微管马达装配过程中的微管依赖性变化PtK1的蛋白质和有丝分裂纺锤体检查点蛋白质染色粒

免疫荧光

免疫荧光标记程序在房间进行温度。细胞首先在新制备的0.5%Triton®声波风廓线仪中溶解X-100在PHEM缓冲液中保持5分钟。当磷酸蛋白染色时通过3F3/2抗体识别，100 nM微囊藻毒素（Sigma）为包含在裂解缓冲液中(水域等。, 1998). 细胞然后固定在4%甲醛中（每天新鲜制备多聚甲醛）20分钟。然后，在磷酸盐缓冲盐水/吐温（PBST）（PBS:140 mM NaCl，2.5 mM KCl，1.6毫微米千赫₂人事军官₄，15毫米纳₂高性能操作₄，pH值7.20.05%吐温20），随后在5%煮沸驴血清中阻断PHEM至少45分钟。在初级抗体中培养（稀释在PHEM中加入5%的驴血清），持续45分钟，之后细胞在PBST中冲洗四次，然后在二级驴抗兔、抗鼠或抗人抗体（在PHEM中5%驴血清中以1:100稀释），结合至罗丹明红-X(杰克逊免疫研究; 宾夕法尼亚州West Grove）。对于用两种动粒蛋白、细胞进行的联合实验与两种蛋白的抗体同时孵育上述单个抗体。PBST冲洗后，细胞用适当的二级抗体培养。荧光素共轭抗动力蛋白的驴抗鼠二级抗体初级核与罗丹明同时孵育标记动力蛋白时的Red-X结合驴抗兔抗体与BubR1、CENP-E或Mad2蛋白结合。对于同步Mad2和CREST标记，罗丹明红-X驴抗兔（针对抗Mad2原药）和Alexa Fluor 488-共轭山羊抗人培养次级抗体（分子探针、尤金、OR）一起。

CREST血清是B.R.Brinkley博士（贝勒学院Medicine，德克萨斯州休斯顿），并以1:750的稀释度使用。亲和纯化的CENP-E和BubR1抗体(陈等。,1998,1999)以1:500的稀释度使用。抗3F3/2磷脂酶检查仪（由美国大学Gary Gorbsky博士提供俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛健康科学中心）用于1:1500稀释。如前所述，对Mad2抗体进行亲和纯化在里面水域等。(1998)并以1:100的稀释度使用。这个胞质动力蛋白70.1 IC的单克隆抗体（Sigma D5167）以1:2000稀释度使用。免疫染色细胞被安装在在90%甘油、10%Tris缓冲液中预先清洗的显微镜载玻片0.5–1%正丙基半乳糖供后续观看。

显微镜和图像采集

免疫荧光标记细胞以多模式观察数字荧光显微镜系统(三文鱼等。,1994). 图像是用冷却的滨松C4880获得的电荷耦合设备数字相机（12-μm平方像素），带使用配备60X/1.4 NA的尼康麦克风FX-a显微镜物镜和2.0倍光学投影镜。两个差速器获得了干涉对比度（DIC）和荧光图像控制中期细胞和实验细胞。要确定控制细胞在核进展阶段的进展包膜破裂，使用相差显微镜观察核内染色体的成熟期60X/1.4 NA 3相物镜。数字图像由获取MetaMorph图像处理软件（Universal Imaging，West Chester，PA）。获得了通过每个分析单元的Z系列光学截面0.5μm步长，使用MetaMorph软件和Ludl（纽约州霍桑）步进电机。

前期细胞核内的动粒缺乏细胞质Dynein、BubR1和新月形态

我们发现PtK1在早期晚期有动粒CENP-E、Mad2和3F3/2抗原染色较亮的细胞，但没有用于细胞质动力蛋白或BubR1（图​（图2）。2). 细胞质动力蛋白与Bub1R结合核膜破裂和进入后的动粒进入前中期（图​（图2）。2). 因为前期核缺乏我们问，用诺卡唑处理过的微管样有丝分裂细胞前期细胞核中的动粒是否也出现新月形或环状形态。然而，没有动粒检测到的蛋白质呈新月形或环状（图​（图2）2)对照组或细胞处理4小时诺卡唑,表明新月形构造是一种属性前中期动粒。

