV，尽管观察到疫苗接种者和安慰剂对照组之间存在差异，但两组之间的统计差异并不显著[17]. 在一项针对青少年女性的后续疫苗试验中，gB疫苗接种者和安慰剂接种者之间的HCMV感染率没有统计学上的显著差异[64]. 相反，我们的发现表明抗gB抗体具有强大的保护能力体内尤其是用作预防措施以限制感染时。有几种解释可以解释这种差异：

  1. 用佐剂gB疫苗免疫可诱导高滴度的gB结合抗体，但在所报告的疫苗试验中未对中和抗体的滴度进行系统研究[25,64].
  2. 佐剂gB疫苗中的疫苗抗原并不代表天然gB形式。它被设计成截短蛋白以增加溶解度并简化其生产。此外，蛋白水解裂解位点发生突变，以消除外结构域和跨膜结构域之间的蛋白水解裂解。这些修饰导致了gB的融合后构象，这种构象可能与融合前构象有很大不同[16,65]因此，与感染期间产生的抗gB抗体相比，可能诱导一组不同的抗体，包括针对病毒表面的抗体，例如我们研究中使用的抗体。
  3. 疫苗蛋白在佐剂中乳化，与我们使用非佐剂病毒的研究相比，佐剂可以进一步改变蛋白构象。
  4. HCMV gB株变异可能限制了疫苗诱导抗体的保护能力，尽管在氨基酸水平上，gB是HCMV株之间高度保守的蛋白质[66].

总之，我们的研究提供了令人信服的证据，证明在感染后或用完整病毒免疫后产生的针对MCMV gB的抗体子集可以提供显著的保护体内当以预防或治疗方案转移至MCMV感染小鼠时。有效的体外中和作用似乎不是产生这种效果的绝对前提。疫苗接种后是否能产生具有这些特异性和活性的抗体将在未来的研究中进行调查。

材料和方法

老鼠

RAG公司-/-小鼠是从查尔斯河小鼠的内部繁殖中获得的，并在特定的无致病条件下进行饲养。在涉及单克隆抗体治疗应用的实验中，小鼠感染了1 x 105腹腔（i.p.）感染MCMV157luc或MCMVlucMCK2的斑块形成单位（pfu）。在涉及预防性应用抗体的实验中，104使用了pfu MCMV157luc或MCMVlucMCK2。In-vivo公司生物发光成像完全按照描述进行[31].

道德声明

所有实验均按照动物护理和使用的机构指南进行。这些实验得到了Regierung von Mittelfranken（法兰克尼亚政府）54–2532.1-57/12号批准，并符合EEC理事会指令2010/63/EU。爱尔兰根-纽伦堡大学的动物设施由美国卫生与公共服务部批准，批准号为A5903-01。

细胞和病毒

小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）和ST-2细胞在补充有10%胎牛血清（FCS）（Sigma-Aldrich，德国）、谷氨酰胺（100 mg/ml）和庆大霉素（350 mg/ml）的DMEM培养基（德国Life Technologies）中培养。

所有病毒株均来自Messerle描述的原始MCMV BAC[37]. MCMV157luc按照描述进行繁殖和纯化[31]. 根据Jordan等人的报告，MCMV157luc中的MCK2突变被修复[38]导致病毒MCMVlucMCK2。用间接免疫荧光终点滴定法测定病毒滴度。简单地说，病毒制剂的系列稀释液用于感染接种在96个培养皿（12000个细胞/孔）中的MEF。两天后，用乙醇固定细胞，用单克隆抗体Croma101对感染细胞进行染色和定量，该单克隆抗体对MCMV的病毒即刻早期蛋白1具有特异性。MCMV-C3X-gfp在HCMV即刻早期启动子的控制下表达绿色荧光蛋白（gfp），是德国汉诺威M.Messerle赠送的礼物[39].

