Oncol Lett公司。2017年10月；14(4): 4619–4624.
LRIG1在卵巢癌细胞系和VP16耐药细胞系中的作用及机制
,* ,*和
张亚琪
中国山东省潍坊市潍坊市宜都中心医院妇科，邮编262500
刘志珍
中国山东省潍坊市宜都市中心医院妇科262500
于顺瑞
中国山东省潍坊市潍坊市宜都中心医院妇科，邮编262500
中国山东省潍坊市潍坊市宜都中心医院妇科，邮编262500
*平均出资
2017年3月31日收到；2017年8月1日接受。
摘要
我们研究了富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域（LRIG）-1在卵巢癌细胞系和VP16耐药细胞系中的作用，以探讨其可能的作用机制。利用人卵巢癌细胞系SKOV3和VP16耐药细胞系SKO V3/VP16研究LRIG1是否影响SKOV3~-对药物的敏感性。用RT-qPCR检测耐药细胞株和野生型细胞株LRIG1表达的差异。设计并转染siRNA LRIG1沉默LRIG1，以研究LRIG1影响SKOV3药物敏感性的机制。用SKOV3转染野生型细胞。将细胞分为3组（VP16、NC+VP16和siRNA LRIG1+VP16处理组）。VP16（集成电路50转染24小时后添加。采用CCK-8法检测各组在多个时间点（0、24、48和72 h）的增殖情况。采用集落形成法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡。LRIG1在耐药细胞系中的表达低于野生型细胞系。LRIG1的表达随着VP16浓度的增加而显著降低（P<0.05）。与VP16-和NC+VP16治疗组相比，siLRIG1+VP16处理组的凋亡率降低，但细胞克隆数增加（P<0.05）。这个LRIG1型该基因以剂量相关的方式影响SKOV3细胞对药物的敏感性，表明LRIG1的表达减少可以抑制细胞凋亡。
关键词：卵巢、癌症、耐药性、富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域1、VP16、SKO
引言
卵巢癌是女性生殖器常见的恶性肿瘤。卵巢癌的发病率在所有恶性肿瘤中排名第三，仅次于宫颈癌和子宫癌(1,2). 然而，卵巢上皮癌的死亡率是所有妇科肿瘤中最高的(2). 随着化疗药物使用的增加，癌细胞的耐药性提出了挑战，并引起了人们的关注。目前，卵巢癌最常见的耐药类型是对VP16的耐药。VP-16是一种细胞周期特异性抗肿瘤药物，作用于细胞分裂的晚期或G2期。VP-16可以结合拓扑异构酶II形成药物酶-DNA稳定但脆弱的复合物，从而影响DNA拓扑异构酶II的功能。然而，在VP-16治疗期间很容易产生耐药性(三,4).
富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域（LRIG）-1、2和3是一类新型的肿瘤抑制分子。有证据证明LRIG-1、2和3在乳腺癌评估中具有良好的预后价值(5)，宫颈癌(6)头颈癌(7)，神经胶质瘤(8)，前列腺癌(9)、皮肤鳞状细胞癌(10)和其他恶性肿瘤。
在前人研究的基础上，本研究旨在进一步探讨LRIG-1卵巢癌细胞和耐药细胞的作用。
材料和方法
实验材料和分组
实验材料：SKOV3和SKOV3/VP16细胞系购自中国医学科学院细胞库。
实验分组：i）VP16治疗SKOV3组；ii）NC+VP16治疗SKOV3组；和iii）siRNA LRIG1+VP16治疗SKOV3组。
细胞培养
实验采用人卵巢癌细胞系SKOV3和VP16耐药细胞系SKO3/VP16细胞。以1 mg/l的持续浓度用VP16处理耐药细胞。
实验试剂和仪器
购买了以下产品：胎牛血清（Gibco，Carlsbad，CA，USA）；DMEM-高糖培养基（Hyclone，CA，USA）；链霉素、磷酸盐缓冲液（PBS）和细胞计数试剂盒（CCK）-8，（日本熊本市道津道），Lipofectamine™2000（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市英维特罗根）；Annexin V/PI凋亡试剂盒（联科生物，杭州，中国）；结晶紫染色液（自制）；RNA提取试剂：TRIzol（Takara，大连，中国）；最佳音乐奖®SYBR-Green qPCR Master Mix和焦碳酸二乙酯（DEPC）水，均来自（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）；RNasin（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）；Bestar qPCR RT试剂盒（Sigma）；清洁工作台（中国苏州苏欧净化设备公司）；紫外分光光度计（UV-1206）（日本京都岛津）；冷冻离心机（SCR20B）（日立，日本东京）；台式低温高速离心机（Eppendorf，柏林，德国）；水平电泳槽（北京东方仪器厂，中国北京）；凝胶成像系统（美国加利福尼亚州里士满Bio-Rad）；ABI9700 PCR机器（应用生物系统公司；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科学公司）；Stratagene Mx3000P实时PCR机器（安捷伦，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国）；倒置显微镜（德国柏林莱卡）；一氧化碳2细胞培养箱（Thermo，Santa Rosa，CA，USA）。