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图2

BubR1、CENP-E、，细胞质动力蛋白、Mad2和对照间期的3F3/2抗原，中晚期前期和早期前中期细胞。相衬度和罗丹明荧光图中所示为间期细胞（左），中晚期细胞（中央）和早期前中期细胞（右侧）。仅CENP-E，Mad2和3F3/2抗原在前期，而BubR1和细胞质动力蛋白在动粒直到核膜破裂。不前中期可见新月形或环状形态动粒。刻度：10μm=0.33 in。

未连接之间动粒组件的变化前相移行细胞和后相移行细胞染色粒

我们使用定量免疫荧光显微镜来比较动粒不同蛋白质的变化与它们在完全附着和紧张的动粒上的价值染色体在中期板上排列。对于分析的每个细胞，DIC光学z序列和相应的荧光图像以0.5μm的步长通过细胞每个PtK1细胞中的动粒对可用于定量荧光分析。当荧光免疫标记的动粒模糊，因此很难识别为了检测，动粒的位置被确定为外围相应DIC图像中增加的“凸起”染色体臂的着丝粒收缩。7到10对细胞中的每种蛋白质和处理进行分析。集成的每个免疫染色抗原在动粒上的荧光由定量图像分析确定，最初由国王等。(2000)并在材料和方法中进行了描述和图​图3。三.

我们首先研究了单取向染色体或主要动粒聚集染色体（见图​图4A）4A） 因为这些动粒有零或一到三个动粒微管，并且可以被认为是独立的动粒(麦克尤恩等。, 1997). 图​图4B4B显示了未附着的动粒之间的荧光强度动粒和动粒中期对齐的染色体，具有完整的补体动粒微管。有几个重要的结果。我们没有看到内核CREST荧光在未连接的、引导的或中期的动粒（图​（图4B）。4B） ●●●●。相反，所有外结构域蛋白在中期动粒的强度（图​（图55和表​表1），1)，表明外域蛋白组装对动粒微管的形成很敏感。CENP-E和BubR1的综合强度在中期排列时动粒增加三到四倍（图​（图5A），5A） 然而，这些蛋白质仍然丰富而清晰中期动粒可见（图​（图4B）。4B） ●●●●。细胞质的达因似乎没有专注于独立或领导前中期动粒作为CENP-E和BubR1。五对一细胞质动力蛋白荧光强度降低6倍中期对齐（图​（图5B）5B） 在动粒几乎不可见，不像中期CENP-E和BubR1的荧光（图​（图4B）。4B） ●●●●。然而，这个弱者荧光显示一些细胞质动力蛋白仍然存在中期动粒。相反，Mad2不可见中期目视背景荧光动粒（图​（图4B），4B） ，但测量表明略高于背景（表​（表1）。1). 此外，Mad2是测量表明，独立或领先时，其数量增加了100倍前中期动粒与中期动粒（图​（图5B5B和表​表2）。2). 因此，在所有测试的蛋白质中动粒，Mad2对消耗最敏感中期实现的微管附着和/或张力动粒。

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图4

（A） 显示相对数量的图表无附着的动粒微管单定向染色体上的动粒（1；no动粒微管），引导动粒关于聚集染色体（2；根据麦克尤恩et（等）等。, 1997，它们通常具有一些微管与独立的动粒分组），并且完全染色体上附着的动粒在中期板（3；这些与成熟的动粒结合纤维，含有～25个微管[麦克尤恩et（等）等。, 1997])在前中期细胞中。非动粒为清晰起见，未显示纺锤形微管。（B） 免疫荧光比较未附着或领先的荧光强度的图像未对齐染色体和完全附着染色体的动粒中期对齐染色体的动粒蛋白质Bub1R、CENP-E、CREST、细胞质动力蛋白和Mad2。CREST公司保持不变，BubR1和CENP-E消耗至中等水平，细胞质动力蛋白耗竭至低水平，Mad2变为无法检测。照片中的像素密度较高比原始显微照片中的要多。刻度=1μm。