单克隆抗体的产生、IgG亚类的测定和生物素化

用常规杂交瘤技术从受感染或免疫供体小鼠的脾脏中产生永生抗体产生的B细胞系。简言之，C57BL/6小鼠腹腔内感染1x106感染后4-6周采集pfu MCMV157luc和脾细胞。在脾脏收获前一周，用5μg紫外线活化的MCMV157luc病毒增强动物。根据该方案，从三种不同的融合中获得Mabs 1F11、27.7、M11和97.3。从采用相同方案治疗的Balb/c小鼠中分离出单克隆抗体18A5、20H7。Balb/c小鼠免疫后获得单克隆抗体5F12和10H10（静脉注射紫外线活化的MCMV157luc病毒，每次3次，每次5μg，注射间隔至少4周）。最后一次免疫后3-4天，取出脾脏，并取出脾脏细胞（100–200 x106供体小鼠的细胞）与50–100 x 10融合6SP2.0细胞。细胞接种在96个F-底部细胞培养微孔板中，每孔150μl培养基中。8–10天后，在ELISA中测试上清液的中和作用（来自受感染的小鼠）或病毒结合抗体（来自用紫外线活化病毒免疫的小鼠）。使用Beckman Coulter MoFlo细胞高速分选机®对感兴趣的克隆进行亚克隆。在额外的几轮亚克隆后，杂交瘤上清液通过ELISA、使用瞬时表达的gB的间接免疫荧光和中和进行了表征。单克隆抗体由蛋白A层析内部纯化或由美国BioXCell公司制备和纯化。

在标准ELISA分析中，使用小鼠免疫球蛋白小组（德国南方生物技术公司，分类号：5300–01）和IgG2c同型控制抗体（美国基因技术公司，类别号：GTX35043）作为包衣试剂来测定IgG亚型。在96孔板中以100ng/孔的浓度包被标准IgG，并与杂交瘤上清液的未稀释样品进行比较。根据制造商的建议，使用Southern Biotech SBA克隆分型系统-HRP（分类号：5300–05）进行检测，并辅以山羊抗鼠IgG2c HRP检测IgG2（Southern-Biotech分类号：1079–05）。根据制造商的说明，使用EZ Link®Sulfo-NHS生物素化试剂盒（德国赛默飞世尔科技公司）对纯化的单克隆抗体（每个500μg）进行生物素化。以单克隆抗体为包被试剂，HRP偶联链霉亲和素为检测试剂，在ELISA检测中证实了生物素化。

器官荧光素酶活性的测量

采集器官并在液氮中快速冷冻。为了测定病毒滴度，使用Precellys 24均质器（德国Peqlab Biotechnologie）在Glo Lysis Buffer（德国普罗米加）中解冻器官并均质。将匀浆在4°C、16000xg下离心10分钟，并使用BCA蛋白质检测试剂盒（德国Perbio Science）测定上清液中的蛋白质浓度。将含有30μg裂解产物蛋白的30μl Glo裂解缓冲液转移到白色96孔LIA-plates中（Greiner Bio-one，德国）。50μl测定缓冲液（15mM KH2人事军官4，25 mM甘氨酰甘氨酸，1 M MgSO4每口井增加0.5 M EGTA、5 mM ATP、1 mM DTT）。每孔注入50μl D-荧光素（德国P.J.K.）溶液（在25 mM甘氨酸、1 M MgSO中4（0,5 M EGTA、2 mM DTT和0,05 mM D-荧光素），并使用Centro LB 960光度计（德国Berthold Technologies）进行化学发光检测。使用MicroWin2000软件（德国Mikrotek Laborsysteme）进行分析。

实时定量PCR检测病毒DNA拷贝数

为了测量外周血中的病毒拷贝数，使用QIAamp DNA血样试剂盒根据制造商的协议（德国QIAgen）从200μl EDTA血液中分离出DNA。对于MCMV特异性qPCR，将50 ng分离的DNA置于含有10μl 2x TaqMan PCR Mastermix（德国Applied Biosystems）、10μM探针和5μM每个引物的20μl反应混合物中。用于检测MCMV的引物和探针基于MCMV ie1/4外显子4序列（正向引物：5′-TGCATACCAGCTGA-3′；反向引物：5'-GGCTTCATGATCCCTGTT-3′；探针：5′-CTGGCAAAGCTGT-3′）。

In-vitro公司中和试验

对于体外血清或单克隆抗体的中和、系列稀释液与1200 pfu MCMV157luc孵育1h。将混合物添加到ST-2细胞中，ST-2细胞以1.2x10的密度接种4前一天在96维板块。培养4h后，更换培养基，感染持续48h。随后在100μl溶血缓冲液中溶解细胞，并使用30μl如上所述测量荧光素酶活性。血清未经热灭活，也未添加外源性补体。

瞬时蛋白表达和图像分析鉴定MCMV gB上的结合区

为了表达MCMV gB，将orf m55菌株Smith（GenBank登录号NC_004065.1）的编码序列插入pcDNA3。通过将合适的DNA片段插入载体pcUL132-sig-HA构建编码gB片段的质粒。这个基于pcDNA3.1（Invitrogen，德国）的质粒包含HCMV gpUL132真实信号序列aa 1–27的编码序列，然后是HA-epitope YPYDVPDYA的编码序列[67].