本研究中使用的所有引物均由上海桑根生物工程技术服务有限公司（中国上海）设计合成。
mRNA表达
RNA提取
对于RNA提取，收集适当数量的细胞，添加1 ml TRIzol试剂，并在室温下搅拌混合物5 min。添加氯仿（0.2 ml），混合15秒，静置3 min。在10500×g下，在4°C下离心10 min。取下上清液并转移到新的试管中。添加等量的异丙醇，混合，静置20分钟。在10500×g下于4°C离心10分钟。然后将液体丢弃。用1 ml 75%酒精清洗细胞，然后在4°C下以10500×g离心5 min，然后丢弃液体。在室温下风干RNA，并添加30µl DEPC水以溶解RNA。将混合物储存在−80°C下。
逆转录
根据Bestar RT-qPCR试剂盒的说明，使用总RNA（1µl）作为模板，制备20µl体积的反转录反应系统，以合成第一链。反应溶液按照以下系统制备：1.0µl RNA；1.0µl底漆混合物；Xµl DEPC H2O；总计11µl。然后，在65°C下放置5分钟，并置于冰上。反应溶液的制备如下：前一步骤的11µl混合物；4.0µl 5X RT缓冲液；1.0µl RT酶混合物；4.0µl DEPC水；总体积为20µl；37°C持续60分钟，98°C持续10分钟。
PCR检测
所用引物序列为：GAPDH正向，5′-TGTCGTCATGGGTGAA-3′和反向，5′-ATGGCATGGTGAT-3′；LRIG1正向，5′-GACCCTTCTGACCGACAA-3′和反向，5′-CGCTTCCAGCTTTT-3′。反应体系为20µl（DBI Bestar®SYBR-Green qPCR Master Mix）。反应系统按照以下系统制备：Bestar®SYBR-Green qPCR主混合物10µl；PCR正向引物（10µM）0.5µl；PCR反向引物（10µM）；CDNA模板1µl；ddH（日/小时）2O 8µl；总计20µl。PCR反应条件为94°C反应2分钟，然后进行40次94°C、58°C和72°C循环20秒。熔融曲线分析的温度为62–95°C。每个样品重复3次。采用安捷伦-斯特拉赫纳荧光定量PCR Mx3000P进行荧光定量PCR。
siRNA序列
siRNA引物序列为：siRNA正、5′-GGCCUCCUUUCCUUAGAATT-3′和反义、5′-UUCUAAGGAAAGGGGCCTT-3′；NC意义，5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′和反义，5′-ACGUGCACGUAGAATT-3′。
数据处理
使用2处理数据-ΔΔCt方法，如下：Ct=（靶基因的Ct-内源性对照的Ct）；Ct=（实验样品中靶基因的Ct-参考样品中靶蛋白的Ct）的平均值±标准偏差（如果不包括参考样品，则使用Ct值最高的样品作为参考）。模板的初始量计算为（2）的平均值-ΔΔCt)±标准偏差。
CCK-8法检测细胞增殖
本研究中使用的质粒购自Addgene Corporation（Cambridge，MA，USA）用于载体构建。
实验分组：i）VP16治疗SKOV3组；ii）NC+VP16治疗SKOV3组；和iii）siRNA LRIG1+VP16治疗SKOV3组。
实验方法
转染前1天，1×104将细胞接种到含有100µl完整培养基的96周板中，转染时细胞密度为50–70%。将NC和siRNA LRIG1/sh LRIG1添加到25µl无血清和无抗生素的DMEM中并混合。向25µl无血清和无抗生素的DMEM中添加脂多糖胺，轻轻混合并在室温下静置5分钟。将稀释后的siRNA LRIG1和Lipofectamine试剂混合并在室温下静置20分钟，然后将50µl混合物添加到每个含有细胞的孔和50µl培养基中，然后轻轻来回搅拌平板。然后将细胞培养板转移到CO2培养箱培养4h，更换培养基。去除培养基，用1 ml完整培养基以1:10的比例稀释100µl CCK-8溶液，并分别在转染后0、24、48和72 h添加，以避免气泡。将培养板保存在培养箱中1 h，然后使用微孔板阅读器检测450 nm处的OD值。
流式细胞术检测细胞凋亡