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图5

相对变化的定量比较非附着或领先动粒的荧光前中期（图​（图4A）4A） 用CENP-E和BubR1抗体标记（A） 以及（B）中的细胞质动力蛋白和Mad2抗体相对于中期平板染色体上的动粒。平均表中的值​表11归一化为中期的那些值控制单元。注意未附着或领先的动粒显示相对于4.4条中期对齐染色体的动粒BubR1（A）、2.9（CENP-E（A用于Mad2（B）。

延长诺卡唑治疗可增强外结构域蛋白细胞质Dynein显著增加的组装

我们询问了内核和动粒外结构域蛋白在动粒被剥夺了与微管的相互作用用20μM诺卡唑处理细胞30分钟或4小时，解聚所有微管（图​（图6A）。6A） ●●●●。以前的研究表明20μM诺卡唑，非动粒微管前中期和中期细胞在1-2分钟内消失在固定细胞中不能检测到动粒微管20分钟后进行电子显微镜检查(卡西梅里斯等。,1990). 我们发现核心CREST抗原的数量没有变化诺卡唑处理细胞的动粒。然而，我们确实观察到了外结构域蛋白质数量的变化测试（图​（图6A6A和​和77和表​表2）。2). 相对于中期动粒，用我们的0.9-×0.9-μm测量积分荧光以CENP-E动粒为中心的测量区域30分钟时增加2.5倍，4小时时增加3.8倍，而BubR1在30分钟或4小时（图​（图6A6A和​和7A）。7A） ●●●●。相反，集成荧光以相同方式测量的细胞质动力蛋白和Mad2均增加在30分钟时增加60倍，在4小时时增加100倍与未处理中期相比，微管缺失细胞动粒值（图​（图6A6A和​和7B）。7B） ●●●●。这些测量值经诺卡唑处理的CENP-E、BubR1和Mad2动粒与我们测量的值相似前中期未附着的动粒。令人惊讶的是在30分钟和4h分别比预测值大得多未连接或领先测量值的5.5倍前中期的动粒。

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图7

相对变化的定量比较标记动粒的荧光染色强度（A）和细胞质动力蛋白中含有CREST、CENP-E和BubR1抗体（B）中与动粒相关的Mad2抗体各种实验中控制细胞的中期染色体协议列在x个-轴。取平均值来自表​表22归一化为中期控制的那些值细胞。数值低估了月牙形荧光总量，如结果。注意（A）中的CENP-E和BubR1荧光诺康唑作用30min或4h后细胞内的动粒固定孵化后强度增加了2.5到4倍中期动粒失控。当受到紫杉醇处理以测试张力效应，或高浓度培养钙²⁺用于测试微管空间位阻的缓冲液动粒上的CENP-E和BubR1荧光没有改变了控制中期细胞的值。在（B）中注意到小鼠动粒的细胞质动力蛋白和Mad2荧光诺康唑孵育30分钟后固定的细胞显示强度在55至65倍范围内超出控制范围。诺卡唑孵育4小时后，两种强度都进一步增加至100至110倍。与CENP-E和BubR1一样，细胞质动力蛋白染色接受紫杉醇治疗的中期细胞中的动粒高钙处理或培养²⁺缓冲区后单元裂解显示出与对照中期相似的荧光动粒。

上述综合荧光测量诺科达唑处理的细胞中的动粒蛋白可能由于动粒进入月牙形和环状形态我们的0.9-×0.9-μm测量区域（图​（图3），三)尤其是在在诺卡唑中放置4小时（图​（图6A），6A） 以及我们无法准确测量新月和/或圆环边缘的贡献。我们平均测量中的误差不太可能低估由于新月强度，实际值增加了2倍以上远离动粒中心减少，许多动粒没有显示环状。