Cos7电池（5x104使用Lipofectamine（Invitrogen，德国）转染0.8μg质粒DNA。转染48小时后，细胞固定并用冰镇甲醇渗透。然后在37°C下添加初级抗体45分钟。通过三个PBS洗涤步骤去除未结合的一级抗体。用适当的FITC-共轭二级抗体（异硫氰酸荧光素）（德国达科）检测一级抗体的结合（37°C下45分钟）。用DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚）对细胞核进行反染色。使用配备Visitron Systems电荷耦合设备摄像头的蔡司Axioplan 2荧光显微镜采集图像（德国普希姆）。使用MetaView软件和Adobe Photoshop处理图像。

菌斑分析

MEF以4x10的密度播种在96 well板（德国伊比迪）中4每口井。24小时后，用2000 pfu/孔的MCMV C3X-gfp离心增强（5min，500xg）感染细胞，以实现同步感染。4h后取出接种物，将细胞培养在含有20μg/ml mAb或1:100稀释度血清的300μl/孔培养基中。从感染后第3天开始，使用徕卡DMI 6000B显微镜记录感染情况。放大倍数：200倍。滤光片：激发488 nm，发射509，曝光时间：40 ms，图片尺寸：640μm x 478μm。

MCMV gB模型的生成

MCMV gB结构的模型是使用程序MODELLER 9.10通过标准同源建模程序生成的[68]基于与HCMV gB模板结构的序列比对（PDB代码：5CXF）。两个环路区域（HCMV gB的Asn409-Gln410和Lys435-Val475）未在参考结构中解析，因此未建模。使用VMD 1.9.1生成图像[69].

统计分析

使用Bonferroni的多重比较测试，使用GraphPad Prism（版本6；GraphPad-Software，USA），通过单向方差分析进行统计分析。

支持信息

S1图

中和单克隆抗体给药后与同型对照相比病毒载量减少的方框图。

用同种型对照品治疗的动物的病毒载量被设置为100%，并用于计算用单克隆抗体或免疫血清治疗的动物中病毒载量的减少。统计数据：使用Bonferroni的多重比较检验进行的单向方差分析*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，****：p<000001。

（PDF格式）

S2图

的负相关体内保护容量体内单克隆抗体的血清半衰期。

将单克隆抗体腹腔注射到小鼠体内，并在注射后第1天和第4天获取血清。In-vitro公司测定血清中的病毒中和活性，并且当在感染后第10天处死小鼠时，相对于肺、肝、唾液腺、肾和脾中病毒载量的减少（与对照感染小鼠相比），显示从第1天到第4天血清的50%中和滴度的衰减。每个符号对应一个器官（八只老鼠的平均数）。单克隆抗体的命名描述在符号队列的上方。血清中抗体的衰变与病毒载量的减少呈负相关（r2=0.48，p<0.001，线性回归）。

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S3图

非中和单克隆抗体给药后与同型对照相比病毒载量减少的方框图。

用同种型对照品治疗的动物的病毒载量被设置为100%，并用于计算用单克隆抗体或免疫血清治疗的动物中病毒载量的减少。统计数据：使用Bonferroni的多重比较检验进行的单向方差分析*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，****：p<000001。

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S4图

gB-特异性单克隆抗体的结合竞争。

根据制造商的建议，使用商业试剂盒（EZ Link®Sulfo-NHS生物素化试剂盒，Thermo Fisher Scientific）对单个单克隆抗体进行生物素化。对生物素化单克隆抗体进行滴定，以确定抗原线性反应范围内的浓度。然后在竞争ELISA中使用固定量的单一生物素化单克隆抗体（b），如x轴所示，使用增加的竞争单克隆抗体浓度。使用HRP-共轭链霉亲和素（德国Thermofisher）检测结合。

