Oncol Lett公司。2017年10月；14(4): 4499–4504.
组织和血清中RASSF1A和WIF-1甲基化水平在晚期乳腺癌新辅助化疗评估中的价值
, , , ,和
中华汉族
福建医科大学附属协和医院乳腺外科，福建福州350001
徐春森
福建医科大学附属协和医院乳腺外科，福建福州350001
惠汉
福建医科大学附属协和医院乳腺外科，福建福州350001
王川（音译）
福建医科大学附属协和医院乳腺外科，福建福州350001
顺果林
福建医科大学附属协和医院乳腺外科，福建福州350001
福建医科大学附属协和医院乳腺外科，福建福州350001
2016年10月27日收到；2017年3月10日接受。
摘要
本研究评估了新辅助化疗TAC方案治疗局部晚期乳腺癌患者的临床疗效，以及患者组织和血清中Ras关联域家族1A（RASSF1A）基因甲基化水平和Wnt抑制因子-1基因在临床预后预测中的价值。总共连续选择126名患者接受TAC方案（多西他赛、吡柔比星/表柔比星和环磷酰胺）至少四个周期，总有效率。记录并发症发生率、无进展生存率和生存率。本研究收集肿瘤组织和外周血标本，采用甲基化特异性PCR方法检测RASSF1A和WIF-1的甲基化阳性率，采用逆转录PCR方法检测其相对表达水平。126例患者中，18例完全缓解（CR），32例部分缓解（PR），50例病情稳定（SD），26例病情进展（PD），总有效率为79.37%。有效组和无效组的基线数据比较无差异（P>0.05），不良反应发生率比较无差异（P>0.05）。有效组的无进展生存期延长，生存率显著提高（P<0.05）。有效组患者组织和血清中RASSF1A甲基化和WIF-1的阳性率显著低于无效组，但RASSF1A和WIF-mRNA的mRNA显著高于无效组（P<0.05）。组织RASSF1A甲基化预测临床结局的敏感性为67.0%，特异性为15.4%，阳性预测值为69.0%，阴性预测值为31.0%。上述组织WIF-1指数分别为76.0、31.4、72.2和27.8。血清RASSF1A指数分别为85.0、50.0、76.2和23.8%，血清WIF-1指数分别为94.0、75.0、81.0和19.0%。受试者操作特征曲线分析表明，使用组织RASSF1A mRNA水平预测临床结果的准确性为0.812。敏感性85.2%，特异性76.3%，临界值0.4256。CR、PR、SD和PD的组织WIF-1指数分别为0.833、86.7%、75.4%和0.3562。血清RASSF1A的这些指标分别为0.864、88.3%、77.4%和0.2564，而血清WIF-1的这些指标则分别为0.882、89.4%、73.5%和0.1562。总之，检测局部晚期乳腺癌患者组织和血清中RASSF1A和WIF-1基因甲基化和mRNA表达水平对预测TAC方案新辅助化疗的临床疗效具有重要的应用价值。
关键词：局部晚期乳腺癌，新辅助化疗，TAC方案，Ras关联结构域家族1A基因，Wnt抑制因子，甲基化，临床结果
介绍
与威胁女性健康的每一种主要恶性肿瘤一样，乳腺癌占全身肿瘤的7-10%，在全球范围内死亡率很高(1). 局部晚期乳腺癌是术后复发和死亡的主要原因，很少能通过外科手术完全切除。新辅助化疗可以缩小病变范围，降低肿瘤临床分期，减少微转移酶，提高保乳率，提高生活质量(2). 目前还没有统一的新辅助化疗方案，但TAC方案（多西他赛、吡柔比星和环磷酰胺）被证明具有更好的安全性和疗效(三). 适当的指标具有较好的敏感性和准确性，对预测临床结局，对提高化疗疗效和减少化疗副作用具有重要价值。几项研究(4,5)已证实组织和血清Ras关联域家族1A（RASSF1A）基因和Wnt抑制因子-1基因表达下调或缺失与乳腺癌的发生和转移密切相关，其中启动子异常甲基化是其主要机制之一(6)基因活性下降。我们的研究旨在分析RASSF1A和WIF-1的甲基化及其在预测局部晚期乳腺癌患者新辅助化疗临床结局中的价值。
患者和方法
患者档案
2013年1月至2016年1月，我们在福建医科大学附属协和医院连续选择126名女性患者，诊断为局部晚期乳腺癌。
入选标准
a） 钼靶X线、CT、MRI、超声及全身骨显像证实无远处转移的患者；b） 无手术和麻醉禁忌症的患者；c） 首次诊断为局部晚期乳腺癌且无手术、化疗、放疗或内分泌治疗史的患者；和d）Karnofsky绩效状态（KPS）评分>90分的患者。
