初级哺乳动物细胞文化表现出有限的增殖能力，在此之后衰老(1,2). 在增殖人体体细胞时端粒酶不正常表达，端粒从末端侵蚀染色体起着“有丝分裂时钟”的作用，对细胞进行计数部门。在有限数量的分裂周期之后，随之而来的端粒功能障碍激活细胞周期检查点控制触发复制性阻滞（“衰老”）。肿瘤切除术视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）和p53的抑制作用转录因子绕过这个检查点阻滞并赋予细胞寿命延长。然而，端粒进行性缩短最终导致染色体不稳定和凋亡（“危机”），即使有细胞，也几乎没有存活下来。为了逃避危机，细胞必须通过激活端粒来重新激活端粒端粒酶或通过开发替代重组机制端粒维持。正常人体细胞在绕过衰老和危机的文化可能是他们作为持续增殖细胞系的罕见建立（综述参考文献。三和4).
培养的啮齿动物细胞表现不同。实验小鼠被赋予端粒比人类染色体长5到10倍(5)端粒酶活性可以在许多体细胞中检测到(6).事实上，缺乏端粒酶RNA亚单位编码基因的小鼠完全健康，仅揭示端粒功能障碍的后果当通过多个连续世代进行杂交时(7). 然而，尽管明显缺乏基于端粒酶的有丝分裂时钟，移植的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）更容易衰老比人类皮肤成纤维细胞更快。在MEF中细胞周期进展抑制剂是端粒非依赖性细胞永生化屏障。一个假设培养的啮齿动物细胞的衰老反映了p53和Rb依赖性细胞周期检查点的激活组织培养本身的非生理条件（“培养冲击”）(4,8). 人类细胞也可能以这种方式作出反应，但作为一个长寿的物种，它们的细胞可能进化出更多使自身免受由文化环境。这一想法得到了年实验的支持文化条件的具体变化大大扩展了人类和啮齿动物细胞的寿命，在某些情况下保证移植的初代细胞持续增殖啮齿动物细胞(9–11).
这个墨水4a-Arf基因座编码两种不相关的蛋白质，第16页墨水4a和第19页阿尔夫,基因外显子2内的选择性阅读框部分编码(12). 这些蛋白质是通过以下方式阻止细胞周期的肿瘤抑制因子分别调节Rb和p53的活性(13). 这个第16页墨水4a蛋白质抑制细胞周期蛋白D依赖性激酶，Cdk-4和Cdk-6，防止它们磷酸化和灭活Rb(14). 无关的p19阿尔夫蛋白质是对有丝分裂阈值升高的反应而诱导的c-Myc、E2F-1、E1A、Ras、，v-Abl和其他癌蛋白(15–19). 第19页阿尔夫绑定和失活p53负调控因子Mdm2的功能，从而增强p53活性并诱导p53依赖性生长停滞或细胞凋亡，取决于生物学背景(20–23).
虽然在小鼠胚胎发育期间未检测到，第16页墨水4a和第19页阿尔夫是随着移植的MEF在体内传代，逐渐诱导和积累文化(24). 来源于主要MEF培养物表现为第53页或阿尔夫以互斥方式丧失功能(24). 此外，MEF来源于缺乏阿尔夫单独或墨水4a-Arf没有经历任何可检测到的复制性衰老阶段(25,26)，尽管来自阿尔夫-空鼠继续表达高水平的p16墨水4a因此，在这两者中由编码的产品墨水4a-Arf基因座，第19页阿尔夫在预防MEF中起主导作用永垂不朽。
不同的基因事件可能很好地支配着其他人的永生培养中的细胞类型，许多证据表明第16页墨水4a在施加增殖屏障，尤其是在各种人类细胞株中(三,4,27). 这里，我们展示了这一点，而消除阿尔夫是明显足以建立骨髓源性前B细胞作为培养中不断增殖的细胞系，BM-derived巨噬细胞优先沉默墨水4a没有损失紧密连接的Cdk抑制剂的表达，第15页墨水4b，或p19的阿尔夫.