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S5图

与免疫血清相比，注射单克隆抗体后病毒载量减少的百分比。

用免疫血清治疗的动物的病毒载量减少被设定为100%，并用于计算用单克隆抗体或单克隆抗体组合M11+97.3（nt组合）治疗的动物病毒载量的减少。

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S6图

预防性应用抗体后的存活率。

每只小鼠在感染104 pfu MCMV157luc前一天应用250μg IgG。对存活率进行100天的p.i.监测。统计：log-rank（Mantel-Cox）检验：p<0.0001。来自2个独立实验的代表性数据。

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S7图

（A） 单克隆抗体97.3、M11和两种单克隆抗体的混合物的中和效价。

（B） 过继转移单抗组合97.3和M11后一天小鼠血清的中和滴度。使用MCMV157luc在体外测定小鼠成纤维细胞的中和滴度。

个体小鼠以数量和颜色表示。虚线：50%中和。

（PDF格式）

资金筹措表

这项工作由德意志联邦基金会拨款GRK 1071和NIH拨款RO1AI089956资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

数据可用性

所有相关数据均在论文及其支持信息文件中。

工具书类

1Kenneson A，Cannon MJ。先天性巨细胞病毒（CMV）感染流行病学回顾与荟萃分析.医学病毒学综述. 2007. 第253–276页。数字对象标识：10.1002/人民币535元[公共医学][谷歌学者]
2路德维希A，亨格尔H。欧洲先天性巨细胞病毒感染的流行病学影响和疾病负担.欧洲监管牛市Eur sur les Mal Transm=Eur Commun Dis牛市. 2009;14: 26–32. [公共医学][谷歌学者]
三。Dreher AM、Arora N、Fowler KB、Novak Z、Britt WJ、Boppana SB等。症状性先天性巨细胞病毒感染儿童的疾病谱和预后.儿科杂志. 2014;164: 855–859. 数字对象标识：10.1016/j.jpeds.2013.12.007 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
4Ramanan P，Razonable RR公司。实体器官移植中巨细胞病毒感染的研究进展.感染化学家. 2013;45: 260–71. 数字对象标识：10.3947/ic.2013.45.260 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
5.Teira P、Battiwalla M、Ramanathan M、Barrett AJ、Ahn KW、Chen M等人。早期巨细胞病毒再激活与当今时代移植相关死亡率增加相关：CIBMTR分析.血液. 2016;127: 2427–2438. 数字对象标识：10.1182/血液-2015-11-679639 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
6Khairallah C、Netzer S、Villacreces A、Juzan M、Rousseau B、Dulanto S等。???? T细胞对小鼠巨细胞病毒（MCMV）的保护作用.公共科学图书馆病理学. 2015;11: 1–22. 数字对象标识：10.1371/日志.ppat.1004702 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
7Leruez-Ville M，Ville Y。先天性巨细胞病毒感染的最佳治疗.专家版抗感染治疗. 2016;14: 479–488. 数字对象标识：10.1586/14787210.2016.1173540[公共医学][谷歌学者]
8普洛金S。巨细胞病毒疫苗接种史.医学微生物学和免疫学. 2015. 第247-254页。数字对象标识：2007年10月7日/00430-015-0388-z[公共医学][谷歌学者]
9.Plotkin公司。疫苗诱导保护的相关因素.临床与疫苗免疫学. 2010. 第1055-1065页。数字对象标识：10.1128/CVI.00131-10号 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
10Mach M、Wiegers AK、Spindler N WT。巨细胞病毒。输入：Reddehase MJ，编辑。凯斯特学术出版社；2013年，第215-231页。[谷歌学者]
11Macagno A、Bernasconi NL、Vanzetta F、Dander E、Sarasini A、Revello MG等。通过靶向gH/gL/UL128-131A复合物上的不同表位来有效中和人巨细胞病毒感染的人单克隆抗体的分离.J维罗尔. 2010;84: 1005–1013. 数字对象标识：10.1128/JVI.01809-09 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
12Zydek M、Petitt M、Fang-Hoover J、Adler B、Kauvar LM、Pereira L等。人胎盘滋养层祖细胞的HCMV感染可通过糖蛋白B单克隆抗体中和，而不是通过五聚体复合物抗体中和.病毒. 2014;6: 1346–1364. 数字对象标识：10.3390/v6031346 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