排除标准
a） 乳腺转移瘤患者；b） 其他部位原发恶性肿瘤患者；c） 无法完成四个化疗周期的患者；d） 临床资料不完整的患者。该研究得到福建医科大学附属协和医院伦理委员会的批准，患者或其家属提供了签署的书面知情同意书。
方法
患者同意接受TAC方案，环磷酰胺600 mg/m2，静脉滴注，第1天；吡柔比星50 mg/m2，静脉滴注，第1天；多西他赛75 mg/m2，静脉滴注，第1天；一个周期由21天组成，并且进行了至少4个周期。TAC方案实施过程中，定期监测肝肾功能、血常规和凝血功能，对有轻微并发症的患者进行对症治疗；对严重并发症患者进行停药和严密观察。我们记录了总有效率、并发症发生率、无进展生存率和生存率。乳腺钼靶二维测量肿瘤直径，UICC实体肿瘤反应标准判定疗效，分为完全反应（CR）、部分反应（PR）、稳定疾病（SD）和疾病进展（PD）。总有效率=（CR+PR+SD）/总数×100%。
本研究收集肿瘤组织和外周血标本，采用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测RASSF1A和WIF-1的甲基化阳性率，采用逆转录PCR（RT-PCR）方法检测其相对表达水平。
MSP工艺
DNA提取过程
组织DNA提取工艺：按照组织DNA提取试剂盒（中国江苏省贝约泰生物技术研究所）的说明研磨50 mg癌组织，然后进行后续操作；添加500µl组织裂解液缓冲液，并在50°C水浴中加热1 h。然后用蛋白酶K稀释混合物，直到浓度达到100µg/ml。在50°C水浴3 h后，使用等体积的饱和苯酚、酚氯仿（体积比，1:1）进行萃取氯仿异戊醇（体积比24:1）。然后加入1/10体积的乙醇钠和2倍体积的无水乙醇以沉淀DNA，该DNA随后被一定体积的TE溶液溶解。然后使用紫外分光光度计（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统生命技术公司）检测DNA浓度和纯度。
外周血DNA提取过程：采集静脉血5ml，2500×g离心20min；然后将上清液保存在−80°C；根据血浆DNA提取试剂盒（中国北京中山金桥生物科技有限公司）的说明，使用顺磁性颗粒法，将200µl上清液用于后续程序。
亚硫酸盐改性
按照DNA甲基化修饰试剂盒（Sigma，St.Louis，MO，USA）的说明执行相关程序；将1µg DNA溶解在45µl TE溶液中。然后用5µl NaOH（3 mol/l）稀释至浓度达到0.3 mol/l。在37°C下变性20 min后，添加30µl对苯二酚（10 nmol/l）和520µl亚硫酸氢钠（pH 5.0，3 mol/l），并在50°C水浴中加热16 h，将DNA纯化剂添加到45µl去离子水中。然后用5µl NaOH（3 mol/l）稀释至浓度达到0.3 mol/l。脱硫和乙醇沉淀后，将其溶解在20µl TE溶液中，并在−20°C下保存。以亚硫酸氢盐处理的人脐血淋巴细胞DNA为非甲基化阳性对照，以SssI甲基转移酶修饰的人脐带血淋巴细胞DNA和亚硫酸氢钠处理的脐带血细胞DNA为甲基化阳性对比，以蒸馏水为阴性对照；用非甲基化引物和甲基化特异性引物扩增同一样品的DNA。
MSP公司
采用SYBR-Green I方法。引物由Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）合成，引物序列如所示反应体系包括：10X缓冲液2.5µl+Mg2+l（25 mol/l）1.5µl+dNTP（2.5 mol/l。用水将反应系统稀释至总体积25µl。反应在95°C条件下进行40个循环，反应时间为5 min，95°C为1 min，56°C为1min，72°C为1min，产物在72°C下延伸10min；对MSP产品进行2%琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像分析系统（美国马里兰州Rockville的Media Control，Inc.）分析。选择甲基化阳性产物作为对照，计算DNA拷贝数。选择经10倍梯度稀释处理的产物作为标准物质进行PCR扩增。超过500拷贝/ml的待检测样本被认为是甲基化阳性基因。
表一。
| 基因 | 序列 | 长度（bp） |
|---|
| RASSF1A（U） | F： 5′-ggggg ttttgtgaggtgtttt-3′ | |