材料和方法
细胞和培养条件。
将从小鼠股骨和胫骨中提取的细胞移植到在RPMI 1640培养基（Mediatech，弗吉尼亚州赫恩登）补充5%FCS/55μM2-巯基乙醇/2 mM谷氨酰胺、青霉素和链霉素（GIBCO）(28,29)和所描述的表型(30). NIH 3T3子克隆被设计用于分泌人重组白细胞介素-7（DNAX）和为培养任一原代细胞提供有效的基质细胞支持前B细胞或IL-7依赖细胞系（参考。30和数据未显示）。每隔3天取出2/3的前B细胞，培养基为并允许残余细胞增殖，直到生长停止（野生型细胞培养1-2个月）或直到实验阿尔夫-空单元格已终止。第10天外植后，一些preB细胞从饲养者转移到无基质支持的IL-7条件液体培养基(30). 细胞是以2.5×密度电镀三份105/6孔板中的ml，每2孔计数一次天，并在新鲜培养基中重新稀释至起始密度第四天。在这些条件下，IL-7对细胞没有抑制作用增殖。
骨髓源性巨噬细胞的原代培养产生于4至8周龄阿尔夫-无效的，墨水4a-Arf-null，以及野生型小鼠。细胞以1×106DMEM中每毫升细胞数（BioWhittaker）补充15%FCS/5.5μM2-巯基乙醇/2 mM谷氨酰胺、青霉素和链霉素和L细胞衍生集落刺激因子-1（CSF-1）(31). 24小时后去除非粘附细胞，在新鲜培养基中的相同细胞密度，重新移植，然后在第二次48小时孵育从粘附细胞中分离祖细胞吞噬细胞和成纤维细胞。最后一次播种非粘附细胞以相同密度繁殖3-4天直到汇合[通道（P）-1]。Mac-1抗体染色（M1/70PharMinen）和F4/80(32)发现所有细胞都表达巨噬细胞标记物。刮下的细胞以4×105每毫升，喂食L细胞调节介质每2天，汇合时计数，在新鲜培养基中稀释1:5在重放之前，并在整个实验。测定了6名独立受试者的生长动力学每种基因型的培养物计数为三份。老鼠CSF-1依赖性巨噬细胞系BAC1.2F5维持为描述(32); 转化前B细胞第210页BCR-Abl公司是Owen Witte送的礼物（加利福尼亚大学洛杉矶分校）。MEF（克隆10）包含突变型p53及其高水平表达第19页阿尔夫和第16页墨水4a是以前导出的(24).
辐射和细胞凋亡测定。
PreB细胞于10时悬浮6每毫升中的细胞数含有IL-7的培养基，用铯的4Gy照射来源。24小时后通过分析膜联蛋白V和碘化丙啶染色的细胞(33). BM-衍生用5 Gy照射巨噬细胞，收获、裂解并分析通过免疫印迹法诱导p53和Mdm2。
免疫印迹。
冷冻细胞颗粒在冰镇EBC缓冲液中溶解(34). Nuclei和碎片被沉淀，蛋白质被BCA蛋白定量检测试剂盒（Pierce）。蛋白质（每道200μg）分离12.5%将含有SDS的变性聚丙烯酰胺凝胶转移至硝化纤维素（马萨诸塞州韦斯特伯勒市奥斯莫尼茨）和可视化（Western Blot化学发光试剂，NEN生命科学公司，波士顿），印迹后用亲和纯化的兔多克隆抗血清特异性Cp19的末端阿尔夫(12)或第16页墨水4a(35)，带有Mdm2抗体2A10(15),或带有针对p53（Ab7，Calbiochem）或α-微管蛋白（T-5168 Sigma）。兔多克隆抗血清（RAE）第15页墨水4bC末端用于检测蛋白质的顺序沉淀和印迹(24).
RNA分析。
使用RNAzol B从培养的巨噬细胞中提取总RNA（德克萨斯州Friendswood Tel-Test）。分离RNA（50μg/车道）在含有甲醛的凝胶中电泳，吸干至Hybond-N+尼龙杂交膜（Amersham Pharmacia Biotech）并使用110-bp进行检测[32P] -已标记特异性探针的外显子1α墨水4a-Arf轨迹(35).