13Chiuppesi F、Wussow F、Johnson E、Bian C、Zhuo M、Rajakumar A等。人巨细胞病毒gH/gL五聚体疫苗衍生中和抗体有效阻断原发性细胞滋养层感染.J维罗尔. 2015;89数字对象标识：10.1128/JVI.01701-15 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
14Kabanova A、Perez L、Lilleri D、Marcandalli J、Agatic G、Becattini S等。人巨细胞病毒gHgLpUL128L亚单位疫苗的抗体驱动设计.美国国家科学院程序. 2014;111数字对象标识：10.1073/pnas.1415310111 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
15Wussow F、Chiuppesi F、Martinez J、Campo J、Johnson E、Flechsig C等。基于包膜gH/gL五聚体复合物的人巨细胞病毒疫苗.公共科学图书馆病理学. 2014;10数字对象标识：10.1371/日志.ppat.1004524 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
16Cooper RS，Heldwein EE公司。疱疹病毒gB：微调融合机.病毒. 2015. 第6552–6569页。数字对象标识：10.3390/v7122957 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
17.Pass RF、Zhang C、Evans A、Simpson T、Andrews W、Huang M-L等。母体巨细胞病毒感染的疫苗预防.N英格兰J医学. 2009;360: 1191–9. 数字对象标识：10.1056/NEJMoa0804749 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Griffiths PD、Stanton A、McCarrell E、Smith C、Osman M、Harber M等人。移植受者接种MF59佐剂巨细胞病毒糖蛋白-B疫苗：一项2期随机安慰剂对照试验.柳叶刀. 2011;377: 1256–1263. 数字对象标识：10.1016/S0140-6736（11）60136-0 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
19.Abel K、Martinez J、Yue Y、Lacey SF、Wang Z、Strelow L等。疫苗诱导的恒河猴巨细胞病毒攻击后病毒脱落的控制.J维罗尔. 2011;85: 2878–90. 数字对象标识：10.1128/JVI.00883-10 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Shanley JD，Wu CA。用表达小鼠巨细胞病毒糖蛋白B的复制缺陷型腺病毒载体进行粘膜免疫诱导粘膜和全身免疫.疫苗. 2003;21: 2632–2642. 数字对象标识：10.1016/S0264-410X（03）00037-9[公共医学][谷歌学者]
21Cardin RD、Bravo FJ、Pullum DA、Orlinger K、Watson EM、Aspoeck A等人。表达豚鼠巨细胞病毒gB和pp65同源物的复制缺陷型淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒载体可保护豚鼠先天性巨细胞病毒感染.疫苗爱思唯尔有限公司；2016;34: 1993–1999. 数字对象标识：10.1016/j.疫苗2016.03.005[公共医学][谷歌学者]
22Schleiss MR、Choi KY、Anderson J、Mash JG、Wettendorff M、Mossman S等人。AS01或AS02佐剂的糖蛋白B（gB）疫苗在巨细胞病毒挑战模型中保护雌性豚鼠免受巨细胞病毒（CMV）病毒血症和后代死亡率的影响.疫苗. 2014;32: 2756–2762. 数字对象标识：10.1016/j.疫苗.2013.07.010 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
23Chatterjee a、Harrison CJ、Britt WJ、Bewtra C。抗糖蛋白b抗体转染改善豚鼠母源性和先天性巨细胞病毒感染.感染性疾病杂志. 2001;183: 1547–1553. 数字对象标识：10.1086/320714[公共医学][谷歌学者]
24Bernstein DI、Munoz FM、Callahan ST、Rupp R、Wootton SH、Edwards KM等。青少年女孩巨细胞病毒糖蛋白B（gB）疫苗的安全性和有效性：一项随机临床试验.疫苗爱思唯尔有限公司；2016;34: 313–319. 数字对象标识：10.1016/j.疫苗.2015.11.056 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Pass RF、DuliegèAM、Boppana S、Sekulovich R、Percell S、Britt W等。基于重组包膜糖蛋白B和新佐剂的巨细胞病毒亚单位疫苗.感染性疾病杂志. 1999;180: 970–975. 数字对象标识：10.1086/315022[公共医学][谷歌学者]