转染前1天，1×105将细胞接种到含有2ml完整培养基的6孔板中，转染时细胞密度为50-70%。将质粒或siRNA添加到250µl无血清和无抗生素的DMEM中并混合。向250µl无血清和无抗生素的DMEM中添加脂多糖胺，并轻轻混合，在室温下静置5分钟。将稀释后的siRNA LRIG1和Lipofectamine试剂混合并在室温下静置20分钟，然后将500µl混合物添加到每个含有细胞和培养基的孔中，然后轻轻来回摇动平板。将细胞培养板转移到CO2培养箱培养4h，然后用完全培养基替换培养基。转染后5小时收集细胞进行后续检测。我们用ddH稀释了5X到1X的结合缓冲液2将O和5µl膜联蛋白V和10µl PI以及0.5 ml 1X结合缓冲液混合以制备膜联蛋白V/PI染色溶液。吸取培养板中的培养基，并用每孔2 ml PBS冲洗细胞。然后去除PBS，并向每个孔中添加0.5 ml 0.25%胰蛋白酶，在显微镜下监测消化情况，当细胞质收缩且细胞不再相互附着时，去除胰蛋白酶。然后，添加2 ml PBS以产生单细胞悬浮液，将细胞悬浮液转移到流动管中，然后以850×g离心5 min，丢弃上清液。添加Annexin V/PI染色溶液（200µl）以重新悬浮细胞。将细胞在黑暗中培养15分钟，然后进行检测。
集落形成分析
为了确定集落形成，将细胞分为以下两组：i）VP16处理SKOV3组ii）NC+VP16处理SKOV3小组和iii）siRNA LRIG1+VP16治疗SKOV4细胞分为两组。
实验方法
细胞最初在指数生长期收集，使用常规消化和继代培养方法制备细胞悬浮液。通过移液混合细胞悬浮液以将细胞彼此分离。单细胞百分比>95%。根据细胞增殖能力，对细胞悬液进行稀释。通常，将含有200个细胞的5 ml细胞悬浮液接种到培养皿（直径60 mm）中，然后轻轻摇晃培养皿，使细胞均匀分散。将培养皿培养2至3周（37°C，5%CO2)根据pH值的变化，用新鲜培养基代替旧培养基。当可见的克隆出现在培养皿中时，终止培养并丢弃培养基。使用PBS溶液仔细清洗细胞两次，然后将细胞风干。细胞用甲醇固定15分钟，丢弃甲醇后风干。然后用结晶紫染色细胞10分钟，然后用水冲洗。最后，对细胞进行空气干燥。
结果
卵巢癌细胞系和VP16耐药细胞系LRIG1表达的检测
耐药细胞和野生型细胞LRIG1表达的差异如下：与野生型细胞相比，耐药细胞中LRIG1的表达水平显著降低（P<0.05）(). 基于此结果，使用三种VP16浓度处理SKOV3细胞48 h，然后使用RT-qPCR检测LRIG1的表达。我们发现LRIG1的表达随着VP16浓度的增加而显著降低（P<0.05）().
的表达式LRIG1型RT-qPCR检测，（A）与野生型细胞相比，耐药细胞中LRIG1的表达显著降低（P<0.05）。（B） LRIG1的表达随着VP16浓度的增加而显著降低（*P<0.05）。LRIG1、富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域。
VP16对IC的影响50SKOV3的
CCK-8用于检测VP16对IC的影响50SKOV3。使用不同浓度的VP16（0、5、10、20、40和80µg/l）处理细胞。结果表明，VP16对肿瘤细胞生长的抑制率与VP16的浓度有关。VP16浓度越高，VP16抑制肿瘤细胞生长的能力越强，呈剂量依赖性。结果表明，IC50=30623微克/升(,).
CCK-8检测不同浓度VP16对肿瘤细胞的抑制率。
表一。
| 浓度 | 平均OD值 | 平均凋亡率 | 抑制率 |
|---|
| 0 | 0.586667 | 0.467 | 0 |
| 5 | 0.546333 | 0.426667 | 0.086367 |
| 10 | 0.460333 | 0.340667 | 0.270521 |
| 20 | 0.418333 | 0.298667 | 0.360457 |
| 40 | 0.348667 | 0.229 | 0.509636 |
| 80 | 0.212667 | 0.093 | 0.800857 |
SKOV3细胞中LRIG1的沉默
设计siRNA LRIG1并用于转染野生型SKOV3。24小时后，VP16（IC50)已添加。48h处理后，将细胞分为VP16、NC+VP16和siRNA LRIG1+VP16处理组。western blot分析显示，siRNA LRIG1+VP16处理组LRIG1蛋白的表达显著低于VP16和NC+VP16治疗组（P<0.05）().
siLRIG1转染后SKOV3细胞中LRIG1的表达水平。Western blot分析显示，siRNA LRIG1+VP16治疗组中LRIG1蛋白的表达显著低于VP和NC+VP16处理组（*P<0.05）。LRIG、富含亮氨酸的重复序列和免疫球蛋白样结构域。
CCK-8法检测细胞活力
siRNA LRIG1+VP16治疗组的细胞存活率显著高于VP16和NC+VP16处理组，表明沉默LRIG1可以提高细胞存活率().