甲基化特异PCR（MSP）。
对基因组DNA和MSP进行了二硫化物修饰(36)带有设计用于扩增PCR产物的引物集墨水4a启动子区和外显子1α。检测甲基化DNA的引物产生了199-bp PCR产物（根据GenBank登录号。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“L76150”，“term_id”：“1162948”}}L76150型)而那些杂交到未甲基化的模板扩增出197bp的产物（核苷酸位置10–207). 外显子1α的保留通过扩增未经处理的用野生型引物产生201-bp片段的基因组DNA（核苷酸位置6–207）。引物序列为：（甲基化）5′-ATACGATTGGGCGATGG-3′（意义）和5′-CACCTAAATCGAAATACGGACCGA-3′（反义）（非甲基化）；5′-ATGATGGGTGA-TTGGTG-3′（意义）和5′-CATCACCTAAAATCAAAATAA-3′（反义）；和（野生型）5′-TCACACGATCGGCGATTGG-3′（意义）和5′-CACCTGAATCGGGTACGAC-3′（反义）。反应在95°C下开始7.5分钟，塔克添加聚合酶（Promega），并扩增DNA30个变性循环（95°C，30 s），退火（61°C，甲基化；51°C，未甲基化，56°C，野生型，30 s）和使用热循环器（5331）延长（72°C，45 sMastercycle，Brinkmann）。PCR产物在2.0%琼脂糖上可见三乙酸盐/EDTA电泳缓冲液中的凝胶溴化乙锭（0.5 ng/ml）。
结果
第19页阿尔夫虚证预防原发性preB的衰老细胞。
我们从骨中获得了长期IL-7依赖性B淋巴细胞培养年龄匹配的野生型和阿尔夫-使鼠标无效。什么时候？在NIH 3T3饲养细胞上培养表达IL-7，髓系祖细胞无法存活，且前B细胞数量相同（>90%）在10天后生长出来。野生型小鼠的前B细胞可以在馈线层上不断膨胀，最初每层增加一倍2-3天，但他们在1-2个月内经历了复制性衰老(28). 相反，阿尔夫-空preB细胞增殖以显著更快的速度持续增长，每24小时翻一番h、 即使在培养3个月后，许多这样的实验终止（数据未显示）。当野生型前B细胞被移除时从饲养层培养10天后，并在更多条件下繁殖饱和条件下严格的液体培养条件IL-7的数量，但没有其他基质因子，细胞增殖速度较慢，每5天翻一番。2周后液体培养基，细胞增殖停止，细胞逐渐死亡（图。A类). 相反，阿尔夫-空白前B细胞每1.5天翻一番并增殖在整个实验期间（图。A类). 的确阿尔夫-null preB细胞与建立、转化和致瘤前B细胞系，表达第210页BCR-Abl公司癌蛋白。
第19页阿尔夫缺乏绕过前B细胞的衰老。(A类)测定了五种细胞的生长动力学独立导出的线阿尔夫-空（■）在含有IL-7的培养基和与之前由BCR-Abl公司(⧫). (B类)暴露于4 Gy后γ射线照射，指示基因型的前B细胞(底部)培养24h并用膜联蛋白V和碘化丙啶测定细胞活力。(C类)在表达IL-7的饲养器上维持前B细胞每10天（天，底部)在两个月的时间里。结果与BCR-Abl转化细胞获得的细胞（p210）。蛋白质是用抗体直接免疫印迹法检测第19页阿尔夫和第16页墨水4a，如左图所示保证金。α-微管蛋白检测用于确认相等的蛋白质加载。
阿尔夫-之后立即建立无效的MEF尽管它们积累了大量的第16页墨水4a关于进一步通过(26). 同样，两者都是野生型和阿尔夫-累积的前B细胞为空第16页墨水4a蛋白质（图。C类)即使是在产生IL-7的饲养层上饲养。迟通过阿尔夫-空的前B细胞在尽管p16功能强大，但仍具有相同的高速率墨水4a表达式。增加p19阿尔夫蛋白质表达观察到野生型前B细胞衰老（图。C类).细胞永生化BCR-Abl公司还表达了高水平的第16页墨水4a，尽管有选择地消除p19的表达阿尔夫（图。C类),与之前的观察一致，v-Abl公司表达在preB细胞中，选择丢失任一p19阿尔夫或p53功能(19). 因此，在由墨水4a-Arf基因座，仅p19阿尔夫是需要在前B细胞中实施复制性阻滞。
五个独立的阿尔夫-null preB细胞系保持在产生IL-7的喂食者至少3个月仍然依赖IL-7为了成长和生存。G公司1保留相细胞二倍体，这是永生的特征阿尔夫-空MEF并将其与已建立的成纤维细胞系区分开来缺乏p53功能并迅速成为四倍体(24,26). PreB细胞经测定，株系表达的野生型p53水平很低区分正常亚型和突变亚型的抗体（数据不是如图所示）。因为突变型p53不能转录激活其阴性调节因子Mdm2、突变型p53是稳定的。未能积累p53蛋白也意味着p53突变没有发生。当preB细胞暴露于低剂量γ射线照射时（4 Gy），24小时后用膜联蛋白V，阿尔夫-空单元格，就像它们的野生类型对应人员高度敏感，并迅速接受凋亡（图。B类)，而第53页-空前B细胞具有明显的耐药性（图。B类) (37).总的来说，这些数据意味着阿尔夫-空preB细胞可以在没有维持的情况下，继续以高速繁殖p53或p16墨水4a功能丧失。
第16页墨水4a放松管制伴随着骨髓源性巨噬细胞细胞系。
小鼠巨噬细胞细胞系之前是在腹腔巨噬细胞或髓系祖细胞感染复制缺陷型猿猴病毒（SV）40及其传播含有CSF-1的培养基中的细胞。建立巨噬细胞细胞系病毒感染后1-2个月出现，但为非整倍体，无长期依赖CSF-1进行增殖或存活(38,39). 收件人日期，只有一个CSF-1依赖的二倍体小鼠巨噬细胞系具有在骨髓祖细胞感染SV40病毒后衍生(32,40). 这些BAC1.2F5细胞持续的双等位基因缺失墨水4a-Arf基因座，但缺乏可检测的SV40病毒DNA(35).