26Araullo-Cruz TP，Ho M，Armstrong JA。小鼠早期血清对巨细胞病毒感染的保护作用.感染免疫. 1978;21: 840–842.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
27Shanley JD、Colin Jordan M、Stevens JG、Shanley J。小鼠巨细胞病毒感染的过继性体液免疫修饰.感染性疾病杂志. 1981;143: 231–237. 数字对象标识：10.1093/infdis/143.2231年10月10日[公共医学][谷歌学者]
28.Farrell HE，Shellam GR。被动转移中和和非中和单克隆抗体对小鼠巨细胞病毒感染的保护作用.J Gen Virol公司. 1991;72: 149–156. 数字对象标识：10.1099/0022-1317-72-1-149[公共医学][谷歌学者]
29JonjićS、PavićI、PolićB、CrnkovićI，Lucin P、Koszinowski UH。抗体对于解决原发性巨细胞病毒感染并不重要，但可以限制复发病毒的传播.实验医学杂志. 1994;179: 1713–7. 数字对象标识：10.1084/jem.179.5.1713 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30CekinovićD、Golemac M、Pugel EP、Tomac J、Cicin Sain L、Slavuljica I等人。被动免疫降低小鼠巨细胞病毒诱导的新生小鼠脑病理.J维罗尔. 2008;82: 12172–80. 数字对象标识：2012年10月10日/JVI.01214-08 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
31Klenovsek K、Weisel F、Schneider A、Appelt U、Jonjic S、Messerle M等人。记忆B细胞过继转移对免疫缺陷宿主CMV感染的保护作用.血液. 2007;110: 3472–3479. 数字对象标识：10.1182/血液-2007-06-095414[公共医学][谷歌学者]
32Pötzsch S、Spindler N、Wiegers A-K、Fisch T、Rücker P、Sticht H等人。B细胞库分析鉴定人巨细胞病毒糖蛋白B上新的抗原结构域，作为中和抗体的靶点.公共科学图书馆病理学. 2011;7：e1002172数字对象标识：10.1371/日志.ppat.1002172 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
33Masuho Y、Matsumoto Y、Sugano T、Fujinaga S、Minamishima Y。中和人巨细胞病毒的人单克隆抗体.J Gen Virol公司. 1987;68(第5部分): 1457–1461. 数字对象标识：10.1099/0022-1317-68-5-1457[公共医学][谷歌学者]
34Wiegers A-K、Sticht H、Winkler TH、Britt WJ、Mach M。人巨细胞病毒糖蛋白B抗原结构域5中和表位的鉴定.J维罗尔. 2015;89: 361–72. 数字对象标识：10.1128/JVI.02393-14 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
35Spindler N、Rücker P、Pötzsch S、Diestel U、Sticht H、Martin Parras L等人。人巨细胞病毒糖蛋白B非连续中和表位的鉴定.J维罗尔. 2013;87: 8927–39. 数字对象标识：10.1128/JVI.00434-13 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
36.Burke HG，Heldwein EE。人巨细胞病毒糖蛋白B的晶体结构.公共科学图书馆病理学. 2015;11数字对象标识：10.1371/日志.ppat.1005227 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
37Messerle M、Crnkovic I、Hammerschmidt W、Ziegler H、Koszinowski UH。感染性细菌人工染色体疱疹病毒基因组的克隆和突变.美国国家科学院程序. 1997;94: 14759–63. 数字对象标识：10.1073/pnas.94.26.14759 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
38Jordan S、Krause J、Prager A、Mitrovic M、Jonjic S、Koszinowski UH等人。鼠巨细胞病毒细菌人工染色体pSM3fr的病毒子代由于MCK-2的固定突变而在唾液腺中显示出生长减少.J维罗尔. 2011;85: 10346–53. 数字对象标识：10.1128/JVI.00545-11 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
39Mathys S、Schroeder T、Ellwart J、Koszinowski UH、Messerle M、Just U。受小鼠巨细胞病毒影响的树突状细胞具有双重生理作用：启动和限制T细胞活化.感染性疾病杂志. 2003;187: 988–99. 数字对象标识：10.1086/368094[公共医学][谷歌学者]