随着诺卡唑诱导的张力释放动粒微管消失，距离在用药物作用30min和4h后降至1.23±0.13μm（n=30）和1.12±0.16μm（n=34）分别来自观察到的控制中期值为2.43±0.38μm（n=39). 中动粒间距离的值诺卡唑处理的细胞与姐妹细胞的距离相似前期细胞核内的动粒，0.90±0.13μm（n=48）。

外结构域蛋白组装和动粒形态在洗涤后是可逆的诺卡唑诱导纺锤重组。清洗后30分钟诺卡唑，细胞进展到近中期动粒呈现点状形态中期排列的积分荧光强度值控制细胞中的染色体（图​（图6A6A和​和77和表​表2）。2). 这个表明在动粒外部测得的变化结构域蛋白的组装和形态直接依赖于缺失或微管的存在。

在具有紫杉醇稳定的微管对外域蛋白影响不大装配

未连接的动粒不同于中期板染色体的动粒方式：它们缺乏动粒微管，而且它们不是在连接处的净拉力产生的张力下动粒(水域等。，1996年b；科德贾科夫和Rieder，1996年；尼克拉斯，1997年). 以前，水域等。(1998)测试张力在诱导中期PtK1动粒Mad2的缺失用10μM紫杉醇处理中期细胞45分钟微管稳定药物(水域等。，1996年a). 这个治疗维持正常中期补体动粒微管(麦克尤恩等。, 1997)同时诱导动粒张力的损失由于着丝粒间缺乏伸展地区(水域等。，1996年a).水域等。(1998)发现只有少数动粒表现出在这些条件下Mad2定位的可检测量。随后，Martinez-Exposito公司等。(1999)未找到未经治疗和紫杉醇治疗之间的Bub3水平显著增加中期动粒。在我们的测试中张力，我们还发现BubR1、CENP-E、细胞质动力蛋白和Mad2的值没有改变紫杉醇处理后中期动粒（图​（图6B6B和​和77和表​表2）。2). 动粒张力损失紫杉醇处理的细胞经观察证实距离姐妹动粒之间降至～1.20±0.17μm（n=30），从平均中期控制值2.43±0.38微米（n=39）。

动粒新月形和环状形态与动粒耗竭和非动粒微管和动粒结合细胞质Dynein的数量

我们发现了独立前中期的两个主要差异动粒和缺乏诺卡唑处理细胞中的微管。我们从未观察到单身具有延伸新月形或环状的前中期动粒动粒的典型形态诺卡唑处理的细胞。MG-132实验表明有丝分裂不会诱导动粒在微管未分解的细胞中的中期染色体发生。此外，相对于中期的浓度未附着的细胞质动力蛋白的动粒前中期动粒（～5倍）大于小于动粒测量值的数量级诺卡唑处理的细胞（至少50到100倍）（图​（图55和​和7）。7). BubR1、CENP-E和Mad2在未连接之间没有显著变化前中期细胞中的动粒和诺克唑处理细胞中的动粒（图​（图55和​和7）。7).因此，延伸新月形和环状形态的形成动粒外结构域与缺乏微管和大量增加的动粒细胞质动力蛋白。在这方面，前期动粒缺乏周围的微管诺可唑处理的前中期细胞中的动粒，但无新月形或环状形态，无束缚细胞质dynein（图​（图22).

在诺卡唑处理的前中期细胞中，所有外域蛋白以及与细胞质均匀共定位的3F3/2抗原新月体和环中的动力蛋白（图​（图1）。1). 这表明细胞质动力蛋白的积累和向新月体和环状形态分散了BubR1、CENP-E和Mad2.扩大的新月形和环状可能反映了外板冠状丝，因为它们含有细胞质dynein和CENP-E（在Rieder和Salmon，1998年；马尼et（等）等。, 2000).

解释这些微管依赖性差异的简单假设在未附着的前中期动粒和诺科达唑处理的细胞中的动粒是动粒与非动粒的相互作用微管阻止未附着的前中期动粒形成新月形或环状形态或堆积高度动粒处细胞质动力蛋白的浓度。由这种机制，动粒扩张需要最小的无微管相互作用和无前中期的持续时间动粒缺乏微管相互作用的时间足够长超过此持续时间。这解释了为什么动粒诺康唑使新月和环状形态迅速消失清洗和主轴微管重新组装（图​（图66).