| R： 5′-ccccaattaacccatactact-a-3′ | 204 |
| RASSF1A（百万） | F： 5′-CGAGAGCGCGTTTAGTTGTT-3′ | |
| R： 5′-CGATTAACCGTTACTCGCTAA-3′ | 192 |
| WIF-1（U）型 | F： 5′-GGGTGTTTTATTGTGTT-3′ | |
| R： 5′-AAAAAAA-CTAACAAAAAAAA-ATACAAAC-3′ | 154 |
| WIF-1（米） | F： 5′-CGCTCCACTGCGCGCACCC-3′ | |
| R： 5′-TCGCACCTCGCTCGCGCCAGC-3′ | 145 |
| RASSF1A公司 | F： 5′-CAGATTGCAAGTTCACCTGCCACTA-3′ | |
| R： 5′-GATGAAGCTCGTGTAAGACCTCT-3′ | 249 |
| WIF-1型 | F： 5′-GTCTAAAACGGGAACAGCCCT-3′ | |
| R： 5′-GCTGGCATTCTCTGC-3′ | 354 |
| β-肌动蛋白 | F： 5′-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3′ | |
| R： 5′-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′ | 219 |
RT-PCR工艺
用传统的三唑法提取DNA，用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，用逆转录试剂盒合成cDNA。底漆由Takara Bio，Inc.（日本大津）合成和设计，如.反应体系：5X 2.5µl缓冲液l+1.5µl MgCl2l+0.5µl dNTP+GAP-43和上游和下游引物，用于每个1+0.3µl Taq聚合酶+2µl cDNA模板的内部参考。用水将反应系统稀释至总体积25µl。在95°C条件下进行35个周期的反应，反应时间分别为5分钟、95°C 30秒、62°C、30秒、30秒72°C，反应时间为30秒，产物在72°C下延长时间为10分钟。我们绘制了溶解曲线，并使用2-ΔΔCq方法(7)计算mRNA的相对表达水平。
统计分析
我们使用SPSS 20.0软件（IBM SPSS，Armonk，NY，USA）进行统计分析。测量数据表示为平均值±标准偏差。在组间比较中进行独立样本t检验。可计数数据以案例或（%）的形式呈现。Chi-square（χ2)在组间比较中进行测试；通过受试者操作特征（ROC）曲线分析使用RASSF1A和WIF-1基因预测临床结果的特异性，并在曲线下面积（AUC）中显示准确性。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
化疗结果分析
126例患者中，CR 18例，PR32例，SD 50例，PD 26例，总有效率为79.37%。有效组与无效组基线数据比较无差异（P>0.05）().
表二：。
| 组 | 有效组（n=100） | 无效组（n=26） | t/χ2 | P值 |
|---|
| 年龄（年） | 56.7±14.5 | 55.9±16.3 | 0.152 | 0.932 |
| 浸润性导管癌，例（%） | 68 | 19 | 0.249 | 0.618 |
| 侵袭性小叶癌 | 32 | 7 | | |
| 肿瘤最大直径（cm） | 3.8±1.2 | 3.9±1.4 | 0.163 | 0.879 |
| 第二阶段，案例（%） | 46 | 12 | 0 | 0.989 |
| 第三阶段 | 54 | 14 | 0.002 | 0.966 |
| 淋巴转移例（%） | 38 | 10 | | |
| 化疗周期 | 4.9±0.8 | 4.6±0.5 | 0.232 | 0.824 |
| 随访时间（月） | 15.5±3.4 | 13.6±3.8 | 0.356 | 0.763 |
根据世界卫生组织（WHO）化疗不良反应分类标准，主要不良反应包括胃肠道反应、骨髓抑制、心脏毒性和脱发，分为0-IV级。两组不良反应发生率比较无差异（P>0.05）；与无效组相比，有效组无进展生存期更长，生存率更高，组间差异有统计学意义（P<0.05）().