CCK-8法检测细胞活力。siRNA LRIG1+VP16治疗组的细胞存活率显著高于VP16和NC+VP16，表明沉默LRIG1可以提高细胞存活率。LRIG1、富含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白样结构域；CCK，细胞计数试剂盒。
细胞凋亡检测
与VP16和NC+VP16治疗组相比，siLRIG1+VP16处理组的细胞凋亡率显著增加（P<0.05），表明沉默LRIG1可以促进细胞凋亡().
流式细胞术检测细胞凋亡。与VP16和NC+VP16治疗组相比，siLRIG1+VP16处理组的凋亡细胞比例显著降低（P<0.05）。
集落形成试验检测细胞增殖
对VP16、NC+VP16和siRNA LRIG1+VP16处理组的细胞进行集落形成分析。与VP16和NC+VP16治疗组相比，siRNA LRIG1+VP16处理组细胞形成的集落数显著增加（P<0.05）().
集落形成试验检测细胞增殖。（A） VP16、NC+VP16治疗组和siRNA LRIG1+VP16处理组细胞集落形成实验的复制结果。（B） 与VP16和NC+VP16治疗组相比，siRNA LRIG1+VP16处理组细胞形成的集落数显著增加（*P<0.05）。
讨论
自10年前发现以来，LRIG1被认为是一种肿瘤抑制基因(11——13). 一系列实验和临床数据支持了这一假设。研究发现，LRIG1可以抑制细胞的正常增殖和分化。LRIG1在前列腺癌细胞、小鼠成纤维细胞角质形成细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤细胞中起重要调节作用(14——20)和其他细胞系。
化疗药物VP16的作用机制是通过干扰DNA拓扑异构酶II发挥细胞周期特异性抗肿瘤作用。然而，长期使用VP16后会产生耐药性，尤其是在肺腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌和其他恶性肿瘤中。这种耐药性的具体机制尚不清楚。VP16细胞因其耐药特性而广泛应用于基础研究。我们的研究发现，LRIG1在耐药细胞中的表达低于野生型细胞，并且LRIG1的表达随着VP16浓度的增加而显著降低（P<0.05）。siRNA干扰沉默LRIG1后，与VP16和NC+VP16治疗组相比，siLRIG1+VP16处理组凋亡细胞少，集落多（P<0.05）。这表明LRIG1能促进卵巢癌细胞的增殖，沉默后细胞增殖能力减弱，凋亡增加。这一结论与以往的研究一致(21,22)，提示在卵巢癌的治疗中，我们可以通过降低LRIG1蛋白的表达来促进肿瘤细胞的凋亡，从而提高癌细胞对放化疗的敏感性。
在分子水平上，LRIG1负调控由致癌受体酪氨酸激酶介导的生长因子信号传导。LRIG1可诱导表皮生长因子受体（EGFR）家族成员的泛素化，包括EGFR、ErbB2（也称为HER2）、ErbB3和4(14,15)从而破坏MET受体(18)，从而作用于RET受体并抑制RET和下游因子的磷酸化(23,24). 一般来说，LRIG1可以通过多种调节途径抑制细胞增殖。以前的研究表明LRIG1的表达与性激素的表达有关(18). 这个LRIG1型基因可以在大多数正常人体组织和细胞中表达(20——23). 除了上述调控途径外，LRIG2还可以诱导LRIG1型通过生长因子的基因(23)或类固醇(1——11). 在ErbB2阳性的肿瘤细胞系中，ErbB2的过度表达下调雌激素受体的表达，从而抑制雌激素诱导的LRIG1转录(1——19). 天然化合物藤黄酸可以通过激活AMP激酶上调胶质瘤细胞中LRIG1的表达，从而抑制这些细胞的增殖(24). 因此，从这项研究的结果可以得出这样的结论：LRIG1型基因以剂量依赖的方式影响SKOV3细胞对药物的敏感性，表明LRIG1沉默可以抑制细胞凋亡。提高LRIG1在卵巢癌细胞中的表达水平可以提高卵巢癌细胞的放化疗敏感性。
总之，LRIG1型基因以剂量依赖的方式影响SKOV3细胞对化疗药物的敏感性，表明LRIG1沉默可以抑制细胞凋亡。
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