细胞质动力蛋白的微管运动活性可能是一个关键理解胞质动力蛋白组装动力学的因素动粒。细胞质动力蛋白向朝向纺锤极的微管的负端(井上菜和鲑鱼，1995年). 这种运动将为在存在的情况下驱动细胞质动力蛋白的解离近端非动粒微管处于前中期，但当微管被诺卡唑耗尽时则不会。耗尽微管消除了这种离解力细胞质池中细胞质动力蛋白的积累和外域扩张成新月形和环状。这个当微管重组后，解离力返回诺卡唑洗脱，从动粒。细胞质动力蛋白被进一步耗尽大约是前中期动粒的六倍它们获得了完整的中期动粒微管（图​（图5）。5). 这种进一步的损耗也可以解释通过增强由额外的运动机会动粒微管。Dynein驱动的运输微管也可能导致微管依赖性耗竭并解释了来自独立动粒的荧光Mad2(豪厄尔等。, 2000).

尽管这种动力蛋白驱动的外结构域蛋白的耗竭是一种解释形态差异的吸引力假说前中期和诺卡唑处理的动粒还有其他可能需要在未来进行测试。非动粒微管可以为耗尽细胞质池中的细胞质动力蛋白，减少其与动粒和还原相关动粒扩张。纺锤体微管可能浓缩激酶或磷酸酶和/或其活性监管机构(冈德森和库克，1999年)可以调节细胞质动力蛋白的结合与解离与细胞增殖动粒外域。最后，扩张可能要求姐妹动粒都不附属于微管。这不太可能依赖于紧张局势，因为紫杉醇处理的中期细胞中的动粒缺乏张力但不要出现膨胀的新月形（图​（图66).

中期成熟期间外结构域蛋白质的耗竭动粒受微管附着支配而非由张力变化直接控制

我们未发现对中期动粒蛋白的影响成分（数字​（图66和​和77和表​表2）2)来自增强的程序集紫杉醇引起的非动粒微管稳定，稳定(水域等。，1996年a).麦克尤恩et（等）等。(1997)也发现中期的数量几乎没有变化动粒微管。因此，无论效果如何非动粒纺锤体微管动粒组装是通过正常程度的纺锤体微管在前中期和中期组装。如图所示Mad2的更早版本(水域等。, 1998)和Bub3(Martinez-Exposito公司等。, 1999)，我们发现紫杉醇处理的中期动粒张力不改变CENP-E、BubR1或细胞质动力蛋白。因此，对于PtK1中的这些外结构域蛋白质细胞，微管附着占主导地位中期调节其数量的张力变化动粒。这可能是动粒因为最近的一份报告国王et（等）等。(2000)显示了细胞质动力蛋白和减数分裂蝗虫精母细胞动粒上的CENP-E取决于动粒微管的形成，而不是直接紧张。然而，紧张似乎间接调节了通过稳定动粒组装动粒微管附着(金和尼克拉斯，2000年).