40Wagner FM、Brizic I、Prager A、Trsan T、Arapovic M、Lemmermann NAW等人。小鼠巨细胞病毒的病毒趋化因子MCK-2作为gH/gL/MCK-2复合物的一部分促进感染.公共科学图书馆病理学. 2013;9数字对象标识：10.1371/期刊.ppat.1003493 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
41Noda S、Aguirre SA、Bitmansour A、Brown JM、Sparer TE、Huang J等。巨细胞病毒MCK-2控制髓系祖细胞的动员和募集以促进传播.血液. 2006;107: 30–38. 数字对象标识：10.1182/血液-2005-05-1833 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
42Daley-Bauer LP、Roback LJ、Wynn GM、Mocarski ES。巨细胞病毒劫持CX3CR1hi巡逻单核细胞作为免疫宿主在小鼠体内传播.宿主与微生物. 2014;15: 351–362. 数字对象标识：10.1016/j.chom.2014.02.002 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
43Spindler N、Diestel U、Stump JD、Wiegers A-K、Winkler TH、Sticht H等。中和人抗体识别人巨细胞病毒糖蛋白B的结构基础.公共科学图书馆病理学. 2014;10：e1004377数字对象标识：10.1371/日志.ppat.1004377 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
44Lavoie PM、Solimano A、Taylor R、Kwan E、Claydon J、Turvey SE等人。使用巴利维祖单抗的简化给药方案对婴儿进行呼吸道合胞病毒免疫预防的结果.JAMA儿科. 2016;170: 174–176. 数字对象标识：10.1001/牙买加儿科.2015.3235 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
45.Caskey M、Klein F、Lorenzi JCC、Seaman MS、West AP、Buckley N等人。广泛中和抗体3BNC117抑制HIV-1感染者的病毒血症.自然. 2015;522: 487–491. 数字对象标识：10.1038/自然14411 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
46BubićI、Wagner M、KrmpotićA、Saulig T、Kim S、Yokoyama WM等人。小鼠巨细胞病毒基因缺失导致的毒力增加.J维罗尔. 2004;78: 7536–44. 数字对象标识：10.1128/JVI.78.14.7536-7544.2004 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
47坎贝尔AE、卡瓦诺VJ、斯莱特JS。唾液腺是巨细胞病毒免疫逃避和持久性的特权部位.医学微生物学和免疫学. 2008. 第205–213页。数字对象标识：2007年10月10日/00430-008-0077-2[公共医学][谷歌学者]
48Collins TM、Quirk MR、Jordan MC。小鼠急性巨细胞病毒感染期间白细胞中双相病毒血症和病毒基因表达.J维罗尔. 1994;68: 6305–11. 可用：http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi？artid=237051&tool=pmcentrez&rendertype=abstract [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
49科雷亚IR。血清中IgG异构体的稳定性.单克隆抗体. 2010. 第221-232页。数字对象标识：10.4161/mabs.2.3.11788 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
50Klein F、Halper-Stromberg A、Horwitz JA、Gruell H、Scheid JF、Bournazos S等人。在人源化小鼠中结合广泛中和抗体治疗HIV.自然. 2012;492: 118–22. 数字对象标识：10.1038/自然11604 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
51不包括JL、Ake J、Robb ML、Kim JH、Plotkin SA。非中和功能性抗体：HIV疫苗的新“旧”范式.临床与疫苗免疫学. 2014. 第1023-1036页。数字对象标识：10.1128/CVI.00230-14号 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
52Henry Dunand CJ、Leon PE、Huang M、Choi A、Chromikova V、Ho IY等。中和和非中和人H7N9流感疫苗诱导的单克隆抗体均具有保护作用.宿主与微生物. 2016;19: 800–813. 数字对象标识：10.1016/j.chom.2016.05.014 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
53阿拉巴马州施马尔约翰。缺乏中和活性的保护性抗病毒抗体：先例和概念的演变.当前高分辨率. 2013;11: 345–353. 数字对象标识：10.2174/1570162X113116660057[公共医学][谷歌学者]