确定是否主要阿尔夫-无效巨噬细胞，如阿尔夫-如果小鼠前B细胞和MEF为空，则会出现延长培养寿命，我们将骨髓源性巨噬细胞移植到含有CSF-1的培养基。在这些条件下墨水4a-Arf-空白BAC1.2F5巨噬细胞在加倍时间(T型d日)1.3天整个串行通道（图。A类和表). 我们强调这些细胞多年来一直在文化中传播，并且定期亚克隆以保持CSF-1依赖性；因此，他们有充足的在他们漫长的历史。引人注目的是，墨水4a-Arf-空直接从小鼠移植的巨噬细胞也保持恒定在整个实验过程中加倍时间(T型d日=1.9天）接近BAC1.2F5细胞。野生型巨噬细胞增殖速度慢得多(T型d日=7.1天）培养月份（图。A类和表). 巨噬细胞缺乏阿尔夫单细胞增殖速度快于野生型细胞在此期间(T型d日=3.3天），但增长速度比他们慢墨水4a Arf-空对应项（表). 然而，最终，更快速增殖的细胞从两者都是阿尔夫-null和野生型种群，以及这些在剩下的实验中表现出更快的倍增时间。后一种培养物在没有增殖率的任何进一步变化。所有晚传代细胞基因型仍然依赖于生长因子，保留巨噬细胞表面标记，并证明了抗体包被禽的吞噬作用红细胞（数据未显示）。这些数据表明(我)都是p16墨水4a和第19页阿尔夫合作防止建立小鼠巨噬细胞系，以及(ii（ii）)野生型和阿尔夫-空的巨噬细胞可能持续额外的突变这有助于他们适应文化。
巨噬细胞的增殖动力学和蛋白质表达不同基因型。(A类)培养的骨髓源性巨噬细胞在60毫米直径的培养皿中，当汇合和再稀释1:5时进行计数用于下一段。绘制了六种独立培养物的数据派生自阿尔夫-空（■），墨水4a-Arf-空（⧫）和野生型（▴）小鼠，并与已建立的巨噬细胞进行比较线路，BAC1.2F5（●）(B类)单元格在指定时间服用，检测第16页墨水4a免疫印迹法检测α-微管蛋白。巨噬细胞对指定时间（天）的生长进行直接分析p19的免疫印迹阿尔夫(C类)或通过p15的顺序免疫沉淀和印迹墨水4b(D类). (E类)显示的巨噬细胞基因型(顶部)连续不同时间后文化(底部)暴露于5Gyγ射线照射（+）或不治疗（−），并通过免疫印迹分析p53和Mdm2蛋白诱导。具有多个代表性的结果独立衍生的种群如所示C–E类.