动粒组件的差异变化动粒微管形成

与未附着的前中期动粒相比，中期染色体上动粒的外结构域两种微管运动蛋白都显著缺失微管附着和纺锤体检查点蛋白的作用产生等待相位信号。我们发现这些蛋白质可以分为两类，这取决于耗竭程度。Mad2本身属于一个组，因为它是随着动粒微管的形成而减少100倍（图​（图5）。5). 我们的第二组包括CENP-E、细胞质动力蛋白和BubR1被动粒耗竭三到六倍微管形成。定量免疫荧光测量HeLa细胞中的Bub3也减少了3.5倍(Martinez-Exposito公司等。, 1999)独立与中期排列染色体上附着的动粒。Bub3将Bub1和BubR1靶向动粒(泰勒和McKeon，1997年). 定性免疫荧光分析表明Bub1HeLa和U2OS中期动粒的耗竭哺乳动物细胞与BubR1细胞相似(贾布隆斯基et（等）等。, 1998). 因此，我们对BubR1的测量预测Bub1，当染色体达到动粒微管的中期补体。类似根据我们的测量，HeLa中CENP-E的三倍损耗动粒微管的动粒免疫金电子显微镜已发现其形成(姚明等。, 1997). 生化分析表明CENP-E和BubR1物理上相互作用，这可能解释了它们消耗的原因微管附着量相似(陈等。,1999；姚明等。, 2000). 在国王等。(2000)对减数分裂I型蝗虫精母细胞的研究，他们发现10-和细胞质动力蛋白和CENP-E浓度低3倍，分别在中期动粒上与分离染色体上的动粒。这些值非常与我们对有丝分裂哺乳动物组织细胞的测量结果类似。视觉免疫荧光染色动粒的检查显示了以Mad2为靶点的Mad1，动粒微管大量减少形成(陈等。, 1998；陈等。, 2000；坎贝尔等。2001年)，但还没有减少定量。Mad1与Mad2紧密结合(陈等。, 1999)，所以像Mad2一样，它很可能被微管大量消耗掉附件。综上所述，上述分析表明Bub1、BubR1、Bub3、CENP-E和细胞质动力蛋白消耗三到五倍，动粒微管形成哺乳动物细胞和所有这些蛋白质在中期持续存在动粒。Mad2与此组不同，因为它在中期动粒上几乎检测不到。

上述定量分析为独立前中期动粒的想法大量微管运动蛋白显著增强动粒微管的补充，以及大量纺锤体检查点蛋白放大延迟后期发作的抑制信号(Rieder和Salmon，1998年；豪厄尔等。, 2000). 这些蛋白质的消耗与动粒宽度在前中期和中期动粒微管(里德，1982年)以及从外板伸出的日冕细丝密度（图​（图8；8；里德，1982年；鲑鱼，1989年；卡西梅里斯et（等）等。, 1990). 细胞质数量的大幅增加诺科达唑处理的细胞中动粒上的动力蛋白可能具有一种提高微管招募概率的功能微管密度为非常低。

染色体上的主要动粒聚集在中期板不同于尾部动粒两种方式。首先，主要的动粒附着在一个到三个动粒微管，而拖尾动粒有13个或更多的动粒微管（图​（图2A；2A；麦克尤恩等。, 1997). 第二，领先的动粒具有较高的细胞质动力蛋白和CENP-E典型的未结合动粒，而拖曳的动粒通常会耗尽到较低的中期水平，因为附着的动粒微管。虽然领先动粒可能较少微管，较高浓度的运动蛋白可能使其着丝粒上的主要拉力，使尾部产生偏差动粒进入非抽吸状态，如所述斯基本斯等。(1993)、和里德和鲑鱼（1994,1998).这种偏差可能导致染色体持续向中期板(水域等。，1996年b)其中领先和落后的姐妹动粒能够获得完整的动粒微管和CENP-E浓度相等，且细胞质动力蛋白(Rieder和Salmon，1998年).

与Bub1、BubR1和Bub3不同，Mad2的消耗量为中期动粒的大小。这个广泛的Mad2的耗竭是由抑制作用的一部分Mad2预测的动粒发出的信号不正确动粒微管的补体。当前模型是独立的动粒抑制后期发作吗(Rieder公司等。, 1995)通过催化Mad2结合和抑制cdc20蛋白，抑制细胞质中的生成后指复合体(陈等。; 1998；戈尔布斯基等。, 1998；哈德威克等。, 2000；豪厄尔等。, 2000). 中期几乎不存在Mad2动粒表明动粒Mad2抑制活性的产生被关闭。

我们感谢Gordon Chan和Sandra Jablonski提供1.6CENP-E和hBubR1亲和纯化抗体以及Bloom和Salmon实验室寻求对手稿的帮助和评论。这个这项研究得到了美国国立卫生研究院GM-24364的资助E.D.S.和美国国立卫生研究院（National Institutes of Health Grants）GM-44762和CA-06927，Dimes基金会的拨款宾夕法尼亚联邦至T.Y。