表三。
| 组 | 有效组（n=100） | 无效组（n=26） | χ2 | P值 |
|---|
| 胃肠道反应，例（%） |
| I–II级 | 50 | 11 | 0.489 | 0.783 |
| III–IV类 | 20 | 6 | | |
| 骨髓抑制，例（%） |
| I–II级 | 30 | 8 | 0.134 | 0.935 |
| III–IV类 | 10 | 2 | | |
| 心脏毒性，例（%） |
| I–II级 | 15 | 5 | 0.405 | 0.817 |
| III–IV类 | 6 | 2 | | |
| 脱发，例（%） |
| I–II级 | 35 | 9 | 0.101 | 0.951 |
| III–IV类 | 13 | 4 | | |
| 无进展生存时间（月） | 6.5±1.2 | 3.4±0.9 | 6.532 | 0.013 |
| 存活率，例（%） | 78 (78.0) | 12 (46.2) | 8.064 | 0.005 |
组织和血清RASSF1A和WIF-1甲基化阳性率的比较
组织和血清RASSF1A和WIF-1甲基化阳性率比较，有效组显著低于无效组（P<0.05）().
表四。
组织和血清RASSF1A和WIF-1甲基化阳性率比较，例（%）。
| 组 | 有效组（n=100） | 无效组（n=26） | χ2 | P值 |
|---|
| 组织RASSF1A | 33 (33.00) | 20 (76.92) | 16.335 | <0.001 |
| 组织WIF-1 | 24 (24.00) | 15 (57.69) | 10.960 | 0.001 |
| 血清RASSF1A | 15 (15.00) | 11 (42.31) | 9.396 | 0.002 |
| 血清WIF-1 | 6 (6.00) | 8 (30.77) | 10.433 | 0.001 |
组织和血清中RASSF1A和WIF-1 mRNA相对表达水平的比较
有效组组织和血清中RASSF1A和WIF-1 mRNA的相对表达水平明显高于无效组（P<0.05）().
表五。
组织和血清中RASSF1A和WIF-1 mRNA相对表达水平的比较。
| 组 | 有效组（n=100） | 无效组（n=26） | t检验 | P值 |
|---|
| 组织RASSF1A | 0.6358±0.1236 | 0.3256±0.1124 | 7.532 | <0.001 |
| 组织WIF-1 | 0.5427±0.1247 | 0.2142±0.1032 | 7.123 | <0.001 |
| 血清RASSF1A | 0.4326±0.1326 | 0.1213±0.0639 | 5.629 | 0.008 |
| 血清WIF-1 | 0.3598±0.1528 | 0.0659±0.0124 | 6.124 | <0.001 |
利用组织和血清中RASSF1A和WIF-1的甲基化阳性率分析临床预后。组织RASSF1A甲基化预测临床结局的敏感性为67.0%，特异性为15.4%，阳性预测值为69.0%，阴性预测值为31.0%。组织WIF-1的上述指标分别为76.0、31.4、72.2和27.8%。血清RASSF1A的这些指标分别为85.0、50.0、76.2和23.8%，血清WIF-1的指标分别为94.0、75.0、81.0和19.0%。
组织和血清RASSF1A mRNA水平的ROC分析在临床预后预测中的应用
组织和血清RASSF1A和WIF-1 mRNA水平作为诊断指标，临床转归作为诊断依据，代入ROC进行分析，结果表明：组织RASSF1AmRNA水平预测临床转归的准确性为0.812（CI=0.756～0.932，P=0.008）。敏感性85.2%，特异性76.3%，临界值0.4256。组织WIF-1的这些指数分别为0.833（95%CI=0.721-0.948，P=0.010）、86.7%、75.4%和0.3562。血清RASSF1A的这些指数分别为0.864（CI=0.737–0.964，P=0.003）、88.3%、77.4%和0.2564。血清WIF-1的这些指标分别为0.882（95%CI=0.727-0.986，P=0.005）、89.4%、73.5%和0.1562().