表1
| 基因型 | 通道 | 天在文化上 | 加倍时间，天 |
|---|
| 野生类型 | 第2页–第5页 | 1–36 | 7.1 |
| 第5页至第10页 | 36–72 | 2.6 |
| 阿尔夫-无效的 | 第2页–第6页 | 1–28 | 3.3 |
| 第6页–第10页 | 28–48 | 1.7 |
| 墨水4a-Arf-空 | 第2页–第10页 | 1–42 | 1.9 |
| BAC1.2F5型 | 第2页–第10页 | 1–27 | 1.3 |
考虑到外植体世代的初始差异墨水4a-Arf-null和阿尔夫-无效巨噬细胞显而易见的可能性是，额外的突变加速了扩散阿尔夫-空单元格可能反映后续p16表达缺失墨水4a.免疫印迹对细胞裂解物的分析表明，出现了快速生长野生型或阿尔夫-空巨噬细胞与第16页墨水4a蛋白质表达（图。B类). p16缺失墨水4a从野生型细胞培养36至50天（图。B类)伴随着细胞的突然缩短在此间隔期间的生成时间（图。A类; 表)，而在阿尔夫-更多出现空单元格在第28-35天之间快速进行（图。 A类和B类;表). 第19页阿尔夫蛋白质继续即使细胞生长较快，也会在野生型巨噬细胞中积聚出现（图。C类)后一种变异体增殖更多比缺乏两个p19的细胞慢阿尔夫和第16页墨水4a（表). 15 kDa的表达紧密联系的产品墨水4b基因是相似的在后期野生型和阿尔夫-空单元格，作为通过顺序免疫沉淀和印迹法测定（图。D类). 所有细胞群都积累了p53及其受体γ射线照射后转录目标Mdm2功能性野生型p53的保留（图。E类).因此，p16墨水4a表达被消除在传播过程中阿尔夫-null和野生型BM衍生巨噬细胞，而墨水4b编码区被保留并表示。
甲基化相关抑制墨水4a表达式BM-Derived巨噬细胞。
尽管最初观察到，p16墨水4a蛋白质在以后的传代中无法检测到野生型或阿尔夫-无巨噬细胞（图。A类). 类似地，Northern blot用110bp外显子1αcDNA探针进行的分析检测墨水4a但不是阿尔夫成绩单(12,35)透露没有墨水4amRNA在随后的时间（图。B类).因此，我们进行了甲基化特异性PCR分析亚硫酸氢修饰的基因组DNA(36). 虽然这三个墨水4a编码外显子包含一个CpG岛，只有甲基化外显子1α和5′启动子区在细胞系和肿瘤中的表达来源于人类和小鼠(41,42). 我们设计了寡核苷酸从5′端扩增a≈200-bp区包括75bp的引物近端启动子区域并延伸至外显子1α，如图。A类.我们首先使用了引物针对未修饰DNA，以确认外显子1α不是在已建立的细胞系中选择性删除。PCR扩增从所有晚传代巨噬细胞系中产生200-bp的产物，除了墨水4a-Arf-使BAC1.2F5单元为空（图。B类).用引物集分析亚硫酸氢盐修饰的基因组DNA用于区分甲基化和非甲基化DNA发现在每个早期传代细胞系中第16页墨水4a蛋白质是可检测的（图。B类和A类)，仅引物未甲基化DNA产生PCR产物（图。C类). 相反，稍后传代细胞缺乏p16墨水4a蛋白质（图。B类和A类)，产生PCR产物这几乎完全来自甲基化DNA的引物（图。C类). 因此，消除第16页墨水4a后期传代中的蛋白质产物巨噬细胞与外显子1α甲基化和转录抑制。
转录抑制墨水4a已建立骨髓源性巨噬细胞。(A类)巨噬细胞的裂解物在连续培养的不同时间后进行免疫印迹第16页墨水4aα-微管蛋白；三个独立的克隆野生型和阿尔夫-对空白细胞进行了研究。(B类)用RNA进行Northern blot分析从中描述的相同细胞的平行培养物中提取A类RNA与外显子1α探针特异性杂交对于墨水4a; 18S rRNA水平由亚甲基测定蓝色染色。