54Nimmerjahn F、Gordan S、Lux A。前？？细胞毒、激动和中和抗体活性的R依赖机制.免疫学趋势. 2015. 第325-336页。数字对象标识：10.1016/j.it.2015.04.005[公共医学][谷歌学者]
55Nimmerjahn F，拉维奇J V。通过选择性Fc受体结合产生不同的免疫球蛋白g亚类活性.科学类. 2005;310: 1510–2. 数字对象标识：10.1126/科学.1118948[公共医学][谷歌学者]
56Corrales Aguilar E、Hoffmann K、Hengel H。CMV编码的Fcγ受体：先天免疫和适应性免疫界面的调节剂.精液免疫病理学. 2014;36: 627–640. 数字对象标识：2007年10月10日/00281-014-0448-2[公共医学][谷歌学者]
57Vidarson G、Dekkers G、Rispens T。IgG亚类和同种异型：从结构到效应器功能.前部免疫. 2014;5数字对象标识：10.3389/fimmu.2014.00520 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
58野村M、Kurita-Taniguchi M、近藤K、井上N、松本M、山西K等人。小鼠巨细胞病毒（CMV）感染中宿主细胞对补体的保护机制：CD46启动子区CMV应答元件的鉴定.欧洲免疫学杂志. 2002;32: 2954–2964. 数字对象标识：10.1002/1521-4141（2002010）32:10<2954:：AID-IMMU2954>3.0.CO；2-2[公共医学][谷歌学者]
59Spiller OB、Hanna SM、Devine D V、Tufaro F。巨细胞病毒的中和：补体的作用.感染性疾病杂志. 1997;176: 339–347. [公共医学][谷歌学者]
60萨坦托Q。避免空洞：人类病毒的细胞间传播.Nat Rev微生物. 2008;6: 815–826. 数字对象标识：10.1038/nrmicro1972年[公共医学][谷歌学者]
61Digel M、Sampaio KL、Jahn G、Sinzger C。人巨细胞病毒细胞相关传播过程中细胞质物质从感染细胞直接转移到未感染细胞的证据.临床病毒杂志. 2006;37: 10–20. 数字对象标识：2016年10月10日/j.jcv.2006.05.007[公共医学][谷歌学者]
62.Silva MC、Schröer J、Shenk T。人巨细胞病毒在缺乏必要组装蛋白的情况下细胞间传播.美国国家科学院程序. 2005;102: 2081–6. 数字对象标识：10.1073/pnas.0409597102 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
63Hsu KM、Pratt JR、Akers WJ、Achilefu SI、Yokoyama WM。系统给药后数小时内，小鼠巨细胞病毒表现出选择性细胞感染.维罗尔将军. 2009;90: 33–43. 数字对象标识：1999年10月10日至2006年6月1日 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
64Bernstein DI、Munoz FM、Callahan ST、Rupp R、Wootton SH、Edwards KM等。青少年女孩巨细胞病毒糖蛋白B（gB）疫苗的安全性和有效性：一项随机临床试验.疫苗. 2016;34: 313–319. 数字对象标识：10.1016/j.疫苗.2015.11.056 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
65Zeev-Ben-Mordehai T、Vasishtan D、Hernández Durán A、Vollmer B、White P、Prasad Pandurangan A等人。天然膜锚定全长单纯疱疹病毒1糖蛋白B的两种不同三聚体构象.美国国家科学院程序. 2016;113数字对象标识：10.1073/pnas.1523234113 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
66Renzette N、Pokalyuk C、Gibson L、Bhattacharjee B、Schleiss MR、Hamprecht K等人。人类巨细胞病毒基因组多样性的限制和模式.国家科学院程序. 2015;112：E4120–E4128。数字对象标识：10.1073/pnas.1501880112 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
67Kropff B、Koedel Y、Britt W、Mach M。人巨细胞病毒的最佳复制与糖蛋白gpUL132的内吞相关.J维罗尔. 2010;84: 7039–52. 数字对象标识：10.1128/JVI.01644-09 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
68Webb B，Sali A。基于MODELLER的比较蛋白质结构建模.Curr Protoc生物信息. 2014;2014: 5.6.1–5.6.32. 数字对象标识：10.1002/0471250953.bi0506s47[公共医学][谷歌学者]
69Humphrey W、Dalke A、Schulten K。VMD：可视化分子动力学.J摩尔图. 1996;14: 33–38. 数字对象标识：10.1016/0263-7855(96)00018-5[公共医学][谷歌学者]
文章来自多囊卵巢综合征病原体由以下人员提供多环芳烃