RASSF1A和WIF-1 mRNA水平在临床预后预测中的ROC分析。ROC，接收机工作特性曲线；RASSF1A，Ras关联域家族1A；WIF-1，Wnt抑制因子-1。
讨论
RASSF1A通过调节细胞周期、凋亡和基因组稳定性抑制肿瘤形成，在几乎所有正常组织中高度表达，其表达不足与肿瘤的发生发展密切相关(8). 它已经被证明了(9,10)在包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌在内的20多种肿瘤类型中观察到其表达不足，抗肿瘤药物可以激活其表达以恢复其生物活性。基因启动子异常甲基化是导致失活的重要原因。肿瘤组织中恶性克隆的DNA可以持续释放到外周循环血液中，循环肿瘤细胞以及微转移也可以输送到血液中进行检测(11). RASSF1A甲基化水平高而mRNA表达水平低与乳腺癌的临床分期、分化程度、化疗敏感性和生存率密切相关(12). 尽管RASSF1A甲基化水平和mRNA已广泛应用于乳腺癌的早期诊断(13)目前，评估新辅助化疗对局部晚期乳腺癌临床疗效的研究较少。在本研究中，我们发现TAC方案的总有效率为79.37%，不良反应发生率低，症状轻微，表明TAC方案具有更好的安全性和疗效。有效组无进展生存期为~6.5个月，生存率为78.0%。有效组组织、血清RASSF1A和WIF-1甲基化阳性率显著低于无效组；但mRNA水平明显高于无效组。Wnt/β-catenin信号通路在乳腺癌发生、分化、增殖和侵袭的生物学行为中起着关键作用(14). C-myc和cyclin D1是两个重要的下游靶基因，调节细胞分裂周期(15). E-cadherin不仅是该信号通路中的重要效应分子，而且是乳腺癌侵袭、转移和复发的关键因素(16). 作为Wnt通路的主要抑癌基因，高度甲基化或表达低水平mRNA的WIF-1可显著影响乳腺癌的发生发展(17).
进一步研究发现，利用组织RASSF1A和WIF-1甲基化阳性率预测临床结局的敏感性为67.0-76.0%，阳性预测值为69.0-72.2%，特异性和阴性预测值相对较低。血清RASSF1A和WIF-1阳性甲基化率预测临床结局的敏感性为85.0-94.0%，阳性预测值为76.2-81.0%，特异性为50.0-75.0%，阴性预测值相对较低。对于RASSF1A和WIF-1等抑癌基因，通过降低这两个基因的甲基化阳性率可以获得更高的疗效；此外，一些异常甲基化的基因可能与化疗敏感性有关。通过ROC分析，我们发现组织和血清中RASSF1A和WIF-1的mRNA水平用于预测临床结果时具有更好的准确性、敏感性和特异性。总之，检测局部晚期乳腺癌患者组织和血清中RASSF1A和WIF-1基因的甲基化和mRNA表达水平对预测新辅助化疗TAC方案的临床疗效具有重要意义。
致谢
本研究得到福建省卫生和计划生育委员会青年项目（批准号：20130233）的支持。
工具书类
1Yung KW、Yung TT、Chung CY、Tong GT、Liu Y、Henderson J、Welbeck D、Oseni S.癌症分期原则。亚太外科肿瘤杂志。2015;1:1–16. [谷歌学者] 2Lee R、Yeung AW、Hong SE、Brose MS、Michels DL。医学肿瘤学原理。亚太外科肿瘤杂志。2015;1:39–46. [谷歌学者] 三。Lupichuk S，Tilley D，Kostaras X，Joy AA。50岁以下女性HER2阴性淋巴结阳性乳腺癌的真实世界辅助TAC或FEC-D。当前Oncol。2016;23：164–170。doi:10.3747/co.23.3004。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 4纪毅、金浩、王总经理、曹伟X、鲍JL。乳腺癌中RASSFIA启动子的甲基化。基因分子研究。2016;15:156–157. doi:10.4238/gmr.15028261。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5Trifa F、Karray Chouayekh S、Jmal E、Jmaa ZB、Khabir A、Sellami Boudawara T、Frikha M、Daoud J、Mokdad Gargouri R。WIF-1和Wnt5a表达的缺失与突尼斯患者散发性乳腺癌的侵袭性有关。肿瘤生物学。2013;34:1625–1633. doi:10.1007/s13277-013-0694-2。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 6Takahashi H、Kagara N、Tanei T、Naoi Y、Shimoda M、Shimomura A、Shimazu K、Kim SJ、Noguchi S。乳腺癌患者甲基化循环肿瘤DNA与新辅助化疗反应的相关性。临床乳腺癌。2016年6月16日；（印刷前Epub）[公共医学][谷歌学者] 7Livak KJ，Schmittgen TD。