转录沉默和甲基化墨水4a在里面晚期传代巨噬细胞。(A类)外显子1α示意图5′近端启动子区指示感觉的位置用于扩增201-bp的（1→）和反义（←2）寡核苷酸BM-derived基因组DNA亚硫酸氢盐修饰后的产物巨噬细胞。(B类)未修饰基因组DNA的PCR分析从不同时间（培养天数）采集的巨噬细胞中含有已知p16细胞的DNA墨水4a状态（MEF克隆10阳性对照；BAC1.2F5，阴性对照）野生型基因序列。(C类)PCR分析亚硫酸氢钠修饰的DNA来自B类通过使用寡核苷酸区分非甲基化（U）和甲基化（M）序列。缺乏PCR反应模板（H2O） 用作阴性对照。几个比较每个基因型的独立衍生群体。
讨论
禁用Arf–Mdm2–p53监测路径就足以允许快速建立持续生长的MEF细胞系，而p16的破坏墨水4a–细胞周期蛋白D/Cdk–Rb信号通路不是先决条件。要评估是否阿尔夫不足可能足以产生除MEF外的永生化细胞类型，我们产生了原代培养物来自阿尔夫-使鼠标无效。就像这些动物的MEF一样，初级阿尔夫-空preB细胞在外植到文化，尽管第16页墨水4a蛋白质表达。阿尔夫-空前B细胞依赖IL-7生长和存活功能性p53，延长传代后保持二倍体，并显示核型异常的证据很少（数据未显示）。这些数据与前B细胞感染Abelson鼠白血病病毒可以选择永生克隆已经持续阿尔夫删除(19). 星形胶质细胞来源于缺少这两者的老鼠墨水4a和阿尔夫也是不朽的在文化上(43)我们对星形胶质细胞进行了类似的观察从缺乏的动物中移植阿尔夫独自一人（J.Alan Diehl和C.J.S.，未公布数据）。但是，来自阿尔夫-空白小鼠，如角质形成细胞、内皮细胞和事实证明，心肌细胞很难永垂不朽。因此，基因通过p19影响信号传导阿尔夫-独立的，独立的通路必须阻止各种细胞类型适应连续性文化成长。
根据对人类细胞的研究能够绕过这些其他细胞衰老的候选者细胞类型是Rb途径中的基因(三,4,8,27). 支持这个概念，BM衍生的CSF-1依赖性巨噬细胞阿尔夫-空白小鼠，尽管最初增殖速度更快与野生型细胞相比，自发产生的生长速度更快表现出与缺乏细胞相当的倍增倍数的种群二者都阿尔夫和墨水4a引人注目的是，这些后来通道阿尔夫-空巨噬细胞不再表达墨水4a信使核糖核酸，但继续产生相关的Cdk抑制剂，p15墨水4b，由一个基因座编码与墨水4a-Arf这些数据表明染色体DNA的缺失或重排在包含这两者的区域墨水4a-Arf和墨水4b和反而建议墨水4a被转录沉默。甲基化特异性PCR检测的使用(36)透露了p16的下调墨水4a后期表达传代细胞与第一代甲基化时间相关基因编码外显子和直接5′启动子序列墨水4a基因。像BAC1.2F5细胞，缺乏墨水4a-Arf基因座，与猴病毒40永生化的巨噬细胞不同，巨噬细胞群来源于阿尔夫-没有的空老鼠表达时间较长墨水4a保持二倍体并依赖于CSF-1用于培养过程中数月的生长和存活。
延迟数周后，快速增殖的变异在培养自正常骨髓。在早期传代时，这些细胞大量增殖比他们的同行慢阿尔夫-使鼠标无效。然而，在以后的传代中，甲基化和沉默墨水4a该基因再次与加速生长相关。这个后一种细胞继续表达p19阿尔夫和可以在培养基中再维持3个月它们生成时间的进一步变化，表明第16页墨水4a至少在一定程度上可以缓解Arf–Mdm2–p53通路突变的选择性压力。它目前尚不清楚这些种群是否来源于野生型巨噬细胞祖细胞已经完全建立，在这个意义上倍增时间仍然比不朽BAC1.2F5慢得多细胞或从两者都缺乏的动物移植的细胞墨水4a和阿尔夫迅速增长外植后。然而，显而易见的是墨水4a为持续巨噬细胞在培养中增殖。因此，它将是一些感兴趣的是确定小鼠骨髓源性巨噬细胞的行为保留阿尔夫和缺乏墨水4a独自一人。
转录抑制墨水4a与关联近端启动子和第一编码外显子的超甲基化以前有报道称其为端粒独立机制克服人类乳腺上皮细胞的早期衰老角质形成细胞(44,45). 尽管我们认为端粒非依赖性增殖障碍作为一个检查点对人工培养条件施加的压力的反应(三,4),p16的超甲基化墨水4a以多种形式出现人类癌症(46,47). 我们可以推测，在老鼠身上，以及在人类，失去墨水4a单独（保留阿尔夫)可以促进这些细胞中的肿瘤形成强烈依赖p16的类型墨水4a的函数检查点控制。对这种谱系特异性的更深入理解可能有助于解释原因墨水4a和阿尔夫是针对人类癌症的不同靶点。