使用实时定量PCR和2（−德尔塔-德尔塔C（T））方法分析相对基因表达数据。方法。2001;25:402–408. doi:10.1006/meth.2001.1262。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 8Kristiansen S，Nielsen D，Sölétormos G。转移性乳腺癌患者血清中高甲基化RASSF1A的检测和监测。临床表观遗传学。2016;8：35.doi:10.1186/s13148-016-0199-0。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 9Spitzwieser M、Holzweber E、Pfeiler G、Hacker S、Cichna-Markl M。HIN-1、MGMT和RASSF1A启动子甲基化作为检测乳腺癌现场癌变的生物标记物的适用性。乳腺癌研究。2015;17：125.网址：10.1186/s13058-015-0637-5。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 10韩JC，徐凤，陈恩，齐国平，魏玉杰，李海波，张玉杰，李建华，王克力，徐伟，等。RASSF1A和p16启动子甲基化与肺癌临床病理特征相关。癌症研究与治疗杂志。2016;12:340–349. doi:10.4103/0973-1482.154926。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 11de Groot JS、Moelans CB、Elias SG、Fackler Jo M、van Domselaar R、Suijkerbuijk KP、Witkamp AJ、Sukumar S、van Diest PJ、van der Wall E.乳头液中DNA启动子超甲基化：早期乳腺癌检测的潜在工具。Oncotarget公司。2016;7:24778–24791. doi:10.18632/noctarget.8352。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 12Rauscher GH、Kresovich JK、Poulin M、Yan L、Macias V、Mahmoud AM、Al-Alem U、Kajdacsy-Balla A、Wiley EL、Tonetti D等。探讨启动子、基因内和基因间区域的DNA甲基化变化作为乳腺癌形成的早期和晚期事件。BMC癌症。2015;15：816.doi:10.1186/s12885-015-1777-9。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 13Pirouzpanah S、Taleban FA、Mehdipour P、Atri M。叶酸和其他单碳相关营养素与乳腺癌患者中RARB、BRCA1和RASSF1A基因的高甲基化状态和表达的相关性。《分子医学杂志》（柏林）2015;93:917–934. doi:10.1007/s00109-015-1268-0。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 14Wu D，Wong P，Li W，Vogel CF，Matsumura F.通过启动子超甲基化抑制WIF-1导致过表达MCF10AT1的芳香烃受体（AHR）的乳腺癌细胞加速增殖。毒理学。2011;285:97–103. doi:10.1016/j.tox.2011.04.008。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 15肖C，吴聪，胡慧玲。LncRNA UCA1通过增强Wnt/beta-catenin信号通路促进乳腺癌细胞的上皮-间充质转化（EMT）。欧洲药理学评论。2016;20:2819–2824.[公共医学][谷歌学者] 16李M，蔡H，杨毅，张杰，孙坤，颜毅，瞿H，王伟，王杰，段欣。软骨膜间充质干细胞通过DKK-1/Wnt/β-catenin信号通路抑制乳腺癌细胞的生长。Oncol代表。2016;36:936–944. doi:10.3892/或.2016.4853。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 17Jacobsen A、Heijmans N、Verkaar F、Smit MJ、Heringa J、van Amerongen R、Feenstra KA。Wnt/β-catenin信号传导的Petri网模型的构建和实验验证。公共科学图书馆一号。2016;11：e0155743。doi:10.1371/journal.pone.0155743。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 
